Perfūzijas spiediena ietekme uz podocītu zudumu izolētā perfūzijas peles nierē
Mar 13, 2022
Abstrakts
Priekšvēsture/mērķi: Podocīti tiek zaudēti lielākajā daļā glomerululāro slimību, kas izraisa glomerulosklerozi un progresējošunieru slimība. Parasti tiek pieņemts, ka podocīti ir pakļauti filtrēšanas plūsmai un tādējādi nozīmīgiem bīdes spēkiem, kas dzen to atdalīšanos no glomerulārās pagraba membrānas (GBM). Šajā kontekstā pēdu procesa izsmiešana ir ierosināta kā potenciāla adaptīva reakcija, lai palielinātu podocītu saķeri ar GBM. Metodes: Mēs esam pārbaudījuši šīs hipotēzes, izmantojot optisko klīringu un augstas izšķirtspējas 3-dimensiju morfometrisko analīzi izolētā perfūzijas purīnāniere.Mēs pētījām podocītu atslāņošanās dinamiku dažādos perfūzijas spiedienos (50, 300 un vairāk nekā 450 mmHg) veselām jaunām vai vecām pelēm (20 pret 71 nedēļas vecumu) vai pelēm, kurām injicēts anti-GBM serums, lai izraisītu globālā pēdu procesa izmiršanu. Rezultāti: Rezultāti liecina, ka veseli podocīti jaunām pelēm ir cieši saistīti ar GBM, un pat supramaximālais spiediens neizraisīja ievērojamu atdalīšanos. Salīdzinot ar jaunām pelēm, vecām pelēm un pelēm ar anti-GBM nefrītu un pēdu procesa izmiršanu, pakāpenisks progresējošs podocītu zudums bija noticis jau pirms perfūzijas. Augsts perfūzijas spiediens izraisīja salīdzinoši nelielu papildu podocītu zudumu vecām pelēm. Pelēm ar anti-GBM nefrītu šajā agrīnajā laika punktā radās ievērojams papildu podocītu zudums, palielinot perfūzijas spiedienu līdz 300 mmHg vai augstākam. Secinājums: Šis darbs sniedz pirmos eksperimentālos pierādījumus tam, ka podocīti ir ārkārtīgi rezistenti pret akūti paaugstinātu perfūzijas spiedienu izolētā ex vivoniereperfūzijas modelis. Tikai glomerulārās slimības gadījumā ievērojams skaits ievainoto podocītu atdalījās pēc akūta perfūzijas spiediena palielināšanās.
Atslēgvārdus:Glomerulārā hipertensija; Glomerulāra hiperfiltrācija; Mehāniskais spriegums; Progresija; Hroniska nieru slimība
CISTANCHE UZLABOS NIERU/NIERU SLIMĪBU
Ievads
Glomerulārā hipertensija un hiperfiltrācija bojā glomerulu, izraisot progresējošu glomerulu slimību. Tiek plaši uzskatīts, ka paaugstināts perfūzijas spiediens pakļauj tuftu paaugstinātam mehāniskam spriegumam, izaicinot podocītu saķeri ar glomerulārā pagraba membrānu (GBM), veicinot to atdalīšanos [1, 2]. Podocīti ir ļoti diferencētas, post-mitotiskas šūnas, kas ir būtiskas neskartai glomerulārai filtrēšanas barjerai. Podocītu zudums, visticamāk, ir dzīvotspējīgu šūnu atdalīšanās no GBM, nevis apoptozes vai nekrozes [3-6] rezultāts, jo ir bijis iespējams kultivēt podocītus, kas atgūti no pacientu urīna [4]. Dzīvotspējīgu podocītu atdalīšanos no GBM var izraisīt traucēti piestiprināšanas mehānismi vai altemehāniskie spēki. Traucēta pieķeršanās GBM var būt saistīta ar šūnu traumu vai samazinātu adhēzijas molekulu ekspresiju, un tā galvenokārt ir saistīta ar iekaisuma glomerulārām slimībām. Attiecībā uz mehāniskajiem spēkiem, kas attiecas uz podocītu, ir divi galvenie noteicošie faktori, proti, filtrācijas spiediens un filtrāta plūsma [7-9]. Filtrēšanas spiediens rada riņķveida sienas spriegumu un darbojas kā GBM traucējošs spēks. Transmurālā hidrostatiskā spiediena izmaiņas efektīvi kompensē GBM spēja darboties kā elastīga membrānai un izplesties vai sarukt virsmas laukumā [8, 10]. No otras