Cistanche zālaugu augu preparāta ietekme uz zālaugu augu preparāta Cistanche ietekmi uz in vitro N Vitro citokīnu ekspresiju ar žurku osteoblastiem

Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com

KOPSAVILKUMS

Osteoblastiem (OB) ir svarīga loma kaulu remodelācijā, osteoblastiem (OB) ir svarīga loma kaulu remodelācijā, izdalot citokīnus, piemēram, izdalot citokīnus, piemēram, osteoprotegerīnu (OOPG), kas ir kodolfaktora kappa-faktora receptoru aktivators. B ligands (RA PG), kodolfaktora kappa-B liganda NKL receptoru aktivators un osteopontīns (OPN). Mūsu pētījuma mērķis bija novērtēt ķīniešu augu ekstraktu ietekmi uzCistanche(Cistanche deserticola) par šo citokīnu ekspresiju in vitro žurku OB šūnu kultūrā. Primārie OB tika izolēti no žurkas galvaskausa ar tripsīna un kolagenāzes gremošanu. Šūnu fenotips tika noteikts ar Šveices krāsošanas metodi, sārmainās fosfatāzes krāsošanu, Von Kossa krāsošanu un Alizarīna sarkano krāsošanu. OPG, RANKL un OPN gēnu ekspresija tika analizēta ar kvantitatīvu reāllaika PCR. Visas apstrādes ar Cistanche zālaugu augu ekstraktiem palielināja OPG un RANKL gēnu ekspresiju pēc 72 kultivēšanas stundām, īpaši koncentrācijās 5 × 10-2 mg/ml, kas ievērojami atšķīrās no kontroles kultūrām. Ārstēšana ievērojami samazināja OPG / RANKL attiecības ekspresiju 48 stundās un OPN mRNS ekspresiju 72 stundās pēc kultivēšanas. OB iedarbība in vitro ar Cistanche augu preparātu veicināja OPG un RANKL gēnu ekspresiju un samazināja OPG / RANKL un OPN gēnu ekspresiju, un tādējādi varēja saglabāt kaulu veidošanās un rezorbcijas līdzsvaru kaulu metabolisma laikā.

Atslēgvārdi:Cistanche, osteoblasti, osteoprotegerīns, RANKL, osteopontīns, žurka

anti-osteoblasts:Cistanche garšaugs

Ievads

Kaulu stiprumu nosaka struktūra un sastāvs. Kaulu audi pielāgojas, lai pielāgotos dažādām slodzēm, modelējot augšanas fāzē un pārveidojot visu mūžu. Kaulu remodelācija samazinās līdz ar novecošanos, jo samazinās daudzšūnu pamatvienībā izveidotā kaula apjoms, samazinās dzimumhormonu deficīts un samazinās periosteālā kaula veidošanās (SEEMAN, 2008). Kaulu remodelācijas nelīdzsvarotība var izraisīt ar kauliem saistītas slimības, piemēram, osteoporozi un palielināt lūzumu risku.

Osteoporoze, kas izraisa lūzumus, sāpes un kustību traucējumus, skar miljoniem cilvēku Amerikas Savienotajās Valstīs (NAYAK et al., 2012; SILVERMAN, 2010). Galvenais process ar kauliem saistītu slimību izplatības novēršanā ir saglabāt kaulu remodelācijas spēju.

Kaulu remodelācija ir kaulu veidošanās un rezorbcijas dinamisks līdzsvars (SEEMAN un DELMAS, 2006). Šos procesus galvenokārt kontrolē osteoblasti (OB) un osteoklasti pieaugušo kaulos, kā arī citokīnu, augšanas faktoru un hormonu ekspresija (PARFITT, 2000). OB, kas iegūti no primārajām mezenhimālajām šūnām, atrodas uz kaula virsmas. OB ir atbildīgi par kaulu veidošanos un netieši ietekmē kaulu rezorbciju (MACKIE, 2003). Citokīni, ko ekspresē OB, piemēram, osteoprotegerīns (OPG), kodolfaktora kappa-B liganda (RANKL) receptoru aktivators un osteopontīns (OPN), var veicināt lūzumu dzīšanu un palielināt kaulu veidošanos osteoporozes gadījumā (LINKHART et al., 1996). . OB attīstība ir secīgs process, kas ietver osteoprogenitoru proliferāciju, matricas nobriešanu un šūnu mineralizāciju (GIUSTINA et al., 2008). Šo procesu regulē vairāki ar OB saistīti gēni, un tas ir ļoti saistīts ar kaulu veidošanās attīstību (HUNG et al., 2010). Osteogēnās mineralizācijas progresēšana stimulē kaulu veidošanos kaulu lūzumu dzīšanas laikā. Tādējādi pētījumi par osteogēno citokīnu ekspresiju un to ietekmi uz kaulu mineralizāciju ir būtiski, meklējot inovatīvu un efektīvu dabiskas izcelsmes terapeitisku līdzekli ar kauliem saistītu slimību profilaksei.

