Cistanche Deserticola kā estrogēnu receptoru adjuvanta glikozīdu estrogēnā aktivitāte in vitro

IEVADS

Cistanche deserticola(ķīniešu valodā "Rou Cong Rong"), tradicionāla ķīniešu ārstniecības augu medicīna, kas pirmo reizi tika ierakstītaShenNongBenCaoJing, ir izmantots nieru mazspējas, impotences, senils aizcietējumu un asins trūkuma ārstēšanai jau tūkstošiem gadu.[1] Tas galvenokārt tiek izplatīts Ķīnas ziemeļrietumu tuksneša reģionos, piemēram, Gansu un Siņdzjanā.[2]Mūsdienu farmakoloģijas pētījumi parādīja, ka C. deserticola var veicināt plašas medicīniskas funkcijas, piemēram, hormonu regulēšanu, imūnmodulējošu, antioksidantu, neiroprotektīvu, pretiekaisuma un pretiekaisuma līdzekli.estrogēna aktivitāte.[3,4] Cistanču glikozīdi(GC) tika uzskatītas par vienu no galvenajām aktīvajām sastāvdaļām ar dažādu bioloģisku iedarbību.

Estrogēnu receptori (ER) un ER ir ER apakštipi, kas varētu regulēt fizioloģiskās funkcijas.[7] Šie proteīni varētu regulēt mērķa gēnu transkripciju, saistoties ar saistītajām DNS regulējošajām sekvencēm šūnu kodolā. Abi apakštipi ir izteikti izteikti sirds un asinsvadu un centrālajā nervu sistēmā.[8,9] ER galvenokārt pastāv piena dziedzeros, dzemdē, olnīcās, kaulos, vīriešu reproduktīvajā orgānā un prostatā. ER galvenokārt atrodas prostatā, olnīcās un urīnpūslī.[10,11] Turklāt abiem apakštipiem ir dažas kopīgas fizioloģiskas lomas, piemēram, olnīcu attīstībā un darbībā, kā arī sirds un asinsvadu sistēmas aizsardzībā.[10,11] 12,13] Iepriekšējie pētījumi mūsu grupā atklāja GC estrogēnu līdzīgu mehānismu, izmantojot metabolomiskās analīzes metodi.[14] Nepārtrauktā pētījumā mēs analizējām GC estrogēnās aktivitātes mehānismu MCF-7 šūnu līnijās, kas saistītas ar ER.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UZLABOŠANAIESTROGĒNĀ AKTIVITĀTEPHGS75% ECH 30% ACT 12%

MATERIĀLI UN METODES

Instrumenti

ECO-170P-230 inkubators bija no New Brunswick Scientific (China) Co., Ltd., Bio-Rad 680 mikroplašu lasītājs un elektroforēzes aparāts bija no Bio-Rad Laboratories, Inc., mikroskops CX21 bija no Olympus Co., Ltd., GIS-2019 gēla attēlveidošanas sistēma bija no Tanon Science and Technology Co., Ltd., plakanā apakšējā plāksne bija no Corning Inc., EPICS-XL plūsmas citometrija bija no Beckman-Coulter Inc., un StepOnePlus Real-Time polimerāzes ķēdes reakcija ( PCR) sistēma bija no Thermo Fisher Scientific.

Ķīmiskās vielas un reaģenti

GC tika sagatavoti mūsu laboratorijā saskaņā ar iepriekš aprakstīto metodi [14], un ar ultravioleto spektrofotometriju tika noteikts, ka GC tīrība ir 52% (akteozīds tika izmantots kā marķieris GC noteikšanai). Estradiols (E2) tika iegādāts no Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Šanhaja, Ķīna). Liellopu augļa serums (FBS) un RPMI-1640 bija no Gibco Co., Ltd., 96 iedobju plakanā dibena plāksne bija no Corning Inc., un dimetilsulfoksīds (DMSO) un 3-[4,5-dimetil-2-tiazolils ]-2,5-difeniltetrazolija bromīds (MTT) tika iegādāts no Sigma-Aldrich Corporation. TRIzol reaģents, reversās transkripcijas (RT) komplekts un TB Green™ RT-PCR komplekts tika iegādāti no TaKaRa Co., Ltd., Dalian, Ķīna. Anti-ER Rabbit pAb, anti-ER Rabbit pAb un aktīna antivielas tika iegādātas no Wanlei Biotechnology Co., Ltd. Visas pārējās izplatītās ķīmiskās vielas tika iegādātas no standarta komerciāliem piegādātājiem.

