Olīvu veģetācijas ūdens fenola savienojumu izmantošana broileru cāļiem: ietekme uz zarnu mikrobiotu un krūšu fileju glabāšanas laiku 3. daļa

Lūdzu sazinietiesoscar.xiao@wecistanche.comlai iegūtu vairāk informācijas

2.7. Lipīdu oksidēšana

Lipīdu oksidācija tika pētīta, mērot sekundāro (TBAR) un primāro (D232 un D270)oksidēšanāssavienojumi (7. tabula). Starp trim eksperimentālajām grupām netika novērotas būtiskas atšķirības, lai gan ir vērts atzīmēt, ka L2 grupas cāļiem bija neliels TBAR vērtību pieaugums, salīdzinot ar L1 un L0 grupām, savukārt D232. parādīja pretēju tendenci. Šie divi analītiskie rādītāji bija būtiski savstarpēji saistīti (TBAR pret D232 r=-0.5,p<0.001 and="" tbars="" vs.="" d270r=""><0.05). the="" cooking="" treatment="" caused="" decreases="" in="" the="" primary="" oxidation="" products=""><0.01), which="" were="" followed="" by="" increases="" in="" the="" secondary="" ones="" (p=""><0.001). no="" interactions="" between="" diet="" and="" cooking="" were="" observed.="" on="" the="" contrary,="" [31]and="" [45]="" observed="" a="" significant="" reduction="" in="" tbars="" in="" the="" breasts="" from="" chickens="" whose="" diets="" were="" supplemented="" with="" either="" olive="" cake="" or="" omww.="" similarly,="" [46]="" observed="" a="" reduction="" in="" tbars="" in="" the="" quadriceps="" femoris="" of="" chickens="" whose="" diets="" were="" enriched="" with="" omww="" permeate="" and="" the="">

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

Oke et al. [16] pievienoja dažādu daudzumu olīvu lapu ekstrakta (5, 10 un 15 ml/litrā) dzeramajam ūdenim, ko piegādāja Abor acre celma broileriem, novērojot būtisku ietekmi uz malondialdehīda (MDA) līmeņa pazemināšanos asinīs. Ibrahims et al. [42], novēroja ievērojamu MDA koncentrācijas samazināšanos vistas krūtiņā, kas iegūta, pievienojot diētu ar pieaugošu fermentētu vai fermentatīvi raudzētu žāvētu olīvu izspaidu līmeni. Atšķirībā no citiem pētījumiem, šajā gadījumā netika novērota aizsargājoša iedarbība pret muskuļu tauku oksidāciju muskuļu audos. Ir daudzi faktori, kas rada mainīgumu un atšķirības starp pētījumiem. Neatkarīgi no dzīvnieku šķirnes un nobarošanas perioda ilguma citi faktori, piemēram, barības uzturvielu sastāvs, barības uzņemšana, vides temperatūra kopā ar citiem stresa apstākļiem var radīt ļoti atšķirīgus rezultātus, kurus bieži ir grūti salīdzināt. Nebeidzams ir matricas veids, ar kuru uzturs ir bagātināts ar fenoliem (olīvu kūka, olīvu izspaidas, olīvu lapu ekstrakts, veģetatīvā ūdens ekstrakts, tikai daži no tiem), pateicoties aktīvo vielu koncentrācijai un papildu vielu klātbūtnei. ar sinerģisku vai aizsargājošu darbību, kas atrodas tajā pašā matricā, var būtiski ietekmēt antioksidantu darbību gan in vivo, gan gaļas audos pēc kaušanas [47]. Iespējamie ieguvumi veselībai no antioksidantu piedevu integrēšanas svaigā gaļā un gaļas produktos ne vienmēr ir pierādīti [48]. Gluži pretēji, daudzi primārie un sekundārie lipīdu un olbaltumvielu oksidācijas savienojumi, piemēram,hidroperoksīdi, epoksīdi,4-hidroksinonenāls, malonaldehīdstiek atzīti par potenciāliem kancerogēniem vai var ietekmēt šūnu signālu pārraidi, kā tas ir karbonilsavienojumu gadījumā [49]. Svaigas gaļas gadījumā iespēja palielināt antioksidantu potenciālu, veicot dzīvnieku normēšanu, ir ļoti ierosinoša perspektīva, jo īpaši, izmantojot dabiskas, nevis sintētiskas vielas. Faktiski atšķirībā no gaļas produktiem, kur tehnoloģija piedāvā dažādas iejaukšanās iespējas, lai palielinātu antioksidantu potenciālu, svaigā gaļā vienīgā alternatīva intervencei ar dzīvnieku barību ir apstrāde, kas vērsta uz produkta virsmu, kas tomēr ir saskaņā ar spēkā esošajiem tiesību aktiem. Šī pētījuma krūts gaļā izmērītais fenolu atlikuma daudzums, visticamāk, neradīs tiešus ieguvumus veselībai, bet netieši var. Piemēram, gaļas vārīšana izraisa audu antioksidantu aizsardzības neto zudumu, līdz ar to gaļas audu bagātināšanās ar savienojumiem, kas joprojām ir aktīvi arī pēc termiskās apstrādes, kā tas notiekfenoli, ir liela pielietojuma interese, ņemot vērā paša produkta glabāšanas laika un drošības palielināšanos. Iemesls, kāpēc barošanas izmēģinājuma ar MPK rezultātā netika novēroti efekti ne video, ne bijušajā video, ir pelnījis turpmākus eksperimentālus pētījumus, īpaši attiecībā uz mijiedarbību starpuztura polifenoliun vistas zarnu mikrobiota, uz kuru tā izmanto ievērojamu daļu no fenolu iespējamās bioķīmiskās iedarbības [9, 10].