Tradicionālā ķīniešu medicīna ir izmantota tūkstošiem gadu ar kauliem saistītu slimību ārstēšanā. Zālaugs Cistanche, ko plaši izmanto nieru uzmundrināšanai un kaulu slimību terapijā, pieder pie Orobanchaceae dzimtas ģints. Ir ziņots, ka Cistanche sugu sastāvdaļas ir: feniletanoīdu glikozīdi (PhG), iridoīdi, lignāni, alditoli un oligosaharīdi (JIANG un TU, 2009; LI et al., 2010). Cistanche augi ir daudzgadīgi parazītu augi, kas galvenokārt aug tuksnesī vai uz neauglīgiem sāls laiziem, galvenokārt izplatīti sausos un siltos tuksnešos Ķīnas ziemeļrietumos. Tradicionālajā ķīniešu medicīnā Cistanche tiek uzskatīts par neparastu toniku un tiek nosaukts par "tuksneša žeņšeņu". Pētījums, kas veikts ar žurkām, kurām veikta olnīcu izņemšana (LIANG et al., 2011), parādīja, kaCistanche ekstraktiIekšķīgi lietojot, ievērojami palielināts kaulu minerālvielu blīvums un kaulu minerālvielu saturs atkarībā no devas. Tomēr detalizēti Cistanche iedarbības mehānismi uz kaulu veidošanos joprojām nav skaidri. Tāpēc šī pētījuma mērķis bija novērtēt Cistanche ietekmi uz OPG, RANKL un OPN citokīnu gēnu ekspresiju in vitro žurku OB šūnu kultūrās un novērtēt mehānismus, ar kuriem Cistanche veicina kaulu dzīšanu vai novērš/kontrolē. ar kauliem saistītas slimības.

Cistanche augs ar kauliem saistītu slimību profilaksei

materiāli un metodes

Žurku osteoblastu sagatavošana. Žurku OB tika sagatavoti no jaundzimušo žurku kalvārijām (<24 hours)="" and="" processed="" by="" the="" trypsin="" (sigma,="" usa)="" and="" collagenase="" ii（sigma,="" usa）digestion="" methods.="" the="" cells="" were="" cultured="" in="" dulbecco's="" modified="" eagle="" medium="" (dmem,="" gibco,="" usa)="" supplemented="" with="" 15="" %="" inactivated="" fetal="" calf="" serum,="" penicillin="" (100="" iu/ml),="" streptomycin="" (100="" iu/ml)="" and="" l-glutamine="" in="" 6="" well="" culture="" plates,="" and="" incubated="" at="" 37="" °="" c="" with="" 5="" %="" co2="" in="" the="" air.="" the="" cellular="" phenotype="" was="" determined="" by="" the="" swiss="" dyeing="" method,="" alkaline="" phosphatase="" staining,="" and="" von="" kossa="" and="" alizarin="" red="" dye="">

Cistanche ūdens ekstraktu sagatavošana sērijveida atšķaidījumos. Šajā pētījumā izmantotā Cistanche tika piegādāta no Tongrentang Pharmacy Ķīnā. Sausie Cistanche gabaliņi tika samalti pulverī. Cistanche šķidrie ekstrakti tika pagatavoti, 1 stundu atvārot 50 g augu pulvera. Pēc tam preparāts tika koncentrēts līdz 100 ml, izmantojot rotācijas iztvaicētāju, un filtrēts caur 0,22 mm filtriem. Filtrāts tika uzglabāts 4 grādu temperatūrā tumsā. Cistanche šķidrais ekstrakts tika atšķaidīts līdz sērijveida koncentrācijai no 5 × 10 -1 līdz 5 × 10-4 mg/mL ar DMEM šķidrumu.