puses, filtrāta plūsma pāri GBM rada tangenciālus spēkus uz podocītu virsmas, t.i., bīdes stresu. No in vitro pētījumiem mēs zinām, ka podocīti ir ļoti jutīgi pret bīdes stresu, kas atdalās no to substrāta, ja tie ir pakļauti bīdes spriegumiem, kas pārsniedz 0,025 Pa [11] un pieņem starpposma fenotipu, kas var palīdzēt viņiem neitralizēt no plūsmas atvasinātus spēkus [12]. Joprojām nav skaidrs, vai glomerulārā hipertensija ietekmē podocītus, paaugstinot filtrācijas spiedienu un / vai palielinot filtrāciju. Šajā pētījumā mēs sniedzam pirmo analīzi par podocītu spēju pretoties paaugstinātiem mehāniskiem spēkiem ex vivo modelī. Podocītu zudums tika kvantificēts ar augstu izšķirtspēju, izmantojot audu tīrīšanu un 3 dimensiju morfometrisko analīzi jaunām un veselām pelēm
Materiāli un metodes
Visi eksperimenti ar dzīvniekiem tika veikti saskaņā ar Vācijas dzīvnieku labturības likuma pamatnostādnēm, un tos apstiprināja Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen (Az 84-02.04). 2015.A469). Peles tika izmitinātas īpašā bezpatogēnu objektā ar brīvu piekļuvi čau un ūdenim un 12 stundu dienas/nakts ciklu. Audzēšana un genotipēšana tika veikta saskaņā ar standarta procedūrām. Pod-rtTA/LC1/R26R/H2BeGFP peles uz FVB/N ģenētiskā fona ir aprakstītas jau iepriekš [13]. Lai aktivizētu Pod-rtTA-eGFP transgēnu ekspresiju, peles saņēma doksiciklīnu caur dzeramo ūdeni ad libitum 7 dienas (2 g/l, 5% saharoze, pasargāta no gaismas), kam sekoja 1 nedēļas izskalošanās periods, kā norādīts iepriekšējos ziņojumos. Anti-GBM nefrītu izraisīja viena intraperitoneāla 5 mg/g ķermeņa masas nefrotoksiska seruma injekcija, kā aprakstīts iepriekš [14].
CISTANCHE UZLABOS NIERU/NIERU DARBĪBU
Nieru perfūzija
Izolētieniereperfūzijas modelis tika izmantots, kā aprakstīts citur [15]. Īsumā, peles tika narkotizētas ar intraperitoneālu ksilazīna/ketamīna injekciju (0,1 ml/10 g ķermeņa masas, i.p.), un pēc tam nieres tika perfūzētas ar kompleksu modificētu Krebs-Henseleit šķīdumu (1. tabula), kas papildināts ar 5% liellopu seruma albumīnu (ĶVL) 37 °C temperatūrā, lai atdarinātu fizioloģisko vidi eksperimenta laikā. Maksimālā vazodilatācijanierevaskulatūru izraisīja 1. verapamila subkutāna injekcija (50μl) tūlīt pēc anestēzijas indukcijas un 2. papaverīna pievienošana perfūzijas šķīdumam. Pēc sākotnējās perfūzijas 5 minūtes pie 50 mmHg, fluorescējoši marķēts lektīns (Communis I - RCA120; Vektoru laboratorijas: RL-1082; 4 μl 986 μl sāls šķīduma) tika injicēts, lai marķētu endotēlija šūnas.Nierestika perfūzēti vēl 5 minūtes ar modificēto Krebs-Henseleit šķīdumu ar 5% BSA. Pēc tam kreisienierekas kalpoja kā pāra kontrole katrā eksperimentā, tika noņemts pēc rūpīgas kreisās puses ligācijasNierutrauki, sagriezti šķēlītēs un tieši iegremdēti 3% paraformaldehīda (PFA) fosfātu buferšķīdumā (PBS). Tiesībasnieretika perfūzēts vai nu vēl 5 minūtes ar ātrumu 300 mmHg, vai ar supramaximālo spiedienu (>>300mmHg, tika lēsts, ka filtrācijas spiediens ir krietni virs 400 mmHg), ko lieto manuāli, kopējo tilpumu 50 ml perfūzijas šķīduma. GadaNierestika perfūzēti ar nemainīgu spiedienu 50 mmHg vai 300 mmHg, izmantojot spiediena kontrolētu sūkni (Universal Perfusion Systems UP-100, Hugo-Sachs Electronics, Vācija). Tad pa labinieretika noņemts, sagriezts 2 mm šķēlītēs un iegremdēts 3% paraformaldehīda (PFA) fosfātu buferšķīdumā (PBS).
