(2-aizvietoto fenil-1, 3-ditiolan-4-il)metanola atvasinājumu dizains, sintēze un antimelanogēnā iedarbība
Mar 22, 2022
Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com
Do Hyun Kim1Su Jeong Kim1Sultan Ullah1Hwi Young Yun1Pusoon Chun2Hyung Ryong Moon1
Abstract:Autori izstrādāja un sintezēja 17 (2-aizvietotā fenil-1, 3-ditiolan-4-il) metanola (PDTM) atvasinājumus, lai atrastu jaunu ķīmisko pamatu, uzrādot izcilus rezultātus.tirozināzes inhibitorsaktivitāte. Viņu tirozināzes inhibējošās aktivitātes tika novērtētas pret sēņu tirozināzi pie 50 μM, un tika konstatēts, ka pieci no PDTM atvasinājumiem (PDTM3, PDTM7 – PDTM9 un PDTM13) kavē sēņu darbību.tirozināzevairāk nekā kojskābe vai arbutīns, pozitīvās kontroles. No septiņpadsmit PDTM vislielākā inhibējošā iedarbība bija PDTM3 (pusmaksimālā inhibējošā koncentrācija 13,94±1,76 μM) ar 2,4-dihidroksifenilgrupu (kojskābes pusi no maksimālās inhibējošās koncentrācijas 18.86±) 2,14 μM). Interesanti, ka PDTM savienojumiem bez hidroksilgrupas PDTM7 – PDTM9 bija arī spēcīgākas inhibējošās aktivitātes nekā kojskābei. In silico pētījumi par mijiedarbību starp tirozināzi un pieciem PDTM liecināja, ka to saistīšanās afinitāte bija cieši saistīta ar to tirozināzi inhibējošo darbību. Šūnu eksperimenti, kas veikti, izmantojot B16F10 peles ādas melanomas šūnas, parādīja, ka PDTM3 efektīvi inhibējamelanoģenēzeun šūnutirozināzeaktivitāte. Šūnu dzīvotspējas pētījums, kas tika veikts, izmantojot B16F10 šūnas, liecināja, ka PDTM3 antimelanogēnā iedarbība nebija saistīta ar tā citotoksicitāti. Kinētiskie pētījumi parādīja, ka PDTM3 konkurētspējīgi inhibēja tirozināzi, norādot uz saistīšanos ar tirozināzes aktīvo vietu. Mēs atklājām, ka PDTM3 ar jaunu ķīmisko pamatni varētu būt daudzsološs kandidāts ādas balināšanas līdzekļiem un ka 1,3-ditiolāna gredzenu varētu izmantot kā ķīmisku pamatni spēcīgai tirozināzes inhibīcijai.Atslēgvārdi:tirozināzes inhibitors, melanoģenēze, 1,3-ditiolāns, PDTM
Cistanche ir tirozināzes inhibitors.
Ievads
Dažu pēdējo desmitgažu laikātirozināzes inhibitoriir izraisījuši ievērojamu interesi, jo tirozināzei ir galvenā lomamelanoģenēze. Melanīns tiek ražots, izmantojot fermentatīvi katalizētu un ķīmisku reakciju kombināciju. Biosintēzes ceļu, kas ir atbildīgs par melanīna ražošanu, sākotnēji noskaidroja Raper1 un Mason2, un nesen to modificēja Cooksey et al3 un Schallreuter et al.4 Melanoģenēzi ierosina ferments tirozināze, kas katalizē pirmos divus oksidācijas posmus melanīna biosintētiskajā ceļā: oksidācijas. no l-tirozīna uz l-dopu, kam seko l-dopa par l-dopahinonu (1. attēls). Šie divi soļi ir arī melanīna biosintēzes ātrumu noteicošie soļi, jo fizioloģiskais pH var spontāni turpināties turpmākajos posmos.5 Otrajā posmā iegūtais dopahinons ar glutationu vai cisteīnu tiek pārvērsts par cisteinildopu un, visbeidzot, par feomelanīnu, kas ir atbildīgs par dzelteno zīdītāju ādas sarkanās krāsas vai automātiskās oksidācijas rezultātā līdz dopahromam un visbeidzot eumelanīnam, kas ir atbildīgs par zīdītāju ādas brūno/melno krāsu (1. attēls). Melanīns aizsargā cilvēka ādu no kaitīgā ultravioletā starojuma, kā arī nosaka fenotipisko izskatu. No otras puses, pārmērīga melanīna uzkrāšanās ādā var izraisīt ar hiperpigmentāciju saistītas slimības un kosmētiskas problēmas, piemēram, vasaras raibumus, melasmu un senilu lentigīnu.