3. Materiāli un metodes 3.1. Eksperimentālās iekārtas

Izmēģinājums tika veikts Padovas Universitātes Eksperimentālās fermas mājputnu mājā (Legnaro, Padova, Itālija) pēc 6 mēnešu dīkstāves. Putnu novietne bija aprīkota ar dzesēšanas sistēmu, piespiedu ventilāciju, starojuma apkuri un regulējamu apgaismojuma sistēmu. Kopā tika izmantotas 12 stiepļu tīkla pildspalvas (2,5 × 2,4 m; 6 m2), katra aprīkota ar pieciem nipeļu dzirdinātājiem (attālums: 20 cm) un apļveida padevēju (diametrs: 30 cm) manuālai barības sadalei. Katrai pildspalvai bija betona grīda, kas klāta ar skūšanās pakaišiem (dziļums 5 cm, 2,5 kg/m).

Pirmās 2 dienas pēc cāļu ierašanās mājputnu novietnē gaisma tika nodrošināta 24 stundas diennaktī. Pēc tam gaismas stundu skaits tika pakāpeniski samazināts, līdz tika sasniegts 18L:6D fotoperiods, kas pēc tam tika saglabāts no 12 dienu vecuma.

Cistanche var uzlabot imunitāti

3.2. Dzīvnieki, eksperimentālās grupas un in vivo ieraksti

Pētījumu apstiprināja Padovas Universitātes Eksperimentu ar dzīvniekiem ētikas komiteja (Organismo per la Protezione del Benessere Animale; OPBA) (projekts 17/2016; Nr. 154392, 2016. gada 10. maijs). Ar visiem dzīvniekiem rīkojās saskaņā ar principiem. Direktīvas 2010/63/ES[50] par eksperimentāliem un citiem zinātniskiem mērķiem izmantoto dzīvnieku aizsardzību. Pētnieki, kas bija iesaistīti dzīvnieku apstrādē, bija vai nu dzīvnieku speciālisti (PhD vai maģistra grāds dzīvnieku zinātnē) un/vai praktizējoši veterinārārsti.