3D attēlveidošana un skaitļošanas analīze PFA iegremdētanierešķēles tika inkubētas uz mehāniskā kratītāja 5 dienas istabas temperatūrā. Pēc tam fiksētos paraugus mazgāja 1x PBS un uz nakti istabas temperatūrā ievietoja mehāniskā kratītājā.Nierepēc tam šķēles tika ievietotas augstas kvalitātes 100% etanolā (Merck; 100983) uz 1 stundu istabas temperatūrā ar maigu kratīšanu (vismaz 1 maiņa uz svaigu etanolu), kam sekoja tieša iegremdēšana Ethyl Cinnamate (ECi) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; 112372) un tika atstātas uz nakti maigā kratītājā istabas temperatūrā gaismas aizsardzībā. Audu caurspīdīgums tika sasniegts mazāk nekā 1 stundas laikā. Vertikāliem mikroskopiem mēs izmantojām vienreizlietojamas iekšējās kameras, kā aprakstīts iepriekš [16]. Lielākā daļa eksperimentu tika veikti, izmantojot 2 fotonu mikroskopu (LaVision BioTec TriMScope, "Medizinische Fakultät RWTH Aachen, IZKF Aachen, Core Facilities). Fidži attēlveidošanas programmatūra tika izmantota, lai pārvietotos pa katras sērijas optisko sekciju kaudzes Z asi un izolētu atsevišķus glomerulus, izmantojot 3D apgriešanu [16]. 40 glomeruli uz vienuniere(analīzei tika atlasīti 20 subkortikāli un 20 juxtamedullary). Tādējādi kopumā šajā pētījumā tika analizēti 1200 glomeruli, lai iegūtu rezultātus ar pietiekamu precizitāti. Podocīti tika identificēti kā eGFP + šūnas. Kapilārā tilpuma, glomerulārā tilpuma, kā arī kodolu skaita (punktu) un tilpuma kvantificēšana tika veikta, izmantojot 3D renderēšanas un analīzes programmatūru (Imaris v9.1; Bitplane AG, Cīrihe, Šveice) Podocītu attālums no asinsvadu pola tika aprēķināts, izmantojot Bitplane XTension "Spot Closest. Attālums". Podocītu automatizēta kvantificēšana tika veikta, kā aprakstīts iepriekš [17]. Attēlu analīze tika veikta, izmantojot Imaris (Biplane AG Zurich, Šveice). Katru glomerulu noteica tā lektīna marķētais afferentais arteriols. 20 subkortikāli un 20 juxtamedullary (ko nosaka to attālums no kortikālās virsmas).
CISTANCHE UZLABOS NIERU/NIERU SĀPES
Gaismas mikroskopija & imunofluorescence
Gaismas mikroskopijai 4% buferēts formalīns fiksētsnierefragmenti tika dehidrēti, iestrādāti parafīnā un iekrāsoti ar periodisku skābi–šifu (PAS). Nenormālo/ievainoto glomerulu procentuālais daudzums tika aprēķināts, pamatojoties uz 50 reprezentatīvu glomerulāru šķērsgriezumu noteikšanu katrai pelei, kas izvēlēta sistemātiskas pastaigas laikā paNieruGarozā. Mūsu standarta imunofluorescences protokols [18] tika veikts uz 2 μm parafīna iegultām sekcijām. Tika izmantotas šādas antivielas: vistas poliklonālais anti-GFP (ab13970; Abcam), peļu monoklonālais anti-sinaptopodīns (sc-515842; Santakrusas biotehnoloģija), poliklonāls trušu pretpes p57 (sc-8298; Santa-Cruz Biotechnology), trušu poliklonālais anti-WT1 (sc-192; Santa-Cruz Biotechnology), Cy2 ēzeļa anti-vistas (703-225-155; Dianova, Hamburga, Vācija), Alexa Fluor546 kazas anti-pele IgG1(A-21123; Thermo Fischer), poliklonāls ēzeļa anti-trusis AF555 (A31572; Life Technologies, Karlsbāda, Kalifornija).