Tirozināzeir plaši izplatīts baktērijās, sēnēs, kukaiņos, augos un dzīvniekos, tostarp cilvēkos, un ir atbildīgs par cilvēka ādas un matu krāsu un nevēlamu augļu un dārzeņu brūnināšanu.6 Nevēlama fermentatīvā brūnināšana un slimības, kas saistītas ar ādas hiperpigmentāciju ir mudinājuši zinātniekus meklēt jaunus spēcīgus tirozināzes inhibitorus lietošanai kā ādas balināšanas un brūnināšanas līdzekļus. Daudzitirozināzes inhibitoriir atklāti līdz šim,7–9, bet salīdzinoši maz ir apstiprināti kā ādu balinoši materiāli drošības apsvērumu vai vājas balinošās iedarbības dēļ.
Iepriekšējos pētījumos, pamatojoties uz l-tirozīna un l-dopa, dabisko tirozināzes substrātu, struktūrām, mēs izstrādājām divus potenciālos tirozīna inhibitorus ar tiazolidīna gredzenu (MHY384 un MHY794; 1. attēls) un sintezējām tos, kondensējot atbilstošu benzaldehīds un l-cisteīns vai cisteamīna hidrohlorīds. Šie divi savienojumi tika identificēti kā spēcīgi konkurētspējīgitirozināzes inhibitoriun efektīvi samazināt melanoģenēzi HRM2 bezspalvainām pelēm.10,11 Papildus tiešai tirozināzes aktivitātes inhibēšanai MHY384 inhibēja tirozināzes ekspresiju, nomācot ciklisko adenozīna monofosfāta-PKA10 un NO izraisīto ciklisko guanozīna monofosfāta supresēto ceļitirozināzeekspresija, ko izraisa NO starpniecībamelanoģenēzeŠie pozitīvie rezultāti un fakts, ka divvērtīgais –S– ir klasiska divvērtīgā –NH– izostēra, mudināja mūs sintezēt atvasinājumus ar ditiolāna gredzenu kā surogātu tiazolidīna gredzenam, kas parasti pastāv MHY384 un MHY794, lai atrastu jaunu tirozināzes inhibitori.
Šajā pētījumā kā daļa no mūsu pastāvīgajiem centieniem atrast jaunu un spēcīgu ķīmisko pamatu tirozināzes inhibēšanai un izstrādāt jaunustirozināzes inhibitori, mēs sintezējām strukturāli jaunu (2-aizvietoto fenil-1, 3-ditiolan-4-il)metanola (PDTM) atvasinājumu klasi (1. attēls) un pētījām to antimelanogēno iedarbību, izmantojot sēņu tirozināzes un šūnu testi. Šajā pētījumā kojskābe un arbutīns tika izmantoti kā pozitīva kontrole tirozināzes inhibējošās aktivitātes noteikšanai, jo kojskābe ir viena no visbiežāk izmantotajām pozitīvajām kontrolēm tirozināzes inhibīcijas novērtēšanai, un arbutīnu klīniski izmanto kā balinošu līdzekli.