RNS izolēšana un reversās transkripcijas PCR. Trešās kultivētās OB paaudzes tika apstrādātas ar dažādām Cistanche ekstraktu koncentrācijām 24, 48 un 72 stundas. OB šūnu kultūras apstrāde tika veikta trīs eksemplāros. Šūnas divas reizes mazgāja ar fosfātu buferētu fizioloģisko šķīdumu (PBS) un RNS tika izolēta no šūnām ar TransZol reaģentu (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.; Pekina, Ķīna) saskaņā ar ražotāja norādījumiem un ekstrahēja ar hloroformu, izgulsnējot ar izopropilu. spirtu, mazgā ar 75 procentu etilspirtu un pēc tam izšķīdina ūdenī. RNS (5 μL) reversā transkripcija tika veikta, izmantojot TransScript First-Strand cDNS Synthesis Supermix (Trans, Pekina, Ķīna).

Reāllaika PCR produktu apstiprināšana. Pēc elektroforēzes uz 1,5% agarozes gēla tika veikta DNS sekvencēšana, lai pierādītu, ka PCR produkti ir OPG, RANKL un OPN kodējošie gēnu segmenti žurku OB.

Plazmīdas izveide, kas satur mērķa gēnu. DNS sekvence 2 procentu agarozes gēlā tika attīrīta un iegūta ar EZNA gēla ekstrakciju (Kangweishiji, Ķīna) un pārnesta uz pEASY-T3 klonēšanas komplektu (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.; Pekina, Ķīna). Šūnu transformācija tika panākta, izmantojot konstruētu plazmīdu, kas satur mērķa gēnu. Pozitīvās kolonijas tika pārbaudītas ar zili balto plankumu skrīninga testu un pēc tam sekvencētas. Plazmīdas, kas ekstrahētas no pozitīvajām kolonijām, kas satur mērķa gēnu, tika proporcionāli atšķaidītas ar dejonizētu ūdeni, lai iegūtu standarta līkni. Kvantitatīvā reālā laika PCR (RTQ PCR). Specifiski praimeri tika konstruēti saskaņā ar publicētajām gēnu sekvencēm (NCBI, Nucleotide Database) un sintezēti ar Liuhe-Nuada Gene (Pekina, Ķīna), kā parādīts 1.

MRNS ekspresija paraugos tika kvantitatīvi noteikta, izmantojot iepriekš aprakstītās specifiskās plazmīdas standarta līknes. Produkti tika salīdzināti ar mājas uzturēšanas gēnu – aktīnu. Mērķa gēna daudzums tika noteikts ar RTQ PCR, izmantojot SYBR Green RealMaster Mix (TIANGEN, Ķīna) saskaņā ar ražotāja protokolu. PCR apstākļi bija šādi: 94 grādi 1 minūti, 58 grādi 30 sekundes, 68 grādi 1 minūti un tika atkārtoti 40 ciklus. Dati tika aprēķināti, izmantojot 7500 Real Time PCR sistēmu (Applied Biosystems; Waltham, MA, ASV).

Statistiskās analīzes. Dati tika apstrādāti ar vienvirziena ANOVA, izmantojot komerciālu statistikas programmatūru (SPSS 17.0, IBM Corporation; Armonk, NY, ASV). Rezultāti tika izteikti kā mērķa gēnu un aktīna attiecības vidējās ± standartnovirzes. Atšķirības tika uzskatītas par būtiskām P<0.05>

Cistanche herb ieguvums: novērš kaulu slimības

Rezultāti

Žurku OB identifikācija. OB tika identificēti ar īpašām šūnu krāsošanas metodēm, un tie tika fenotipiski parādīti, kā parādīts 1. attēlā. (A, B, C un D)

Mērķa gēnu apstiprināšana. Mērķa gēnu joslu izmēri tika analizēti 2 procentu agarozes gēlā, un tika konstatēts, ka tie atbilst paredzamajam izmēram (2. attēls).