Elektronu mikroskopija
Nelieli garozas gabali tika fiksēti Karnovska šķīdumā un iestrādāti Eponā (Serva, Heidelberga, Vācija). Ultrathin sekcijas tika pārbaudītas ar transmisijas elektronmikroskopu ZEISS Leo 906 pie 60 kV ar palielinājumu no 3597-6000x. Paraugi tika mazgāti 0,1 M Soerensen fosfātā (Merck, Darmstadt, Vācija), kas pēc tam tika fiksēti 1% OsO 4 (Rota, Karlsrūe, Vācija) 17% saharozes buferšķīdumā (Merck, Darmstadt, Vācija) un dehidrēti ar augošu etanola sēriju (30, 50, 70, 90 un 100%) 10 minūtes katrs. Pēdējais solis tika atkārtots 3 reizes. Dehidrētie paraugi tika inkubēti propilēna oksīdā (Serva, Heidelberga, Vācija) 30 min, Epon sveķu (Serva, Heidelberga, Vācija) un propilēna oksīda (1:1) maisījumā 1h un visbeidzot tīrā Eponā 1h. Epon polimerizācija tika veikta 90 ° C temperatūrā 2h. Ultrathin sekcijas (70-100 nm) tika sagrieztas ar ultramikrotomu (Reichert Ultracut S, Leica ar dimanta nazi (Leica) un paņemtas uz Cu/Rh režģiem (HR23 Maxtaform, Plano, Wetzlar Germany). Kontrastu pastiprināja krāsošana ar 0,5% uranilacetāta un 1% svina citrāta (abi EMS, Minhene, Vācija). Paraugi tika apskatīti ar paātrinājuma spriegumu 60 kV, izmantojot Zeiss Leo 906 (Carl Zeiss, Oberkochen, Vācija) transmisijas elektronmikroskopu.
Statistiskā analīze
Statistiskā analīze tika veikta ar programmatūru GraphPad Prism v8. Visas vērtības tiek izteiktas kā līdzeklis ± SD. 2 grupu salīdzinājumam tika izmantots t-tests. Vairāku grupu salīdzinājums tika veikts, izmantojot dispersijas analīzi; pēc hokeja korekcija tika izmantota vairākiem salīdzinājumiem. Visi testi bija 2 asti, un statistiskā nozīmība tika definēta kā P<>
Rezultātus
Tika pētīta pusautomātiska metode podocītu skaita noteikšanai uz glomerulus Trīs grupas, t.i., veselas jaunas un vecas peles un peles ar anti-GBM glomerulonefrītu (♂: ♀ 1:1). Jaunas, veselas peles bija 15-21 nedēļu vecas, bet vecas (vecas) bija 74 nedēļas vecas. Globālā pēdu procesa izzušana tika izraisīta 14-20 nedēļu ol pelēm, veicot vienu anti-GBM seruma injekciju 3 dienas pirms izolētā perfūzijas iestatīšanasnieremodelis (1. att. A), kā iepriekš aprakstīts [19].
Lai noteiktu intrarenālā perfūzijas spiediena ietekmi uz podocītiem, tNierestika pakļauti dažādam perfūzijas spiedienam izolētajāniereperfūzijas modelis. Pirmkārt, abiNieresvienmēr tika perfūzēti pie 50 mmHg 5 min. Lai pārbaudītu, vai mūsu perfūzijas šķīdums saglabāja glomerulusa integritāti dzīvotspējīgajā nefiksētajāNieres, 2 peles tika perfūzētas ar nemainīgu spiedienu 100 mmHg 90 min. Perfūzija, urīna plūsma (25 μl/min/ gr ķermeņa svars), kā arī inulīna klīrenss (22 μl/min) visu laiku saglabājās stabila (1. att. – par visu papildmateriālu skatītwww.cellphysiolbiochem.com).Eksperimentālajām pelēm pēc sākotnējās perfūzijas pie 50 mmHg, pa kreisinieretika noņemts un kalpoja kā kontrole visos eksperimentos. Pēc tam atlikušajā labajā pusē tika piemērots nemainīgs spiediens 300 mmHg vai spiediens, kas ievērojami pārsniedza 300 mmHg (>>300 mmHg; supramaximālais filtrācijas spiediens aptuveni 450 – 500 mmHg)niere5 min. (1.B att.). Izolētajā perfūzētajāNieres, podocīti tika identificēti, izmantojot kodolmarķējumu ar eGFP-histone mūsu transgēnajās pelēs, kas ekspresē eGFP zem podocīna veicinātāja (eGFP:Pod-rtTA peles). Podocītu skaits tika kvantificēts, izmantojot šī in vivo metaboliskā marķējuma un 3D morfometrijas kombināciju (1.C attēls).