materiāli un metodes
Materiāli
Ja nav norādīts citādi, visi komerciāli pieejamie reaģenti – l-tirozīns (kods T3754), l-dopa (kods PHR1271), kojskābe (kods K3125), MTT (3-(4,5-dimetil{{). 8}}tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolija bromīds) (kods M2128), PMSF (fenilmetilsulfonilfluorīds) (kods P7626), Triton X-100 ( 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenilpolietilēnglikols) (kods T8787), kālija hidrogēnfosfāts (kods P9666), kālija dihidrogēnfosfāts (kods PHR1330), 2,3- dimerkapto-1-propanols (kods 64046), 1,4-dioksāns (kods 296309), sērskābe (kods 339741) un benzaldehīdi – tika iegādāti no uzņēmuma Sigma-Aldrich (St Louis, MO, ASV). Liellopu augļa serums, Dulbecco Modified Eagle's Medium, fosfātu buferšķīdums (PBS), penicilīns, streptomicīns un tripsīns tika iegādāti no Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, ASV). Sēnetirozināze(kods T3824) un -melanocītus stimulējošais hormons (-MSH; kods M4135) tika iegādāti arī no Sigma-Aldrich. 1H un 13C kodolmagnētiskās rezonanses (NMR) spektri tika reģistrēti ar Varian Unity Inova 400 un Varian Unity AS 500 instrumentiem (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ASV). Zemas izšķirtspējas masas spektrometrijas (MS) un augstas izšķirtspējas MS dati tika iegūti attiecīgi ar Expression CMS (Advion, Ithaca, NY, ASV) un 6530 Accurate Mass kvadrupola lidojuma laika šķidruma hromatogrāfijas masas spektrometru (Agilent). . PDTM1 – PDTM17 sintēze tika veikta mūsu laboratorijā.
cistanche ekstrakts
Vispārīga procedūra PDTM1–PDTM17 sintēzei
Maisot 2,3-dimerkapto-1-propanola (100 mg, 0,80 mmol) šķīdumu 1,4-dioksānā (1 ml) pēc tam pievienoja sērskābes šķīdumu (0,1 ekvivalents) 1,4-dioksānā (1 ml) un atbilstošu benzaldehīdu (1,1 ekvivalents). Pēc maisīšanas istabas temperatūrā 10 minūtes reakcijas maisījumu maisīja 70 grādu temperatūrā no 40 minūtēm līdz 1 stundai. Pēc tam maisījumu sadalīja starp etilacetātu un ūdeni, un organisko slāni žāvēja ar bezūdens MgSO4, filtrēja un iztvaicē. Iegūtais atlikums tika attīrīts, izmantojot silikagela kolonnas hromatogrāfiju, lai iegūtu tīrus PDTM produktus: PDTM1–PDTM17.14 Struktūras raksturojums (1H un 13C NMR un visu PDTM masas dati un 1-D un 2-D KMR dažu sintezēto savienojumu PDTM) spektri ir sniegti papildu materiālos.
Sēņu inhibīcijatirozināzear PDTM1–PDTM17
PDTM analogu inhibējošā iedarbība uz sēņu tirozināzi tika pētīta ar nelielām modifikācijām, kā aprakstīts iepriekš mūsu darbā.15 Katrs savienojums (10 μL, galīgā koncentrācija 50 μM) tika sajaukts ar substrāta šķīdumu (170 µL), kas sagatavots no 14,7 mM kālija fosfāta. buferšķīdums (pH 6,5) un 293 µM l-tirozīna šķīdums (1:1, v/v) katrā 96-iedobes plāksnes iedobē. Katrai iedobei pievienoja sēņu tirozināzes šķīdumu (20 μL, 1, 000 U/mL) un inkubēja 30 minūtes 37 grādu temperatūrā. Iedobēs izveidotā dopahroma saturs tika noteikts, mērot optisko blīvumu pie 475 nm, izmantojot VersaMax mikroplašu lasītāju (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ASV). Kā pozitīvās kontroles tika izmantota kojskābe un arbutīns. Visi eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros. Inhibīcijas likmestirozināzetika aprēķināti šādi:
Inhibīcija (procenti)=× 100 [ ( 1 − AB/ )] (1)
kur A norāda testa savienojuma optisko blīvumu un B apzīmē kontroles optisko blīvumu.