Kopā 144 1-dienu veci cāļi (Ross 308) tika piegādāti ar kravas automašīnu saskaņā ar Padomes Regulu (EK) Nr. 1/2005 [51] universitātes eksperimentālajās telpās. Visi cāļi inkubatorā bija vakcinēti pret Mareka slimību, infekciozo bronhītu un Ņūkāslas slimību. Cāļi tika individuāli nosvērti to ierašanās dienā, identificēti pēc kāju zīmes un nejauši sadalīti starp 12 aizgaldiem (12 putni katrā aizgaldā un 10 putni/m²）,un pēc tam svēra reizi nedēļā, lai izmērītu dzīvsvaru līdz komerciālai nokaušanai. Pildspalvveida pilnšļirces patēriņš tika mērīts katru dienu izmēģinājuma laikā. Izmēģinājuma laikā tika lietotas trīs komerciālas diētas drupinātu veidā (Martini SpA Longiano, Forli-Cesena, Itālija): diēta P1 no 0 līdz 23 d, diēta P2 no 24 līdz 37 d un diēta P3 no 38 d līdz. kaušana pēc 48 dienām (skatīt Papildu materiālus analītiskajiem datiem, S1 tabulu). Neapstrādāts fenola koncentrāts (CPC) tika iegūts, kā aprakstīts [12], īsumā, OVW tika apstrādāti, izmantojot fermentus ar pektināzes un hemicelulozes aktivitātēm, un pēc tam tika pakļauti mikrofiltrācijai, ultrafiltrācijai un reversajai osmozei. CPC pievienoja diētām šādi:( i)L0 Kontroles diēta (P3), (ii)L1 kontroles diēta plus MPK (220 mg/kg barības kā teorētiskais kopējais fenolu daudzums), (i) L2 kontroles diēta plus MPK (440 mg/kg barības kā teorētisks kopējais fenolu daudzums). Atsevišķu CPC fenola savienojumu un diētu faktiskais saturs tika ziņots S2 tabulā. Katra diēta tika atkārtota četrās pildspalvās (viendabīga sākotnējam dzīvsvaram un mainīgumam). CPC tika piegādāts no 24 dienu (d) vecuma līdz komerciālai nokaušanai 48 dienās (skatīt Papildu materiālu par CPC fenola sastāvu). Visi dzīvnieki tika baroti ad libitum visā izmēģinājuma laikā, un papildinātās diētas tika sagatavotas katru nedēļu.

Lai noteiktu zarnu mikrobu kopienas sastāvu, tika savākti kloākas uztriepes (4 dzīvnieki uz aizgaldu) 23, 34 un 44 dienu vecumā kopā no 12 dzīvniekiem (4 uz katras diētas), kuri tika pārbaudīti trīs reizes (36 uztriepes). paraugi, kas savākti kopā).

3.3. Komerciāla kaušana un liemeņu un gaļas kvalitātes reģistrēšana

48 dienu vecumā pēc barības un ūdens izņemšanas (attiecīgi 7 un 2 stundas) visi cāļi tika nokauti komerciālā kautuvē. Vistas pirms kastes ievietošanas tika nosvērtas atsevišķi. Visas cāļus no aizgalda ievietoja transportēšanas būrī (augstums, 62,5 cm × 160 cm × 25,0 cm; grīdas platība, 1 m²）. Iekraušana un transportēšana no eksperimentālajām iekārtām uz komerciālo kautuvi un novietni pirms kaušanas ilga aptuveni 3 stundas. Vistas tika nokautas saskaņā ar komerciālās kautuves standarta praksi. Liemeņi tika savākti pēc 2 stundu ilgas atdzesēšanas 2 grādu temperatūrā un atsevišķi nosvērti, lai noteiktu kaušanas pārsēju procentuālo daudzumu [52].

Divdesmit četras stundas pēc kaušanas liemeņi tika sadalīti, lai iegūtu krūšu muskuļus, kas atdalīti no krūtīm [53].

Izmēģinājuma laikā tika reģistrēti 17,4 procentu zaudējumi (25 cāļi) mirstības dēļ. No 119 liemeņiem 72 liemeņiem tika veiktas mikrobioloģiskās analīzes derīguma termiņa laikā (2.4. sadaļā ir izskaidrota krūšu mikrobiotas sastāva noteikšana ar no kultūras atkarīgām un neatkarīgām metodēm), bet pārējie 47 tika sasaldēti (-40 grāds ) un pēc tam izmanto, lai novērtētu jēlas un termiski apstrādātas gaļas aptuveno sastāvu un lipīdu oksidācijas ātrumu (3.5. punkts).