Rezultāti, kas iegūti OPG, RANKL, OPN un -aktīna gēnu segmentiem, kas satur mērķa gēnu plazmīdu sekvences, tika salīdzināti ar atbilstošajām gēnu sekvencēm, kas iepriekš publicētas GENBANK, izmantojot BLAST-N analīzi, un tika konstatēts, ka: 100 procenti , 100 procenti , attiecīgi 100 procenti un 99 procenti identiski.

Cistanche šķidro ekstraktu ietekme uz OPG, RANKL un OPN izteiksmi. OPG mRNS līmenis tika pazemināts, kad OB tika pakļauti visām izmantotajām Cistanche koncentrācijām 24 stundas un 48 stundas (2. tabula).

Ievērojamas atšķirības tika novērotas pie koncentrācijām 5×10-1, 5×10-2 un 5×10-4 mg/mL pēc 24 stundām un koncentrācijās 5×10-1 un 5 ×10-2 mg/mL pēc 48 stundu kultivēšanas (P<0.05). however,="" when="" compared="" with="" control="" cultures,="" the="" expression="" of="" opg="" was="" significantly="" increased="" after="" treatment="" with="" cistanche="" for="" 72="" hours,="" cistanche="" concentrations="" of="" 5×10-2="" mg/ml="" and="" 5×10-3="" mg/ml="" had="" particularly="" increased="" opg="" expression=""><0.01). in="" contrast,="" the="" rankl="" mrna="" expression="" was="" down-regulated="" after="" 24="" hours="" with="" the="" concentration="" of="" 5×10-1="" mg/ml="" and="" 5×10-2="" mg/ml="" cistanche="" extracts="" compared="" to="" the="" controls.="" however,="" rankl="" mrna="" was="" up-regulated="" after="" culturing="" with="" cistanche="" extracts="" for="" 48="" hours="" and="" 72="" hours,="" especially="" the="" cistanche="" extract="" concentrations="" of="" 5×10-2="" mg/ml,="" 5×10-3="" mg/mland="" 5×10-4="" mg/ml="" (table="" 3).="" the="" rankl="" content="" continued="" to="" increase="" signifi="" cantly="" after="" 72="" hours="" of="">

Diskusija

Osteoblastiem (OB) ir būtiska loma ne tikai kaulu arhitektūras veidošanā, bet arī kalcija homeostāzē, regulējot osteoklastisko aktivitāti (MACKIE, 2003). Ir noteiktas kaulu slimības, kas saistītas ar OB funkciju vai disfunkciju, piemēram, osteoporoze. OB parādīšanās fenotipiskie marķieri galvenokārt ir to proliferācija un diferenciācija, un, otrkārt, kaulu mezgliņu mineralizācija (PAN et al., 2005). OPG un RANKL ir audzēja nekrozes faktora (TNF) citokīnu ģimenes locekļi, un tie ir no OB iegūti proteīni, kas ir būtiski kaulu masas regulēšanai un uzturēšanai (HUMPHREY et al., 2006; REINHOLZ et al., 2002). RANKL regulē osteoklastu diferenciāciju, aktivāciju un izdzīvošanu. RANKL var arī palielināt kaulu rezorbciju, mijiedarbojoties ar tā receptoriem uz osteoklastiskās membrānas (SODEK et al., 2000). OPG ir RANKL mānekļu receptors un neļauj RANKL saistīties ar tā receptoru (RANK). RANK/RANKL/OPG attiecības kontrolē līdzsvaru starp kaulu veidošanos un rezorbciju, regulējot OB un osteoklastu aktivitātes (SODEK et al., 2000; HUMPHREY et al., 2006; MAZZIOTI et al., 2012). Attiecīgi varēja secināt, ka samazināta OPG/RANKL attiecība var izraisīt kaulu rezorbciju, palielinot osteoklastu aktivāciju.

Šajā pētījumā visas apstrādes ar Cistanche zālaugu preparātiem palielināja gēna OPG un RANKL ekspresiju pēc 72 stundām, īpaši koncentrācijās 5×10-2 mg/mL un 5×10-3 mg/mL, kas bija ievērojami atšķiras no kontroles kultūrām.