Podocītu zudums veselām un vecām pelēm
Veselas peles sākumā saturēja 87,46 ± 5,66 (SD) podocītus uz glomerulusu (i.e.at fizioloģisko perfūzijas spiedienu 50 mmHg) (2. att. A). Juxtamedullary glomeruli bija lielāki nekā tie, kas atrodas ārējā garozā (2. papildinājums), taču tas nebija saistīts ar lielākiem podocītu skaitļiem (87,0± 23,65 pret 90,1 ± 18,49, attiecīgi, Fib 2B). Ar dzimumu saistīto podocītu skaita atšķirības netika novērotas (skatīt zemāk). Jaunām pelēm nebija būtisku podocītu zudumu pie augstiem (300 mmHg) vai maksimālajiem (>>300 mmHg) perfūzijas spiedieniem (85,62 ± 10,83 un 81,98 ± attiecīgi 6,45 podocītiem uz glomerulusu) (1.A att.). PAS sekcijās viegls histoloģiskais čangvers īpaši novērots vecām pelēm (2.A att.), kas nebija atkarīgas no perfūzijas spiediena. Turklāt perfūzijas rezultātā bija redzama cauruļveida dilatācija un intersticiāla tūska. Cilvēkiem vecāks vecums (53 ± 10 gadi) ir bijis saistīts ar absolūtu un relatīvu podocītu izsīkumu [20]. Salīdzinot ar jaunām pelēm, mūsu pelēm, kas bija 72 nedēļas vecas, pētījuma sākumā bija ievērojami mazāks podocītu skaits uz glomerulusu (52,81 ± 13,8 SD), kas liecina, ka aptuveni 40% podocītu ir zaudēti. Perfūzija pie augsta vai maksimāla spiediena izraisīja tikai ļoti vieglu podocītu skaita samazināšanos (attiecīgi 48,65 ± 16,8 SD un 41,06 ± 17,7 SD). Ņemot vērā skaitīšanas metodes precizitāti (absolūtie podocītu skaitļi 40 glomerulos uz peli) [21], podocītu zudums par 7,9% un 22% pēc perfūzijas attiecīgi ar 300 vai >>300 mmHg, salīdzinot ar sākotnējo stāvokli, liecina, ka šis nelielais podocītu zuduma pieaugums ar augstāku spiedienu nav nejauša atrade. PAS sekcijās tika novērotas vieglas glomerulāras izmaiņas vecām pelēm pētījuma sākumā (mezangiāla ekspansija un neregulāra skleroze, 2.F attēls). A
Podocītu zudums pēc akūtas traumas
Anti-GBM serums tika piemērots jaunām veselām pelēm, lai izraisītu nozīmīgus un specifiskus podocītu ievainojumus. Ļoti agrīnā laika punktā (t.i., 3 dienas) pēc anti-GBM glomerulonefrīta indukcijas ģeneralizēts pēdu procesa izsmiekls tika novērots visos glomerulos ar transmisijas elektronu mikroskopiju (3. att. A-D). Izolētā perfūzijāNieresiegūts no šīm pelēm, pētījuma sākumā (t.i., perfūzija ar 50mmHg) podocītu skaits uz glomerulus tika samazināts par 20%, salīdzinot ar kontroles reizēm (attiecīgi 69,76 ± 7,07 pret 87,46 ± 5,66) (3.E att.). Perfūzija ar augstāku spiedienu (300 un >>300 mmHg) izraisīja ievērojamu turpmāku podocītu skaita samazināšanos uz glomerulusu (attiecīgi par 50,84 ± 7,82 un 53,18 ± 4,26), t.i., par 27% un 24% papildu samazinājumu (3.E att.). Analizējot atsevišķus glomerulus, anti-GBM peles, perfūzija ar >>300 mmHg izraisīja vairāk nekā 80% podocītu zudumu mazākumā glomerulu (3.E att.). Tas atbilst anti- GBM slimības modeļa fokusa raksturam. Juxtamedullary glomeruli gadījumā podocītu zudums bija izteiktāks, salīdzinot ar subkortikālajiem glomeruliem (attiecīgi 56,66 ± 16,9 un 47,35 ± 17,07) (3.F att.)