3.4.Uzglabāšanas laika novērtējums

3.4.1.Iesaiņotas vistas krūtiņas sagatavošana

P galvenie muskuļi tika atsevišķi iesaiņoti zema blīvuma polietilēna paplātēs, kas ietītas 12 μm biezā PVC plēvē.（Veigels,KOEX412,Gruppo Fabbri,Vignola,Modena,Itālija)un glabāts 4±1 grādā .ledusskapī (Majolo" Plus 100 Seasoning Con-troller, Majolo, Cadoneghe, Padova, Itālija). Gaismas iedarbība tika fiksēta no plkst. 8:00 līdz 20:00, izmantojot 36 W dienasgaismas spuldzi [54]. Glabāšanas iestatījumi tika izstrādāti, lai atdarinātu saldēšanas apstākļus pārdošanas laikā. Iepakojumi tika izlases veidā ņemti 24,72,120, 180, 216 un 264 stundu attālumā no kaušanas datums

3.4.2. Sensorā analīze

Svaigu krūšu maņu novērtējums tika veikts saskaņā ar [37], izmantojot trūkumu 3-punktu vērtēšanas sistēmu (1=nav pieņemams,2=pieņemams, 3=laba kvalitāte). Sintētiskais sensorais indekss (SI) tika aprēķināts kā [(2 × smakas rādītājs plus 2 × krāsu rādītājs plus 1 × tekstūras rādītājs)/5], ar punktu skaitu 1, 8, kas darbojās kā slieksnis bojāto paraugu noteikšanai. Sensoro analīzi veica astoņi apmācīti panelisti.

3.4.3. Krūts gaļas mikrobioloģiskā analīze derīguma termiņa laikā

Mikrobioloģiskās analīzes tika veiktas saskaņā ar [38] aprakstītajām procedūrām. Krūškurvja galvenie muskuļi (apmēram 2 cm gari × 1 cm dziļi × 2 cm plati) tika aseptiski izgriezti gar katru krūti, lai iegūtu reprezentatīvu paraugu – 25 par katru krūti. Paraugus sajauca Stomacher maisā ar 225 ml buferēta peptona ūdens un analizēja pēc atbilstošiem atšķaidījumiem. DNS ekstrakcijai 1 ml katra homogenāta tika savākti 2 ml Eppendorf mēģenēs un centrifugēti ar ātrumu 13 500 × g 1 minūti (Eppendorf centrifuge 5425, Hamburga, Vācija). Pēc tam supernatants tika izmests un granula tika sasaldēta -80 grādos. Tika pētīti vairāki mikrobu mērķi, lai aprakstītu mikrobu populācijas dinamiku glabāšanas laika periodā šādi: Kopējais dzīvotspējīgo skaits (TVC) un kopējais psihotrofiskais skaits (TPC) tika novērtēts uz Plate Count agara (Biokar Diagnostics, Beauvais, Francija). , un plāksnes inkubēja 30 grādos 72 stundas vai 4 grādos 10 dienas. Enterobacteriaceae tika uzskaitītas ar violeto sarkano žults glikozes agaru (Biokar Diagnostics, Bovē, Francija) 37 grādu temperatūrā 24 stundas. Pienskābes baktērijas (LAB) tika analizētas uz De Man, Rogosa un Sharpe Agar (Biokar Diagnostics, Beauvais, Francija) anaerobos apstākļos 30 grādu temperatūrā 48 stundas. Pseudomonas spp. skaits tika novērtēts uz Pseudomonas Agar Base, kas papildināts ar cetrimīdu, fucidīnu un cefaloridīnu 25 grādu temperatūrā 48 stundas (Oxoid Ltd., Basingstoke, Hempshire, UK). H2S ražojošo baktēriju (iespējamo Shewanella spp.) skaitīšana tika veikta uz dzelzs agara (Lyngby, Laboratorios Conda, Torrejon de Ardoz, Spānija) 25 grādu temperatūrā 48 stundas. Rezultāti ir norādīti kā log10 KVV/g gaļas.