Parauga sagatavošana

Cistanches izejas šķīduma glikozīdu sagatavošana

GC ekstrakts tika izšķīdināts DMSO, lai pagatavotu izejas šķīdumu ar koncentrāciju 0,1051 g/ml un uzglabāts 4 grādu temperatūrā. Fenolsarkano nesaturošais RPMI-1640 tika izmantots, lai pirms lietošanas izejas šķīdumu atšķaidītu dažādās koncentrācijās.

Estradiola izejas šķīduma pagatavošana

E2 ekstrakts tika izšķīdināts DMSO, lai pagatavotu izejas šķīdumu ar koncentrāciju 0,27 mg/ml un uzglabāts 4 grādu temperatūrā. Fenolsarkano nesaturošais RPMI-1640 tika izmantots, lai pirms lietošanas izejas šķīdumu atšķaidītu dažādās koncentrācijās.

Ar kokogles dekstrānu apstrādāta liellopu augļa seruma sagatavošana

Simts mililitri FBS tika sajaukti ar 250 mg aktīvās ogles pulvera un 25 mg dekstrāna. Pēc 45 minūšu inkubācijas 55 grādu temperatūrā maisījumu centrifugēja 4 grādu temperatūrā, 1000 apgr./min 15 minūtes. Supernatants tika filtrēts, izmantojot Millipore Express PES membrānu, lai iegūtu ar kokogles dekstrānu apstrādātu (CDT)-FBS, un uzglabāts -20 grādu temperatūrā.

Šūnu kultūra

Cilvēka krūts vēža MCF-7 šūnu līnijas tika iegūtas no Amerikas tipa kultūras kolekcijas (ATCC). Turklāt šūnas tika kultivētas ar RPMI-1640 barotni, kas satur 10% FBS un 1% penicilīna-streptomicīna 37 grādu temperatūrā mitrinātā 5% CO2 atmosfērā. Šūnas 4 dienas pirms MTT testa tika kultivētas fenolsarkano nesaturošā RPMI-1640 barotnē, kas satur 5% CDT-FBS, lai šūnās estrogēns varētu tikt iztīrīts.

Estradiola šūnu proliferācijas analīze MCF{0}} šūnu līnijās

Šūnu proliferācija tika mērīta, izmantojot MTT testu MCF-7 šūnām.[15,16] E2 tika izšķīdināts RPMI-1640 barotnē, kas satur 0,1% DMSO pie galīgās koncentrācijas {{27 }}.1, 1, 10, 100 un 1000 nM. MCF-7 šūnu līnijas 4 dienas tika kultivētas RPMI-1640 barotnē, kas nesatur fenolu. Pēc trīs reizes mazgāšanas ar fosfātu buferētu fizioloģisko šķīdumu (PBS) 100 µl FBS nesaturošas RPMI-1640 barotnes pievienoja 96 iedobju plāksnēm ar 1,5 × 104 katrā iedobē un inkubēja 37 grādu temperatūrā 24 stundas. Pēc tam šūnas 72 stundas apstrādāja ar dažādām E2 šķīduma koncentrācijām. Pēc tam katrai iedobei pievienoja 100 µL MTT šķīduma (0,5 mg/ml). Šūnas tika inkubētas 4 stundas. Visbeidzot, lai izšķīdinātu formazāna kristālus, pievienoja 150 µL DMSO. Absorbcija tika mērīta pie 570 nm ar mikroplašu lasītāju, un tika aprēķināts proliferācijas ātrums (PR).