Puse no maksimālās inhibējošās koncentrācijas (IC50) ir savienojuma koncentrācija, kas kavē standarta 50 procentu reakciju. IC50 tiek iegūts no x ass uz inhibitora koncentrācijas un produkta veidošanās līknes, un to nosaka no devas un reakcijas līknes izlīdzināšanas uz atkarīgo y asi. Šajā pētījumā no devas atkarīgi inhibīcijas eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros, lai noteiktu savienojumu IC50. Atbilstoši piecu devu inhibīcijas procentiem (galīgā koncentrācija 10, 20, 30, 40 un 50 µM) katrā eksperimentā tika noteiktas log-lineārās līknes un to vienādojumi. Pēc tam individuālās IC50 vērtības tika aprēķinātas kā koncentrācija, kad y ass bija vienāda ar 50 procentu inhibīciju. Tiek parādīti trīs eksperimentu rezultāti.
Sēņu tirozināzes inhibīcijas rakstura analīze
Lai noskaidrotu PDTM3 inhibējošās iedarbības raksturu uz sēņu tirozināzi, tika veikti kinētiskie pētījumi. PDTM3 (10 μL [0, 5, 10 vai 25 μM galīgā koncentrācija]) tika pievienots 170 µL l-tirozīna šķīdumam (0,5, 1, 2 vai 4 mM galīgā koncentrācija) un tad sajauc ar sēnēmtirozināzešķīdums (20 μL, 1, 000 U/mL) katrā 96-iedobes plāksnes iedobē. Pēc tam, kad maisījums tika inkubēts 30 minūtes 37 grādu temperatūrā, iedobēs saražotā dopahroma saturs tika noteikts, mērot optiskos blīvumus pie 475 nm, izmantojot mikroplašu lasītāju. Visi eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros. Inhibīcijas rakstura noteikšanai tika izmantots Lineweaver-Burk diagrammas.
cistanche ekstrakts ieguvums
PDTM3 vai kojskābes dokošanas simulācija ar tirozināzi
Olbaltumvielu ligandu in silico dokstacijas simulācija tika veikta ar AutoDock Vina, izmantojot sistemātiskas meklēšanas paņēmienu un Agaricus bisporus 3-D struktūrutirozināze(Protein Data Bank ID 2Y9X).16,17 Tirozināzes kristāliskajā struktūrā l-tirozīna saistīšanās vieta tika izmantota kā dokstacijas kabata. Simulācijas rezultāti tika iegūti, savienojot tirozināzi un sintētiskus savienojumus (PDTM3, PDTM7, PDTM8, PDTM9 un PDTM13) vai kojskābi. Pirms dokošanas simulācijas ar savienojumiem, 2-savienojumu D struktūras tika pārveidotas par 3-D struktūrām, tika noteikti savienojumu lādiņi un, izmantojot ChemOffice, tika ievietoti ūdeņraža atomi. LigandScout 3.1.2 tika izmantots, lai prognozētu iespējamo mijiedarbību starp ligandu un tirozināzi un identificētu farmakoforus. Papildu materiālos ir sniegti 17 PDTM dokstacijas simulācijas attēli.
Melanoģenēzes līmeņa noteikšana B16F10 šūnās
B16F10 šūnās tika izmantoti melanīna satura testi ar nelielām modifikācijām PDTM3 inhibējošajai iedarbībai uzmelanoģenēze.19 Šūnām, kas iesētas ar blīvumu 5 × 104 šūnas/iedobē 24-iedobes plāksnē, tika atļauts pielipt 37 grādu temperatūrā mitrinātā atmosfērā, kas satur 5 procentus CO2, nakti. Nākamajā dienā šūnas tika pakļautas -MSH (1 µM) un PDTM3 (0, 5, 10 vai 25 μM) vai kojskābei (25 μM), un plāksne tika inkubēta 24 stundas tādos pašos apstākļos. Pēc divreiz mazgāšanas ar PBS šūnas tika atdalītas, inkubējot 60 grādu temperatūrā 200 μL 1 N NaOH 1 stundu. Lizāti tika pārvietoti uz 96-iedobes plāksni, un optiskais blīvums tika mērīts pie 405 nm ar enzīmu saistītu imūnsorbcijas testa lasītāju, lai aprēķinātu kojskābes un PDTM3 vidējo procentuālo inhibīciju. Visi eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros.