3.4.4.pH un pilienu zudums

pH metrs (Portamess 910, Knick, Berlīne, Vācija), kas aprīkots ar īpašu elektrodu (Mettler Toledo, Milāna, Itālija), tika izmantots, lai izmērītu pH vērtības, ievietojot to lielajos krūšu muskuļos trīs eksemplāros to ventrālajā pusē. Pilienu zudumi tika novērtēti saskaņā ar [55] piedāvāto metodi, izmantojot maisa metodi. Apmēram 2,5 cm šķēles, kas izgrieztas no muguras krūšu virsmas, tika ievietotas polietilēna maisiņos un uz nakti tika suspendētas 2±1 °C temperatūrā. Pilienu zudums (procenti) tika aprēķināts, izmantojot šādu vienādojumu: [(sākotnējais svars - galīgais svars)/sākotnējais svars. ].

3.4.5. Fenola koncentrācija uzturā un krūšu muskuļos

Fenolu ekstrakcija tika veikta ar 5 g malta uztura parauga, kas sajaukts ar 50 ml metanola/ūdens (80/20(o/o) šķīdums, kas satur 20 mg/l butilētā hidroksitoluola (BHT), maisījums). tika homogenizēts, izmantojot stieņu disperģētāju (IKA, T50 Ultra-Turrax, Werke, Staufen, Vācija) 1 min pie 7000 apgr./min, centrifugēts ar ātrumu 9327 × g 10 minūtes un supernatants tika reģenerēts. Procedūra tika atkārtota divas reizes un savāktais ekstrakts pēc tam tika koncentrēts ar rotācijas iztvaicētāju (Buchi Rotavapor, R-210, Šveice), līdz tika sasniegts galīgais tilpums 20 ml. SPE Bond Elut Jr-C18,1 g kasetnes (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ASV ), iepriekš aktivizēts ar 10 ml metanola un 10 ml ūdens, tika uzpildīts ar 1 ml ūdens ekstrakta, eluēšana tika veikta ar 50 ml metanola. Pēc šķīdinātāja noņemšanas vakuumā fenola ekstrakts tika izšķīdināts 1 ml šķīduma sastāv no metanola/ūdens (50:50 v/v) un filtrēts caur polivinilidēnfluorīda (PVDF) šļirces filtru (0,2 mm). ekstrakta fenola savienojumu kvalitatīvā un kvantitatīvā analīze tika veikta saskaņā ar [31].

HPLC (Mod. 1100 Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ASV), kas aprīkots ar C18 kolonnu (Spherisorb ODS-1(250 mm × 4,6 mm) 5 um daļiņu izmērs, piegādā Waters SpA (Milāna, Itālija) Fenola savienojumi tika noteikti, izmantojot DAD, kas iestatīts pie 280 nm. Polifenolu kvantitatīvā noteikšana tika noteikta, izmantojot atsevišķas kalibrēšanas līknes katram savienojumam, un rezultāti ir izteikti kā mg kg-1. Hidroksitirozols (3,{{ 10}}DHPEA) tika iegūts no Cabru SpA (Milāna, Itālija), tirozols p-HPEA tika iegādāts no Merck Life Science Srl (Milāna, Itālija), un verbaskozīds tika iegūts no Extrasynthese (Genay, Francija). dekarboksimetiloleuropeīna aglikons (3,4-DHPEA-EDA) tika ekstrahēts no neapstrādātas olīveļļas saskaņā ar procedūru, kas aprakstīta no [56].