Turpretim OPG ekspresija tika ievērojami samazināta pēc 24 un 48 stundu kultivēšanas ar Cistanche ekstraktiem. OPG/RANKL attiecības izteiksme tika ievērojami samazināta, kad OB tika ārstēti ar Cistanche 24 stundas un 48 stundas. Turklāt Cistanche ekstraktam nebija būtiskas ietekmes uz OB kultūrām pēc 72 stundu ilgas apstrādes. Mēs izvirzām hipotēzi, ka Cistanche šķidrie ekstrakti var uzlabot osteoklastu aktivāciju pēc 24 stundām un 48 stundām, izmantojot regulētu OPG / RANKL ekspresiju, bet tiem var nebūt nekādas ietekmes uz osteoklastu aktivāciju pēc 72 stundām. OPN ir vairākas funkcionālas atšķirības kaulu veidošanā un remodelācijā, kas saistītas ar OPN galvenajām lomām saimnieka aizsardzībā un audu atjaunošanā. Šķiet, ka OPN galvenā loma ir negatīvās atgriezeniskās saites regulēšana sistēmiskā līmenī, OB šūnu adhēzijas veicināšana, agrīnu kalcifikācijas notikumu indukcija, kā arī minerālu kristālu izmēra un formas kontrole (SODEK et al., 2000). Turklāt ir apstiprināts, ka OPN var būt tilta proteīns, palielināt artēriju stīvumu iekaisuma laikā un līdz ar to izraisīt locītavu bojājumus un palielināt kardiovaskulāro risku pacientiem ar reimatoīdo artrītu (BAZZICHI et al., 2009).

Mūsu pētījumā mēs parādījām, ka šķidrais Cistanche ekstrakts pazemināja OPN ekspresiju. OPN koncentrācijas samazināšanās tendence OB kultūrās, salīdzinot ar kontroles kultūrām, kas novērota 24 stundu un 48 stundu kultivēšanas laikā, un ievērojami zemāki līmeņi, kas reģistrēti pēc 72 stundām, liecina, ka Cistanche var uzlabot kaulu veidošanos, kā parādīts in vitro eksperimentā.

OB kultūru in vitro ekspozīcija Cistanche ievērojami veicināja OPG un RANKL gēnu ekspresiju pēc 72 stundām, samazināja OPG/RANKL gēnu ekspresiju pēc 24 stundām un 48 stundām un samazināja OPN ekspresiju pēc 72 stundu kultivēšanas.

TheCistanche garšaugsvienmēr tiek lietota kā recepte, kas sastāv no vairākiem ķīniešu augiem, tāpēc šajā pētījumā izmantotā Cistanche klīniskā efektivitāte un šķidrā ekstrakta sastāvdaļas ir sarežģītas un vēl nav skaidras. Mūsu pētījuma rezultāti parāda, ka Cistanche ekstrakts ietekmē OPG un RANKL ekspresiju, ja to lieto žurku OB šūnu kultūrā, bet ekspresijas līmenis mainās atkarībā no Cistanche ekstraktu koncentrācijas un kultivēšanas ilguma. Atbilstoša Cistanche deserticola šķidro ekstraktu koncentrācija kombinācijā ar atbilstošu žurku OB iedarbības ilgumu var saglabāt kaulu veidošanās un rezorbcijas līdzsvaru kaulu metabolisma laikā.

Ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai uzlabotu mūsu zināšanas par Cistanche bioaktīvajām sastāvdaļām un to koncentrāciju preparātos, lai tās varētu apstiprināt kā citokīnu modulatorus kaulu atjaunošanai un atjaunošanai.

cistanche papildinājums: novērš kaulu zudumu

Atsauces

BAZZICHI, L., L. GIADONI, A. ROSSI, M. BERNARDINI, M. LANZA, F. DE FEO, C. GIACOMELLI, I. MENCARONI, K. RAIMO, M. ROSSI, AM MAZZONE, S. TADDEI, S BOMBARDIERI (2009): Osteopontīns ir saistīts ar palielinātu artēriju stīvumu reimatoīdā artrīta gadījumā. Mol. Med. 15, 402-406.