Tirozināzes aktivitātes tests B16F10 šūnās
Novērtējot l-dopa oksidācijas ātrumu,tirozināzeaktivitātes tika novērtētas ar nelielām modifikācijām, kā aprakstīts iepriekšējā darbā.20 Šūnām, kas iesētas ar blīvumu 5×104 šūnas/iedobē 24-iedobes plāksnē, tika atļauts 24 stundas turēties 37 grādu temperatūrā mitrinātā atmosfērā, kas satur 5 procentus CO2. Šūnas tika pakļautas -MSH (1 µM) un PDTM3 (0, 5, 10 vai 25 μM) vai kojskābes (25 μM) iedarbībai, un plāksne tika inkubēta tādos pašos apstākļos 24 stundas. Pēc divreiz skalošanas ar PBS, šūnas tika lizētas ar 100 μL līzes buferšķīdumu, kas satur 0,1 mM PMSF (5 μL), 50 mM PBS (90 μL, pH 6,8) un 1 procentu Triton X-100 (5 μL). un sasaldē -80 grādu temperatūrā 30 minūtes. Lizāti tika atkausēti un centrifugēti pie 12,000 g 30 minūtes 4 grādu temperatūrā, un supernatanti (80 μL) tika apvienoti ar 10 mM l-dopa (20 μL) 96-iedobes plāksnē, kas pēc tam tika ievietota. inkubē 30 minūtes 37 grādu temperatūrā. Optiskais blīvums tika aprēķināts pie 500 nm, un tirozināzes inhibējošās aktivitātes tika noteiktas šādi:
Inhibīcija (procenti)=× 100 ([A−B] − [C−D] /[ A−B ] ) (2)
kur B un A ir tukšā parauga optiskie blīvumi attiecīgi pirms un pēc inkubācijas, un D un C ir testējamā savienojuma optiskie blīvumi attiecīgi pirms un pēc inkubācijas.
Statistiskā analīze
Viena veida dispersijas analīze, kam sekoja Daneta tests, tika izmantota, lai noteiktu, vai grupas vidējie rādītāji būtiski atšķiras no kontroles rādītājiem. Lai noteiktu, vai PDTM3 un kojskābes iedarbība būtiski atšķiras, tika izmantots Velča nesapārotais t-tests. Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot GraphPad (GraphPad Software, La Jolla, CA, ASV). Visi rezultāti ir norādīti kā trīs neatkarīgu eksperimentu vidējie ± standarta kļūda. Divpusējās P vērtības 0,05 tika uzskatītas par statistiski nozīmīgām.