Kopumā 10 gramus gaļas sajauca ar 50 ml metanola un ūdens（80/20,o/ø）kas satur skudrskābi {{0}},2 procentus un 20 mg/l BHT. Šķīdumu homogenizēja, izmantojot stieņu disperģētāju (IKA, T50 Ultra-Turrax, Werke, Staufen, Vācija) 1 minūti pie 7000 apgr./min, centrifugēja ar ātrumu 4146 × g 10 minūtes, un supernatants tika atgūts. Darbību atkārtoja divas reizes, un divas ekstrakta alikvotas tika savāktas un metanols tika noņemts ar rotācijas iztvaicētāju (Buchi Rotavapor, R-210, Šveice). Divdesmit ml ūdens ekstrakta tika ievietoti SPE Bond Elut HF Mega BE-C18,5g kārtridžos (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ASV), kas iepriekš tika aktivizēti ar 20 ml metanola un 20 ml ūdens; eluēšana tika veikta ar 50 ml metanola. Pēc šķīdinātāja noņemšanas vakuumā fenola ekstrakts tika reģenerēts ar 0,5 ml šķīduma, kas sastāvēja no metanola/ūdens.（50∶50 o/ø）un filtrē caur polivinilidēnfluorīdu（PVDF）šļirces filtrs (0,2 mm). Fenola ekstraktu HPLC analīzes tika veiktas saskaņā ar [56], izmantojot to pašu aprīkojumu, kā minēts iepriekš. Hidroksitirozols tika noteikts, izmantojot fluorescences detektoru (FLD), kas darbojās ar ierosmes viļņa garumu 280 nm un emisiju 313 nm. Hidroksitirosola kvantitatīvā noteikšana tika veikta, izmantojot kalibrēšanas līkni, un rezultāti ir izteikti kā ug/kg.

3.5. Aptuvenais sastāvs, gatavošanas zudumi un taukskābju analīze

Aptuvenais sastāvs, taukskābju profils un oksidatīvā stabilitāte tika novērtēta gan neapstrādātiem (labajā pusē P. major), gan termiski apstrādātiem (kreisajā pusē P. maijor) paraugiem. Pēc atkausēšanas gatavošanas zudumi tika novērtēti saskaņā ar [53] ar šādām modifikācijām: katras krūtiņas kreisā puse tika nosvērta, iepakota vakuumā un vārīta ūdens vannā 80 grādu temperatūrā 45 minūtes. Pēc tam krūtis tika atdzesētas līdz 4 grādiem un turētas ledusskapī (4 grādi) 72 stundas pirms izpakošanas un vēlreiz nosvērtas, lai aprēķinātu gatavošanas zudumus kā [(jēlgaļas svars, termiski apstrādātas gaļas svars)/jēlas gaļas svars. ]×100). Muskuļi, gan neapstrādāti, gan termiski apstrādāti, tika smalki samalti (divreiz 2500 apgr./min. × 10 s, Retsch, Diseldorfa, Vācija) un tika pakļauti mitruma, kopproteīna un pelnu analīzei [57], savukārt koptauku saturu noteica, izmantojot uzrādīto metodi. autors [58]. Īsumā, 200 ml dihlormetāna/metanola 1:1 maisījuma pievienoja 5 g parauga, homogenizēja ar ātrumu 11,000/min 1 minūti (Ultraturrax T25 Basic, Ika Werke. Staufen, Vācija) un inkubēja plkst. 60 C cepeškrāsnī (PID sistēma, M120-VF, MPN instrumenti, Bernaggio, MB, Itālija) 20 min. Pēc tam tika pievienoti vēl 100 ml dihlormetāna, un pēc homogenizācijas (11,000/min 1 min.) paraugs tika filtrēts (ātrais filtrpapīrs) un permeātam tika pievienots 100 ml KCl 1 M. Pēc centrifugēšanas (AvantiJ-E, Beckman Coulter, Brea, CA, ASV) pie 1000 × g 30 m 4 grādos, supernatants tika izvadīts un organiskais ekstrakts tika filtrēts caur bezūdens nātrija sulfātu. Alikvota daļa (apmēram 10 g) tika izmantota tauku procentuālās daļas gravimetriskai noteikšanai, atlikusī daļa tika destilēta (Rotavapor"R-210, Büchi, Essen, Vācija), un tālākai analīzei tika izmantoti bezūdens tauki. Taukskābes metilesterus (FAME) pagatavoja, nosverot 0,015 g bezūdens tauku stikla mēģenē ar skrūvējamu vāciņu [39], kas tika izšķīdināta ar 1 ml 3 M metanola HCl (Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, ASV) un inkubēja 2 stundas 60 grādu temperatūrā. Pēc tam pievienoja 1 ml dejonizēta ūdens un,pēc sajaukšanas,FAME tika iegūti 1 ml n-heksāna. FAME（1 μL）tika analizēti ar gāzu hromatogrāfu (Shimadzu Italia Srl, modelis 2014, Milāna, Itālija), kas aprīkots ar liesmas jonizācijas detektoru (iestatīts uz 250 grādiem) un dalītu inžektoru (iestatīts 280 grādi). Termiskā kamera, kurā tika turēta kapilārā kolonna (Supelco SP-2560; 100 m × 0, 25 mm × 0, 2 um), tika turēta 60 grādu temperatūrā 8 minūtes. Pēc tam temperatūru paaugstināja līdz 120 grādiem uz 1 minūti ar ātrumu 10 grādi/min, un pēc tam no 120 līdz 240 grādiem ar ātrumu 2,5 grādi C/min. Galīgā izoterma tika turēta 240 grādu temperatūrā 20 minūtes. Taukskābes tika identificētas, izmantojot ārēju standarta maisījumu (37 Component FAME Mix, Supelco, Vācija). Analīzes tika veiktas divos eksemplāros.