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA SEKSUĀLĀS FUNKCIJAS UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Cistanches glikozīdu šūnu proliferācijas analīze MCF-7 šūnu līnijās

Šūnu proliferācija tika mērīta, izmantojot MTT testu MCF-7 šūnām. GC tika izšķīdināti RPMI-1640 barotnēs, kas satur 0,1% DMSO, gala koncentrācijās 0.0175, 0,175, 1,75, 17,5 un 175 µg /ml. MCF-7 šūnu līnijas 4 dienas tika kultivētas RPMI-1640 barotnē, kas nesatur fenolu, kas satur 5% CDT-FBS. Pēc trīs reizes mazgāšanas ar PBS, 100 µL FBS nesaturošas RPMI-1640 barotnes pievienoja 96 iedobju plāksnēm ar 1,5 × 104 katrā iedobē un inkubēja 37 grādu temperatūrā 24 stundas. Pēc tam šūnas tika apstrādātas ar dažādām GC šķīduma koncentrācijām attiecīgi 24, 48 un 72 stundas. Pēc tam katrai iedobei pievienoja 100 µL MTT šķīduma (0,5 mg/ml). Šūnas tika inkubētas 4 stundas. Visbeidzot, lai izšķīdinātu formazāna kristālus, pievienoja 150 µL DMSO. Absorbciju mērīja pie 570 nm ar mikroplašu lasītāju, un tika aprēķināts PR. Fenolsarkano nesaturošā RPMI-1640 un barotne, kas satur E2 (2,725 × 10–3 µg/ml), bija attiecīgi negatīvā un pozitīvā grupa.

Cistanches glikozīdu ar fulvestrantu šūnu proliferācijas analīze uz MCF{0}} šūnu līnijām

Šūnu proliferācija tika mērīta, izmantojot MTT testu MCF-7 šūnām. GC tika izšķīdināti RPMI-1640 barotnēs, kas satur 0,1% DMSO galīgajā koncentrācijā 1,75, 17,5 un 175 µg/ml. MCF-7 šūnu līnijas 4 dienas tika kultivētas RPMI-1640 barotnē, kas nesatur fenolu, kas satur 5% CDT-FBS. Pēc trīs reizes mazgāšanas ar PBS, 100 µL FBS nesaturošas RPMI-1640 barotnes pievienoja 96 iedobju plāksnēm ar 1,5 × 104 katrā iedobē un inkubēja 37 grādu temperatūrā 24 stundas. Pēc tam šūnas tika apstrādātas ar dažādām GC šķīduma koncentrācijām un inkubētas ar fulvestrantu (6, 06 × 10–5 µg / ml) 48 stundas. Pēc tam katrai iedobei pievienoja 100 µL MTT šķīduma (0,5 mg/ml). Šūnas tika inkubētas 4 stundas. Visbeidzot, lai izšķīdinātu formazāna kristālus, pievienoja 150 µL DMSO. Absorbciju mērīja pie 570 nm ar mikroplašu lasītāju, un tika aprēķināts PR. Fenolsarkano nesaturošā RPMI-1640 un barotne, kas satur E2 (2,725 × 10–3 µg/ml), bija attiecīgi negatīvā un pozitīvā grupa.