rezultāti un diskusija
PDTM1–PDTM17 PDTM1–PDTM17 sagatavošana tika sintezēta, kā parādīts 1. shēmā. Karsējot 2, 3-dimerkapto-1-propanolu un daudzus atbilstoši aizvietotus benzaldehīdus (1–17) 1,4-dioksānā sērskābes klātbūtne nodrošināja vēlamos PDTM produktus cietvielu vai lipīgu eļļu veidā. Galaproduktu struktūras tika apstiprinātas ar 1H un 13C KMR, korelācijas spektroskopiju, heteronukleāro viena kvantu korelācijas spektroskopiju, heteronukleāro daudzsaišu korelācijas spektroskopiju un zemas un augstas izšķirtspējas MS. Singleta klātbūtne, kas atbilst protonam –SCH(Ph)S– pie δ=6,09–5,56 ppm 1H KMR spektros apstiprināja ditiolāna gredzena veidošanos starp benzaldehīdiem un 2,3-merkapto. -1-propanols. PDTM 1H KMR spektroskopiskajos datos 2-H virsotne parādījās vairāk lejup nekā sp3 oglekļa atomiem piesaistīto protonu virsotnes, un 4-H eksometilēna un 5-H2 pīķi tika novēroti vairāk. upfield nosauktā secībā. 13C KMR spektroskopiskajos datos, izņemot pīķus no fenilgredzena, eksometilēna oglekļa maksimums (~64 ppm) bija vislielākais lejup, kam sekoja 4-C (~58 ppm), 2-C (~55,3 ppm) un 5-C (~41 ppm). Četri produkti – PDTM6, PDTM12, PDTM13 un PDTM15 – tika iegūti katrs kā viens racemāts, bet pārējie tika iegūti kā divu racemātu ([2R,4R]/[2S,4S] un [2R,4S]/) maisījums. [2S,4R], 1:1–1:1,5), kuru attiecības aprēķinātas, izmantojot 1H KMR spektroskopijas datus. Produkta veidošanās fenomenu nevar izskaidrot vienkārši ar steriskiem, elektroniskiem un/vai stereoelektroniskiem efektiem. Thetirozināzes inhibīcijatests tika veikts bez racemātu atdalīšanas.
PDTM1 – PDTM17 inhibējošā iedarbība uz sēņu tirozināzi
Tika pārbaudīts 17 sintezēto produktu PDTM1 – PDTM17 potenciāls inhibēt sēņu tirozināzes aktivitāti, izmantojot kojskābi22 un arbutīnu23 kā pozitīvās kontroles. Inhibīcijas tika noteiktas, izmantojot 293 µM l-tirozīnu kā substrātu un sintētiskos savienojumus 50 µM koncentrācijā.Tirozināzekojskābes un arbutīna inhibīcijas tika noteiktas attiecīgi pie 50 un 500 µM.
Trīs savienojumi – PDTM11 (3,4,5-trimetoksifenils), PDTM15 (4-hidroksi-3-metilfenils) un PDTM17 (3,5-di-t-butil{{ 12}}hidroksimetil) – inhibēja tirozināzi tādā pašā mērā kā kojskābe un inhibēja to vairāk nekā arbutīns (1. tabula). Pieci PDTM atvasinājumi – PDTM3 (2,4-dihidroksifenils), PDTM7 (4-metoksifenils), PDTM8 (3,4-dimetoksifenils), PDTM9 (2,4-dimetoksifenils), un PDTM13 (3-brom-4-hidroksifenils) — inhibēja tirozināzi spēcīgāk nekā kojskābe. Tika pārbaudītas šo savienojumu IC50 vērtības: 13,94 ± 1,76 µM (PDTM3), 16,47 ± 2,36 µM (PDTM7), 16,97 ± 2,99 µM (PDTM8), 27,85 ± 1,47 µM (PDTM9) un 1.3.15 µM (PDTM9). Zemās PDTM3, PDTM7, PDTM8 un PDTM13 IC50 vērtības liecināja, ka iedarbība bija spēcīgāka nekā kojskābei (1886±2,14 µM) un arbutīnam (381,26±3,22 µM), kuras tika izmantotas kā pozitīvas kontroles. . Interesanti, ka šis rezultāts saskan ar mūsu iepriekšējo atklājumu, ka daudziem analogiem ar 2,4-dihidroksifenilgrupu ir augstākstirozināzes inhibitorsaktivitāte nekā kojskābe.10,13,24–32