Ar transmisijas elektronu mikroskopiju (TEM) pēc augstiem perfūzijas spiedieniem tika novērotas specifiskas izmaiņas, jo īpaši fokusa podocītu atdalīšanās no GBM un attīrītas pagraba membrānas (att.3D). Šūnu gruveši atradās kapilāros, kā arī Bowman telpā (>>300 mmHg); endotēlijs neuzrādīja būtiskas izmaiņas. PAS krāsošana identificēja cauruļveida paplašināšanos. Trīs dienas pēc anti-GBM seruma injekcijas vēl nebija izveidojušies pusmēness bojājumi (3G-I att.). Tēviņiem bija lielāka podocītu zuduma pakāpe, salīdzinot ar mātītēm (63,71 ± 2,11 vs 75,81 ± 3,83 podocīti uz glomerulus), kas atbilst novērojumam, ka mal pelēm ir jutīgākas pret anti-GBM imūnserumu un slimības gaitā veidojas vairāk šūnu pusmēness (3.J att.). Tomēr papildu podocītu zudums pēc augsta perfūzijas spiediena vīriešiem un mātītēm bija līdzīgs (3J att.).
3. zīm. Podocītu zudums pēc akūtas traumas. (A-B) Transmisijas elektronu mikroskopija no vadības ierīcesniereper- kausēts zemā spiedienā un pēc supramaximālā spiediena (>>300 mmHg) parāda normālu pēdu procesa arhitektūru. (C-D) Transmisijas elektronu mikroskopija atklāj tipisku pēdu procesa izsvīduma atradumu pēc anti-GBM seruma injekcijas pētījuma sākumā. Pēc perfūzijas ar augstāku spiedienu tika novērotas denuded pagraba membrānas vietas. (E) kopējais podocītu skaits uz peli pret GBM vērstām pelēm pētījuma sākumā un zem augstāka (300 mmHg) vai supramaximālā spiediena (>> 300 mmHg); (katrs aplis apzīmē 1 nieri; n=7 kontroles nieres ar 50mmHg, n=8 anti-GBM nieres ar 50mmHg, n=4 nieres ar 300 mmHg vai >> 300mmHg). F) kopējais podocītu skaits uz glomerulu juxtamedullary un subcortical glomeruli; katrs aplis apzīmē 1 subkortikālu glomerulu (n= 20 glomeruli pro peli), un katrs trijstūris apzīmē 1 juxtamedullary glomerulus (n= 20 glomeruli pro mouse). (G-I) Anti-GBM peļu histoloģiskā iekrāsošanās sākotnēji identificēja olbaltumvielu lējumus, bet trīs dienas pēc anti-GBM seruma injekcijas nebija konstatējamus pusmēness bojājumus. Pēc perfūzijas ar augstāku spiedienu tika novērota kanāliņu intersticiāla dilatācija un tūska. J) kopējais podocītu skaits uz vienu peli starp tēviņiem un mātītēm; katrs aplis apzīmē 1 nieri (n=4 kontrolēt nieres ar 50mmHg, n=4 anti-GBM nieres ar 50mmHg, n=2 nieres ar 300 mmHg vai >> 300mmHg). Vairākiem salīdzinājumiem ANOVA. P<0.0001, ***p ="">< 0,0001,=""><0.01,><0.05 and="" ns="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="">
Zudušo podocītu izsekošana kanāliņos
eGFP+ podocīti tika regulāri novēroti proksimālo kanāliņu lūmenā, kur tie, šķiet, piestiprinājās pie proksimālo kanāliņu šūnu otas robežas (4.A att.). Šie podocīti netika nomazgāti hiperperfūzānieres, tā vietā viņi diezgan cieši pielipa pie sukas robežas, lai izturētu primārā urīna ārkārtas plūsmu pie ļoti augsta perfūzijas spiediena. Lai apstiprinātu savu identitāti, podocīti tika iekrāsoti ar podocītiem specifiskiem marķieriem (t.i., p57, sinaptopodīnu un WT-1) papildus ģenētisko ciltsrakstu izsekošanas marķierim kodola eGFP (4.B att.). Podocītu skaits bija ievērojami zemāks tajos glomerulos ar pielipušiem podocītiem saistītajā proksimālajā kanāliņā, un podocītu klātbūtne kanāliņos, kas apgriezti korelēja ar podocītu skaitu uz glomerulusu (4. att. C).