Šūnu cikla tests

GC tika izšķīdināti RPMI-1640 barotnēs, kas satur 0,1% DMSO galīgajā koncentrācijā 1,75, 17,5 un 175 µg/ml. MCF-7-šūnu līnijas 4 dienas kultivēja RPMI-1640 barotnē, kas nesatur fenolu, kas satur 5% CDT-FBS. Pēc trīs reizes mazgāšanas ar PBS, 1 ml FBS nesaturošas RPMI-1640 barotnes pievienoja 6 iedobju plāksnēm ar 2,5 × 105 katrā iedobē un inkubēja 37 grādu temperatūrā 24 stundas. Pēc tam šūnas tika apstrādātas ar dažādām GC šķīduma koncentrācijām un inkubētas ar fulvestrantu (6, 06 × 10–5 µg / ml) 48 stundas. Pēc tam šūnas tika savāktas un trīs reizes mazgātas ar PBS, centrifugētas pie 4 grādiem, 1000 apgr./min 10 minūtes un fiksētas ar 70% etanolu -20 grādos uz nakti. Pēc divreiz mazgāšanas ar PBS šūnas tika iekrāsotas ar PI šķīdumu (50 mg / ml), kas satur 1 mg / ml RNāzes A un 0, 1% Triton X-100, 30 minūtes tumsā 4 grādu temperatūrā. Šūnu cikls tika noteikts, izmantojot plūsmas citometriju, un proliferācijas indekss (PI) tika aprēķināts šādi. Fenolsarkano nesaturošā RPMI-1640 un barotne, kas satur E2 (2,725 × 10–3 µg/ml), bija attiecīgi negatīvā un pozitīvā grupa.

PI {{0}} (S + G2 M)/(G0 /G1  + S + G2 M) × 100%

RNS izolācija un reālā laika kvantitatīvā polimerāzes ķēdes reakcijas analīze

Lai izmērītu mRNS līmeni, tika izmantots RT kvantitatīvs PCR (qPCR) tests. Kopējā šūnu RNS tika ekstrahēta ar TRIzol reaģentu. qPCR gadījumā RNS tika reversi transkribēta uz cDNS no 4 µg kopējās RNS, izmantojot RT komplektu. RT-PCR analīzes tika veiktas, izmantojot TB Green™ RT-PCR komplektu. Visi protokoli tika veikti saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Praimeru pāris, ko izmantoja ER pastiprināšanai, bija 5'-GGGAAGTATGGCTATGGAATCTG-3' (uz priekšu) un 5'-TGGCTGGACACATATAGTCGTT-3' (reverss); ER pastiprināšanai izmantotais primer pāris bija 5'-AGTGCCGCTCTTGGAGAGCTG-3' (uz priekšu) un 5'-CCTGGGTCGCTGTGACCAGA-3' (reverss). PCR apstākļi ER un ER bija 94 grādi 3 minūtes, kam sekoja attiecīgi 37 un 40 cikli: 94 grādi 30 sekundes, 58 grādi 2 minūtes un 72 grādi 2 minūtes. GAPDH pastiprināšanai izmantotais praimeru pāris bija 5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3' (uz priekšu) un 5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3' (reverss). PCR apstākļi GAPDH bija 94 grādi 3 minūtes, kam sekoja 30 cikli 94 grādi 30 sekundes, 58 grādi 2 minūtes un 72 grādi 2 minūtes. Katru reizi RT-qPCR eksperiments tika atkārtots vairāk nekā divas reizes. Šim nolūkam GAPDH tika izmantota kā iekšējā kontrole. Tika aprēķināta transfektantu ER /ER relatīvā gēnu ekspresija par kontroles šūnām: 2−(∆∆Ct).

Western blotēšana

ER un ER proteīnu ekspresija tika noteikta ar Western blot analīzi kā ziņoto metodi ar nelielām modifikācijām. Īsumā, MCF-7 šūnas tika audzētas 6 iedobju plāksnēs ar 2, 5 × 105 šūnām katrā iedobē un attiecīgi 48 stundas apstrādātas ar GC galīgajā koncentrācijā 1, 75, 17, 5 un 175 µg / ml. Pēc inkubācijas visu šūnu ekstrakti tika sagatavoti, izmantojot RIPA buferšķīdumu, kas satur 1 mM PMSF. Olbaltumvielas veselu šūnu ekstraktos tika atdalītas ar 12% nātrija dodecilsulfāta-poliakrilamīda gēla elektroforēzi un pēc tam pārnestas uz polivinilidēna difluorīda membrānām. Membrāna tika bloķēta ar 5% (w/v) vājpienu, kas izšķīdināts TBST buferšķīdumā, un pēc kārtas inkubēja ar primārajām un sekundārajām antivielām. Tika novērotas saistītās antivielas.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UZLABOŠANAIESTROGĒNĀ AKTIVITĀTEPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Statistiskā analīze

Rezultāti tika izteikti kā vidējās vērtības un standarta novirzes, un statistiskā nozīmība tika noteikta, izmantojot Stjudenta t-testu ar SPSS 21.{1}} programmatūru (IBM Co., Ltd. America). P<0.05 was considered statistically significant. 