3.6. Lipīdu oksidēšana

Primārie oksidācijas savienojumi tika noteikti kā konjugētie diēni ar spektrofotometrisko analīzi ultravioletajā laukā, izmantojot Padomes Regulas EU/2015/1833 [59] pielikumā norādītās metodes modificēto versiju. Īsumā, 0.01 ± 0,001 g bezūdens tauku tika nosvērts 10 ml mērkolbā un izšķīdināts ar spektrofotometriskās kvalitātes cikloheksānu līdz atzīmei. Lai noteiktu specifiskās ekstinkcijas vērtības pie 232 (konjugētie diēni) un 270 nm (konjugētie triēni), tika izmantots UV/Vis spektrofotometrs (Mod. 7800 Jasco UV/VIS, Oklahoma City, OK, ASV), izmantojot to pašu šķīdinātāju kā atsauce. Sekundārie lipīdu oksidācijas produkti tika noteikti saskaņā ar [60] piedāvāto metodi ar modifikācijām: centrifūgas mēģenē 8 ml 5 procentu (m/v) trihloretiķskābes un 5 ml n-heksāna ūdens šķīduma. tika pievienoti aptuveni 2 g homogenizētā parauga. Pēc homogenizācijas ar Ultraturrax 30s lielā ātrumā. paraugu centrifugēja 3 minūtes pie 3000 × g 4 °C temperatūrā (Eppendorf 5810R; Eppendorf, Hamburga, Vācija), un supernatants tika noņemts. Paraugu filtrēja caur ātrā papīra filtru, un 2,5 ml filtrāta pievienoja 2,5 ml 0,02 M tiobarbitūrskābes ūdens šķīduma un inkubēja 35 minūtes 95 ° C temperatūrā termostatētā vannā (darba ED{{31} }; Zīlbaha, Bādene-Virtemberga, Vācija). Pēc atdzesēšanas absorbcija tika ņemta, izmantojot spektrofotometru, kas iestatīts uz viļņa garumu 532 nm. Dati ir izteikti malondialdehīda miligramos uz kilogramu gaļas. Mērījumi tika veikti divos eksemplāros gan vārītām, gan neapstrādātām vistas krūtiņām.

3.7.DNS ekstrakcija un NGS bibliotēkas sagatavošana

DNS tika ekstrahēta, izmantojot DNeasy PowerSoil DNS izolācijas komplektu (Qiagen, Hilden, Vācija). Krūts gaļas homogenētās granulas tika atkausētas ar 600 uL līzes buferšķīduma, ko nodrošināja komplekts. Kloākas uztriepes tika sagrieztas ar sterilām šķērēm, ievietotas mikromēģenē, kas satur 600 uL līzes buferšķīduma un 6 ul 2- merkaptoetanola (Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, ASV). Caurules tika labi sajauktas, izmantojot virpuļošanu 5 minūtes, un tamponi tika noņemti. Gan kloākas paraugiem, gan krūšu gaļas granulām tika pievienoti 100 mg sterilu 0,1 mm lodīšu (BioSpec, Bartlesville, OK, ASV), un tika izmantotas lodīšu dzirnavas (TissueLyser, Qiagen, Hilden, Vācija), lai veiktu darbības traucējumus. ātrgaitas kratīšanas soļi (2 × 30 s pie 30 Hz). Kopā tika pievienoti 40 ul proteināzes K (Qiagen, Hilden, Vācija) un inkubēti 56 grādos 90 minūtes. Pēc šīs darbības tika ievēroti DNeasy PowerSoil9DNA izolācijas komplekta ražotāja norādījumi. DNS koncentrācija un tīrība tika analizēta, izmantojot spektrofotometru (NanoDrop ND-1000, Thermo Scientific, Waltham, MA, ASV).