Pārējiem PDTM atvasinājumiem, salīdzinot ar kojskābi, nebija (PDTM1 un PDTM2) vai ar zemu inhibējošo efektu (PDTM4, PDTM5, PDTM6, PDTM10, PDTM12, PDTM14 un PDTM16). Saskaņā ar mūsu uzkrātajiem struktūras un aktivitātes attiecību datiem, analogi ar vismaz vienu hidroksilgrupu bija spējīgāki inhibēt tirozināzi. Nedaudz pārsteidzoši, četri PDTM atvasinājumi bez hidroksilgrupas inhibēja tirozināzes aktivitāti tikpat daudz vai efektīvāk nekā kojskābe. Tie bija PDTM7 (4-metoksifenils), PDTM8 (3,4-dimetoksifenils), PDTM9 (2,4-dimetoksifenils) un PDTM11 (3,4, 5-trimetoksifenils) . Savienojumi (PDTM1-2, PDTM4-5 un PDTM12) ar tikai 4-hidroksilgrupu fenilgredzenā vai alkoksi- vai hidroksilgrupu 3. pozīcijā ar 4-hidroksilgrupu grupai bija zema aktivitāte vai tās nebija nekādas, turpretim savienojumiem (PDTM13–PDTM17) ar alkil- vai broma grupu 3. pozīcijā ar 4-hidroksilgrupu bija vidēji augsta tirozināzi inhibējoša aktivitāte. Šie struktūras un aktivitātes attiecību rezultāti apstiprina hipotēzi, katirozināzes inhibitorssavienojumu ar 4-hidroksilgrupu aktivitāti lielā mērā ietekmē 3-aizvietotāja veids.
cistancheieguvums: pretnovecošanās
Sēņu tirozināzes inhibīcijas veids ar PDTM3
Tā kā PDTM3 inhibēja sēnestirozināzevairumā gadījumu Lineweaver-Burk diagramma tika izmantota, lai noteiktu tā inhibējošās iedarbības raksturu. Kā parādīts 2. attēlā, tika iegūts divkāršs abpusējs grafiks, un visas līnijas ar dažādiem slīpumiem krustoja y asi tajā pašā punktā. Tāpēc Km (Mihaelisa konstante) vērtības pakāpeniski palielinājās līdz ar PDTM3 koncentrāciju. Detalizētas kinētisko parametru vērtības ir parādītas 2. tabulā. No otras puses, maksimālo reakcijas ātrumu (Vmax) neietekmēja PDTM3 koncentrācija. Šie atklājumi parāda, ka PDTM3 no devas atkarīgi un konkurējoši inhibē tirozināzi.
In silico dokstacijas simulācijas tirozināzes saistīšanai ar PDTM3, PDTM7–PDTM9, PDTM13 un kojskābi
AutoDock Vina tika izmantots, lai noteiktu, vai sintezētie PDTM analogi tieši inhibēja tirozināzi, saistoties ar tās aktīvo vietu. Kojīnskābe un pieci PDTM analogi (PDTM3, PDTM7–PDTM9 un PDTM13), kuriem tika konstatēts, ka tiem ir spēcīga sēnetirozināzes inhibitorsaktivitāte, tika izmantoti kā ligandi dokstacijas simulācijai. Katram no šiem PDTM analogiem varētu būt četri stereoizomēri, un stereoizomēru saistīšanās enerģijas ir norādītas 3.A attēlā. Tika konstatēts, ka visiem pieciem PDTM analogiem ir līdzīga vai augstāka afinitāte pret tirozināzes aktīvo vietu, salīdzinot ar kojskābi (-5,4 kcal/mol), un PDTM3 uzrādīja vislielāko afinitāti. Šis rezultāts liecināja, ka šo piecu PDTM atvasinājumu spēcīgā inhibējošā iedarbība bija saistīta ar to saistīšanās afinitāti ar tirozināzi un parādīja ciešu saistību starp saistīšanās afinitāti, kas noteikta ar dokstacijas simulāciju, un tirozināzes inhibīciju.