Preferenciāls podocītu zudums perihilar atrašanās vietā
Visbeidzot, mēs pētījām, vai podocītu zudums, ko izraisa akūts perfūzijas spiediena pieaugums, var rasties glomerulusa preferenciālās vietās (t.i., pie asinsvadu pola pret glomerulārā tufta cauruļveida polu). Lai analizētu podocītu atdalīšanās telpisko sadalījumu, asinsvadu pols tika atzīmēts katrā glomerulusā (iegūts 3D formātā), pamatojoties uz lektīna signālu, un katra podocīta attālums no asinsvadu pola tika noteikts pusautomātiski. Atsevišķie attālumi no asinsvadu pola tika sadalīti kvartilēs (4.E att.). Kā attēlots 4.E attēlā, lielākā daļa podocītu sakopoti 2 vidējās kvartilēs (t.i., kvartilē 2 un 3). Mazāk nekā 12 % podocītu lokalizēti vai nu pirmajā, t.i., asinsvadu polā, vai ceturtajā kvartilē, t.i., vistālāk no asinsvadu pola. Perfūzijas laikā ar spiedienu >> 300 mmHg, jaunām un veselām pelēm netika novērotas būtiskas izmaiņas podocītu spaciālajā sadalījumā. Vecām pelēm podocītu attālumi no asinsvadu pola parasti tika palielināti, visticamāk, atspoguļojot glomerulāru hipertrofiju, savukārt hiperperfūzija izraisīja preferenciālu podocītu atdalīšanos tuvu asinsvadu polam (1. kvartile samazinājās no 11,5 līdz 4,9% vecām pelēm, 4.E attēls). Tāpat preferenciāla podocītu atdalīšanās asinsvadu pola tuvumā tika novērota effaced podocītiem (anti-GBM, 1. kvartile samazināta no 25 līdz 5%).
Diskusija
Šajā pētījumā mēs pārbaudījām paaugstināta filtrācijas spiediena un filtrēšanas plūsmas akūto ietekmi uz podocītu zudumu izolētajā perfūzētajā purīna nierē, izmantojot pašlaik visprecīzāko metodi podocītu skaita noteikšanai. Pirmais lielais mūsu pētījuma atklājums bija tāds, ka veseli podocīti nav jutīgi pret akūtu bīdes stresu in vivo, kā to iepriekš ieteica šūnu kultūras pētījumi [11]. Mums par pārsteigumu, pat ārkārtējs suprafizioloģiskais spiediens (vairāk nekā 450 mmHg) neizraisīja ievērojamu podocītu atdalīšanos. Drīzāk transmisijas elektronu mikroskopija atklāja, ka visi trīs filtrēšanas barjeras slāņi palika salīdzinoši labi saglabāti. Vecākām pelēm bija samazināts podocītu skaits (kā ziņots iepriekš), un tas bija saistīts tikai ar ļoti ierobežotu paaugstinātu jutību pret augstu perfūzijas spiedienu. Otrs lielākais atklājums bija tāds, ka iepriekšējie podocītu ievainojumi padarīja podocītus jutīgus pret atdalīšanos pie augsta perfūzijas spiediena. Anti-GBM pelēm trīs dienas pēc anti-GBM imūnseruma injekcijas uzrādīja globālu pēdu procesu izzušanu un ievērojamu skaitu, kas atdalījās pie augsta perfūzijas spiediena. Vecām pelēm mēs hipotēzējam, ka podocītu fizioloģija ir salīdzinoši labi saglabājusies, padarot tās mazāk jutīgas pret atdalīšanos. Izmantojot daļēji automatizētu skaitīšanas pieeju, katrs glomeruluss tika analizēts atsevišķi (kopā analizēti 1200 glomeruli). Mēs apstiprinājām, ka juxtamedullary glomeruli ir lielāks tilpums nekā subkortikālajiem glomeruliem. Interesanti, ka podocītu skaits bija vienāds, parādot, ka podocītu blīvums ir samazināts juxtamedullary glomeruli. Turklāt juxtamedullary glomeruli bija arī neaizsargātāki pret paaugstinātu filtrācijas spiedienu, salīdzinot ar subkortikālajiem glomeruliem. Šie atklājumi daļēji varētu izskaidrot, kāpēc FSGS bojājumus var novērot biežāk tik lielākos glomerulos [22, 23].