Lai izveidotu 16S DNS bibliotēku, tika izmantota divu pakāpju amplifikācijas pieeja. Paraugi tika pastiprināti 20-μL reakcijās,katrs sastāv no 5 μL atšķaidītas DNS,{{0}},4 uM katra praimera (1. tabula), 0,25 mM dezoksinukleotīda (dNTP), 1 × Phusion HF buferšķīdums un 1 U Phusion augstas precizitātes DNS polimerāze (New England BioLabs, Inc., Ipswich , MA, ASV). PCR tika veikta 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, ASV) ar 25 cikliem 95 grādu 30 s, 60 grādi vai 49 ° C 30 s, 72 ° C 45 s. un pēdējo pagarinājumu. 7 minūtes 72 grādos. Katram paraugam tika veikti trīs PCR atkārtojumi.

Produkti tika attīrīti, izmantojot SPRIselect attīrīšanas komplektu (Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolisa, IN, ASV), un pēc lodīšu attīrīšanas mērķa josla tika apstiprināta, izmantojot 1,8 procentu agarozes gelu. Svītrkodi tika ieviesti ar otro PCR analīzi ar platformai specifiskiem svītrkodu nesošajiem primeriem. Katra 50-uL PCR reakcija saturēja PCR produktu, 0.2 μM katra praimera（1. tabula）,0.3 mMdNTP,1 × Phusion HFbuffer,and1UPhusion augstas precizitātes DNS polimerāze. Tika veikti desmit iepriekš aprakstītā PCR profila cikli.

PCR produkti tika attīrīti, izmantojot SPRIselect attīrīšanas komplektu (Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolisa, IN, ASV). Pēc galīgās attīrīšanas katrs paraugs tika kvantificēts, izmantojot Qubit 2.0 Fluorometru (Invitrogen, Life Technologies, Monza, Itālija). Amplikona bibliotēkas kvalitāte tika pārbaudīta, izmantojot Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, ASV). Bibliotēkas tika sekvencētas, izmantojot Illumina MiSeq platformu ar pāra gala 300-ciklu (Macrogen Inc., Seula, Koreja).

4. Secinājumi

Cāļu barības bagātināšana ar fenoliem, kas iegūti, filtrējot un koncentrējot eļļas dzirnavu veģetācijas ūdeni 24 dienas, nebija saistīta ar atšķirībām dzīvnieku augšanā, barības konversijas ātrumā vai liemeņa iznākumā. Zarnu mikrobiotas pētījums parādīja būtisku barošanas laika, bet ne uztura ietekmi uz mikrobu grupu maiņu. No otras puses, gaļas mikrobiotas sastāvs glabāšanas laikā uzrādīja lielāku Pseudomonas augšanu cāļu paraugos, kas patērēja ar fenoliem bagātinātu barību. Visbeidzot, atšķirības starp diētām netika novērotas attiecībā uz lipīdu oksidācijas procesa analītiskajiem marķieriem (TBAR un konjugētajiem diēniem). Tā vietā tika identificēts hidroksitirozols to cāļu paraugu muskuļu audos, kuri patērēja barību ar pievienotiem fenoliem, parādot no devas atkarīgu uzsūkšanos zarnās. Tā kā oksidatīvais process galvenokārt notiek muskuļu šūnu membrānas struktūrā, ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai labāk izprastu HT izplatību šūnu un ārpusšūnu nodalījumos.

Šis raksts ir izvilkts no Molecules 2021, 26, 4307. https://doi.org/10.3390/molecules26144307 https://www.mdpi.com/journal/molecules