Lai identificētu, tika izmantots LigandScout 3.1.2tirozināzeaminoskābju atlikumi, kas mijiedarbojas ar PDTM analogiem. Kā parādīts 3B un C attēlā, 4-hidroksilgrupa PDTM3 fenilgredzenā mijiedarbojās ar tirozināzes His85, veidojot ūdeņraža saiti, un fenilgredzens mijiedarbojās ar Val283 un Ala286, izmantojot hidrofobu mijiedarbību un ar His263 caur π–π. kraušanas mijiedarbība. Ūdeņraža saite starp spirta hidroksilgrupu un tirozināzes aminoskābju atlikumiem tika konstatēta tikai PDTM7 un PDTM8. Tomēr abu PDTM analogu spirta hidroksilgrupa mijiedarbojās ar dažādām aminoskābju atlikumiem, piemēram, PDTM7 mijiedarbojās ar His244 un Asn260, bet PDTM8 mijiedarbojās ar Gly281. Turklāt tirozināzes Val283 bija iesaistīts hidrofobās mijiedarbībās ar visiem pieciem analogiem.
Melanīna satura testi
B16F10 šūnas tika izmantotas, lai novērtētu PDTM analogu depigmentācijas aktivitātes. PDTM3 tika izvēlēts eksperimentiem, kuru pamatā ir šūnas, pateicoties tā spēcīgajai sēneitirozināzes inhibitorsiedarbība un tā toksicitātes trūkums pret B16F10 šūnām. Tika novērtēta PDTM3 inhibējošā iedarbība pret -MSH stimulētumelanoģenēzeB16F10 šūnās, nosakot melanīna līmeni šūnās. Melanīna līmenis tika ievērojami samazināts pēc tam, kad šūnas tika apstrādātas ar PDTM3 un -MSH, salīdzinot ar šūnām, kas apstrādātas tikai ar -MSH. Koncentrācijas diapazonā no 0 līdz 25 μM PDTM3 uzrādīja nozīmīgu un no devas atkarīgu antimelanogēnu efektu. Turklāt tikai 10 μM koncentrācijā PDTM3 uzrādīja lielāku inhibējošo spēju nekā kojskābe pie 25 μM, kā parādīts 5. attēlā. Šie rezultāti liecināja, ka PDTM3 antimelanogēnā iedarbība B16F10 šūnās nebija saistīta ar citotoksicitāti.
Tirozināzes aktivitātes tests B16F10 šūnās
PDTM3 inhibējošā iedarbība uz šūnu tirozināzes aktivitāti tika pārbaudīta B16F10 šūnās, kas iepriekš stimulētas ar -MSH. PDTM3 inhibēts atkarībā no devastirozināzeaktivitāte koncentrācijas diapazonā 0–25 μM (6. attēls). Turklāt šie rezultāti labi saskanēja ar melanīna satura rezultātiem, kas liecināja, ka PDTM3 antimelanogēnā iedarbība bija saistīta ar tirozināzes inhibīciju.
Secinājums
Šajā darbā tika sintezēti dažādi PDTM analogi un novērtēti to ietekme uzmelanoģenēzeun tirozināzes aktivitāte B16F10 šūnās. Astoņi analogi uzrādīja tikpat daudz vai spēcīgāku inhibīciju pret sēņu tirozināzi nekā kojskābe, un PDTM3 bija vislielākā inhibējošā aktivitāte. B16F10 šūnās PDTM3 būtiski inhibēja melanīna biosintēzi atkarībā no devas untirozināzeaktivitāte koncentrācijas diapazonā 0–25 μM bez citotoksiskas iedarbības. Koncentrācijā 10 μM PDTM3 samazināja melanīna biosintēzi un tirozināzes aktivitāti ievērojami vairāk nekā kojskābe pie 25 μM. Ņemot vērā mūsu novērojumus, ka daudziem PDTM analogiem bija spēcīgas tirozināzi inhibējošas aktivitātes, mēs iesakām 1,3-ditiolānu uzskatīt par piemērotu pamatutirozināzes inhibitorsaktivitāte. Tagad mēs meklējam katra divu racemātu PDTM maisījuma atdalīšanas apstākļus, un katra atsevišķa racemāta atdalīšanas apstākļi un antimelanogēnais efekts tiks ziņots noteiktā laikā.