REZULTĀTI

Pēc 24 stundu ilgas E2 apstrādes tika uzlabota MCF-7 šūnu proliferācija [1.a attēls]. 10 nM E2 šķīduma acīmredzami varētu stimulēt šūnu augšanu (123,89%). Tomēr, palielinoties E2 koncentrācijai, šūnu proliferācijas spēja vājinājās. Tādējādi 10 nM bija optimālā E2 koncentrācija šajā eksperimentā. GC grupa koncentrācijās 1,75, 17,5 un 175 µg/mg varēja uzlabot MCF-7 šūnu līniju proliferāciju atkarībā no laika un devas, un tai bija būtiska atšķirība ar negatīvo grupu [1.b attēls]. Salīdzinot ar negatīvo grupu, E2 grupai bija acīmredzama izplatība (120, 06%). Kombinētā medikamentu grupa (CMG) (fulvestrants ar E2 vai GC) CDT-FBS barotnē tika inkubēts ar MCF-4 šūnām. Pēc 72 h

inkubācijas laikā CMG var izraisīt PR slīpumu salīdzinājumā ar individuālo medikamentu grupu (IMG) (P< 0.01) [Figure 1c]. Flow cytometry analysis showed that GCs could slightly increase the PI value suggesting that GCs could advance G0/G1 phase cells to S and G2/M phase [Figure 2 and Table 1] and promote cell DNA synthesis. The result indicated that the mechanism of GCs on MCF‑7 was similar to that of E2. In CMG  (fulvestrant with GCs), the PI value of cell PI declined to that of IMG slightly (P < 0.05). RT‑PCR analysis indicated that the expressions of ERα and ERβ mRNA were increased compared with the control group  (P  <  0.01) in a dose‑dependent manner after being treated with different concentrations of GCs for 48 h [Figure 3a and b]. Western blot result indicating that after treatment with various concentrations of GCs for 48  h, contents of ERα and ERβ proteins in MCF‑7 increase with the GCs increased in a dosage‑dependent manner [Figure 3c‑e]. 

SECINĀJUMS

Šajā pētījumā GC ietekme uz MCF-7 proliferāciju un šūnu ciklu tika pārbaudīta ar attiecīgi MTT un plūsmas citometrijas metodi.GC varētu palielināt MCF-7 šūnu proliferāciju1,75, 17,5 un 175 µg/ml koncentrācijā pēc 72 stundu inkubācijas. Tomēr pieaugumam ir tendence palēnināties, ja CC un fulvestrants tiek lietoti kopā. GC varētu palielināt MCF-7 šūnu PI vērtību, samazināt G1 fāzes šūnu un palielināt S un G2 fāzes šūnas.

Fulvestrants ir ER specifisks antagonists, kas bloķē ER kodola lokalizāciju, pasliktinot receptoru dimerizāciju un no enerģijas atkarīgo kodola transportu.[17] Šajā pētījumā secinājums apstiprināja, ka fulvestrants var vājināt GC proliferāciju uz MCF-7 šūnām un var ietekmēt šūnu cikla transformāciju. Tādējādi šis pētījums norādīja uz GC estrogēnu aktivitāti, un arī ER ir

GC mērķis. RT-PCR un Western blot eksperimentā ER un ER mRNS un proteīnu ekspresija MCF-7 šūnās palielinājās, palielinoties GC koncentrācijai. TāpēcGC var spēlēt lomu estrogēnu aktivitātēsaskaņā ar pārregulētu ER un ER mRNS un proteīniem.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA UZLABOŠANAIESTROGĒNĀ AKTIVITĀTEPHGS75% ECH 30% ACT 12%