GIUSTINA, A., G. MAZZIOTTI, E. CANALIS (2008): Augšanas hormons, insulīnam līdzīgi augšanas faktori un skelets. Endokr. Rev. 29, 535-559.

HUMPHREY, EL, JH WILLIAMS, MW DAVIE, MJ MARSHALL (2006): Disociēto glikokortikoīdu ietekme uz OPG un RANKL osteoblastiskajās šūnās. Kauls 38, 652-661.

HUNG, TY, TL CHEN, MH Liao, WP HO, DZ LIU, WC CHUANG, RM CHEN (2010): Drynaria fortunei J. Sm. veicina osteoblastu nobriešanu, izraisot ar diferenciāciju saistītu gēnu ekspresiju un aizsargājot pret oksidatīvā stresa izraisītiem apoptotiskiem apvainojumiem. J. Ethnopharmacol. 131, 70-77.

JIANG, Y., PF TU (2009): Cistanche sugu ķīmisko sastāvdaļu analīze. J. Chromatogr. A. 1216, 1970-1979.

LI, Y., Y. SONG, H. ZHANG (2010): Sasniegumi cistanche ķīmisko sastāvdaļu un ārstnieciskās aktivitātes izpētē. Ķīnas savvaļas augu resursi, 29, 7-11.

LIANG, H., F. YU, Z. TONG, Z. HUANG (2011): Cistanches Herba ūdens ekstrakta ietekme uz kaulu zudumu žurkām ar ovariektomiju. Int. J. Mol. Sci. 12, 5060-5069.

LINKHART, TA, S. MOHAN, DJ BAYLINK (1996): Augšanas faktori kaulu augšanai un atjaunošanai: IGF, TGF beta un BMP. Kauls 19, S1-S12.

MACKIE, EJ (2003): Osteoblasti: jaunas lomas skeleta arhitektūras orķestrēšanā. Int. J. Biochem. Cell Biol. 35, 1301-1305.

MAZZIOTTI, G., J. BILEZIKIAN, E. CANALIS, D. COCCHI, A. GIUSTINA (2012): Jauna izpratne un osteoporozes ārstēšanas metodes. Endokrīnās sistēmas 41, 58-69.

NAYAK, S., MS ROBERTS, SL GREENSPAN (2012): Vispārējo alendronāta izmaksu ietekme uz osteoporozes skrīninga un ārstēšanas izmaksu efektivitāti. PLoS ONE 7(3): e32879. doi:10.1371/journal.pone.0032879.

PAN, W., LD QUARLES, LH SONG, YH YU, C. JIAO, HB TANG, CH JIANG, H.

W. Deng, YJ LI, HH ZHOU, ZS XIAO (2005): Genisteīns stimulē osteoblastisko diferenciāciju, izmantojot NO/cGMP kaulu smadzeņu kultūrā. J. Cell Biochem. 94, 307-316.

PARFITT, AM (2000): Savienojuma mehānisms: asinsvadu loma. Kauls 26, 319-323. REINHOLZ, MM, SJ ITURRIA, JN INGLE, PC ROCHE (2002): diferenciālais gēns

TGF ģimenes locekļu un osteopontīna ekspresija krūts audzēja audu analīzē ar reālā laika kvantitatīvo PCR. Breast Cancer Res. Ārstēt. 74, 255-269.

SEEMAN, E. (2008): Kaulu kvalitāte: kaulu stiprības materiāls un strukturālais pamats. J. Kaulu kalnracis. Metab. 26, 1-8.

SEEMAN, E., PD DELMAS (2006): Kaulu kvalitāte — kaulu stiprības un trausluma materiāls un strukturālais pamats. N. Engl. J. Med. 354, 2250-2261.SILVERMAN, SL (2010): Osteoporozes terapija: pierādījumi no veselības aprūpes datu bāzēm un novērojumu populācijas pētījumiem. Calcif. Tissue Int. 87, 375-384.

SODEK, J., B. GANSS, MD MCKEE (2000): Osteopontīns. Krit. Oral Biol. Med. 11, 279- 303.