4. zīm. Podocītu noteikšana blakus esošajā proksis. (A) Reprezentatīvs attēls, kurā redzami eGFP+ podocīti (zaļi) kanāliņos. B) Imunfluorescences iekrāsošana no podocītiem, kas apzīmēti ar transgēno histonu eGFP (zaļo), un endogēnajiem podocītu marķieriem p57 (sarkans), wt-1 (sarkans) un sinaptopodīnu (violetu). C) Podocītu skaita vienā glomerulusā saistība ar tubulā identificēto podocītu skaitu (n=81 glomeruls no kontroles pelēm, n= 41 glomeruls no vecām pelēm un n= 81 glomeruls no pelēm pret GBM). Vairākiem salīdzinājumiem tika izmantota ANOVA. P<0.0001,>< 0.01="" and="" ns="not" statistically="" significant;="" error="" bars="" represent="" means="" ±="" sd;="" in="" the="" graph,="" each="" circle="" represents="" 1="" podocyte;="" (d)="" schematic="" showing="" how="" the="" distance="" of="" podocytes="" from="" vascular="" pole="" was="" calculated.="" (e)="" distances="" of="" individual="" podocytes="" from="" the="" vascular="" pole.="" the="" individual="" distances="" from="" the="" vascular="" pole="" were="" separated="" into="">
Šī pētījuma ierobežojums ir īsais novērošanas periods, jo nevar izdarīt secinājumus par podocītu ilgtermiņa pielāgošanos paaugstinātam filtrācijas spiedienam. Ir ierosināts, ka pirmā reakcija uz podocītiem, kas pakļauti bīdes spriegumam, ir veikt aizsargājošas strukturālas izmaiņas [8, 24]. Šīs izmaiņas ietver filtrācijas spraugu (t.i., FPE) zudumu un spraugas diafragmu nomaiņu ar okludējošiem vai stingriem savienojumiem. Okludējošie krustojumi iepriekš aprakstīti vairākos glomerulāru slimību modeļos [25-28]. Tomēr mūsu pētījumā mēs novērojām, ka podocīti ar FPE bija jutīgāki pret lielāku perfūziju = spiedienu. Tādējādi mūsu rezultāti parādīja, ka šīs adaptīvās izmaiņas nebija pietiekamas, lai aizsargātu pret atdalīšanos vai, iespējams, pat pretējo, ka tās padara podocītus jutīgākus pret atdalīšanos. Tālāk var apgalvot, ka izolētais perfūzsnierenav fizioloģiska sistēma un ka piemērotais spiediens bija daudz lielāks nekā in vivo apstākļos. Cik mums zināms, neviens cits modelis, kas izmantotu neskartu dzīvotspējīgunierepastāv, kas ļautu tieši izpētīt paaugstināta perfūzijas spiediena ietekmi. Uzstādot vazodilatatorus pirms perfūzijas un tās laikā, pirmsglomerulu tvertņu maksimāla dilatācija, kas inducēta, lai nodrošinātu neierobežotu plūsmu (hiperfiltrāciju) un palielinātu perfūzijas spiedienu maksimālu transmisiju glomerulusā. Šajā pētījumā tika pētīta augstāka perfūzijas spiediena akūtā ietekme. Patoloģiskās hiperperfūzijas ilgtermiņa ietekme varētu būt kaitīgāka, izraisot vēl lielāku podocītu zudumu. Tomēr mūsu pētījums liecina, ka šo hronisko podocītu zudumu nevirza milzīgais filtrēšanas plūsmas spēks pats par sevi, bet gan (mal-)adaptīvās izmaiņas podocītos, kas samazina to pielipšanu GBM. Pacienti ar glomerulārām slimībām gūst labumu no antihipertensīvas ārstēšanas, novēršot (mal-)adaptīvas strukturālas izmaiņas podocītos.
Secinājums
Šis darbs sniedz pirmos in vivo pierādījumus tam, ka veseli podocīti ir ārkārtīgi stingri piesaistīti GBM veselās peles nierēs un var izturēt pat ļoti augstu perfūzijas spiedienu. Novecošana vai pat izteiktāks akūts podocītu ievainojums ar globālu izsmieklu padara podocītus jutīgus pret atdalīšanos pie paaugstināta perfūzijas spiediena.