Perorāli ievadītā kalcija algināta aerogela novērtējums par Wistar žurku zarnu mikrobiotas un aknu un nieru darbības izmaiņām

Sazināties:ali.ma@wecistanche.com

Mohammad AA Al-Najjar et al

Abstrakts

Šajā pētījumā novērtēta kalcija algināta aerogela kā potenciāla zāļu nesēja ietekme uz aknām unnieru funkcijasun Wistar žurku zarnu mikrobiotā. Pētījumos algināta aerogels tika sagatavots nanodaļiņu veidā, izmantojot strūklas griešanas tehniku, un tie tika raksturoti pēc īpatnējo virsmu laukumiem, ārējās morfoloģijas un daļiņu izmēra sadalījuma. In vivo pētījumam kalcija algināta aerogels tika ievadīts iekšķīgi, un aknu unnieru funkcijastika pārbaudīti vienu nedēļu un četras nedēļas divos atsevišķos pētījumos. Īstermiņa in vivo pētījuma laikā tika savākti fekāliju paraugi baktēriju DNS ekstrakcijai, kam sekoja 16S rRNS gēnu sekvencēšanas analīzes, lai noteiktu izmaiņas zarnu mikrobiotā. Rezultāti parādīja, ka sagatavotā algināta aerogela vidējais BET raksturīgās virsmas laukums ir aptuveni 540 m2/g, poru tilpums ir 7,4 cc/g un poru platums 30–50 nm. In vivo pētījums atklāja, ka līmeņi pētītanieresun aknu enzīmi nepārsniedza augstāko normas līmeni. Zarnu mikrobiotas pētījums parādīja dažādus modeļus; laikā palielinājās noteiktas baktēriju grupas, piemēram, Clostridia un Bacteriodiaaerogelirežīms un turpināja palielināties pēc aerogela lietošanas pārtraukšanas. Kamēr citas grupas, piemēram, Erysipelotrichia un Candidatus Sacha baktērijas palielinājās laikāaerogeliārstēšana un pēc viena mēneša atkal samazinājās. Bacilli klases pārstāvji uzrādīja unikālu tendenci, proti, pēc tam, kad viņi bija visizplatītākā grupa (63 procenti) laikā 0, viņu relatīvais daudzums krasi samazinājās, līdz sasniedza < 5="" procentus;="" kas="" tā="" bija="" arī="" pēc="" aerogela="" terapijas="">

Cistanchetubulosa novēršnieresslimība,cistanche blakusparādības, noklikšķiniet.

Ievads

AeroģeļiPirmo reizi terminoloģiju 1931. gadā atklāja Semjuels Kistlers, kurš tos definēja kā materiālus, kas saglabā neskartu poru un tīkla struktūru, mainot poru šķidrumu ar gāzi [1]. Pēc 60 gadiem pēc to atklāšanas, organiskiaerogelitika ierosināti biomedicīnas un zāļu piegādes lietojumiem, ņemot vērā to lielo iekšējo virsmu un atvērto poru struktūru [2]. Šīs materiālu klases izcilās īpašības ļauj ne tikai palielināt iekraušanas efektivitāti, bet arī uzlabot noslogoto molekulu biopieejamību, stabilitāti un izdalīšanās kinētiku.

Pētījums paraerogeliperorālai zāļu lietošanai sākotnēji koncentrējās uz silīcija dioksīda izmantošanuaerogelito elastīgās un labi zināmās sol-gēla ķīmijas, kā arī atvasināšanas iespēju dēļ [3]. Tomēr silīcija aerogēlu izmantošana farmaceitiskajos preparātos, kas paredzēti iekšķīgai lietošanai, joprojām rada zināmas bažas to ierobežotās bioloģiskās noārdīšanās spējas dēļ. Tāpēc rodas turpmāka nepieciešamība izstrādāt aerogela nesēju, kas ir gan bioloģiski saderīgs, gan bioloģiski noārdāms. Tas var būt iespējams, izmantojot dabiskos organiskos materiālus vai bioloģiski noārdāmus polimērus, piemēram, alginātu [4] hialuronskābi [5], hitozānu, celulozi [6] un olbaltumvielas [7].

Algināts (Alg), kas iegūts no brūnajām aļģēm, ir lineārs kopolimērs, kas sastāv no ß-1,4-D-mannuronskābes un -L-guluronskābes monomēriem, kas ir mijas ar viendabīgiem vai heterogēniem blokiem līdzīgiem modeļiem. . Algināti ir izmantoti pārtikas un farmācijas rūpniecībā, jo tie ir netoksiski, lēti, bioloģiski noārdās un bioloģiski saderīgi [8, 9]. Daudzvērtīgie katjoni, piemēram, Ca2 plus, Ba2 plus vai Sr2 plus, var izraisīt Alg jonu šķērssavienojumu, pārveidojot to no šķīstoša uz nešķīstošu (gēla) formu.

Algs ir plaši izmantots pārtikas produktos un kā farmaceitiskā piedeva, piemēram, želejviela un tablešu dezintegrants [10, 11]. Tas ir izmantots arī biomedicīnā, tostarp zāļu ievadīšanā un audu inženierijā [12]. Tāpat kā citas ēdamās uztura šķiedras, Alg un tā oligomēru atvasinājumi ir izturīgi pret cilvēka endogēno enzīmu gremošanu. Tomēr cilvēka zarnu mikrobiota to var ievērojami sagremot [13]. Neskatoties uz tā nozīmi, maz ir zināms par zarnu mikrobiotu, kas ir atbildīga par Alg degradāciju.

Eiropas Pārtikas nekaitīguma iestāde (EFSA) ir deklarējusi algīnskābes un tās sāļu, kā arī to fermentācijas produktu nekaitīgumu. In vivo testi par algīnskābes un tās sāļu ūdens šķīdumu un suspensiju uzsūkšanos un izdalīšanos dzīvniekiem uzrādīja to nespēju absorbēt vai metabolizēt kuņģa-zarnu traktā esošu enzīmu ietekmē neatkarīgi no ievadīšanas formas. Tomēr tie daļēji noārdīsies fermentācijas rezultātā, kad tie izietu cauri resnajai zarnai anaerobās zarnu mikrobiotas ietekmē, izraisot aklās zarnas paplašināšanos, ko EFSA uzskatīja par adaptīvu procesu saistībā ar lielām devām, kas pārbaudītas kā pārtikas piedevas [14]. . Tomēr nevienā iepriekšējā in vivo pētījumā nav pētīta kalcija algināta (Ca-Alg) ietekme uz aerogelu.aknas, nieres,vai baktēriju kopiena zarnās.

Zarnu mikrobiota ir būtiska cilvēka gremošanas sistēmas sastāvdaļa, jo tās palīdz norīt uzņemto pārtiku, īpaši tādu, kam cilvēka organismā nav nepieciešamo enzīmu [15, 16]. Zarnu mikrobiota var arī kavēt patogēno mikroorganismu ziedēšanu, konkurējot ar tiem par barības vielu resursiem vai ražojot ķīmiskas vielas, lai kavētu to augšanu. Tomēr ir pierādīts, ka uzņemto sagremojamo šķiedru, piemēram, Alg, degradāciju galvenokārt izraisa fermentētas baktērijas resnajā zarnā [17]. Šī procesa produkti ir īsās ķēdes taukskābes (SCFA), kas ir labvēlīgas resnās zarnas iekaisumam un darbojas kā pretvēža līdzeklis. Brownlee et al. ziņoja, ka Alg un cilvēka fekāliju mikrofloras inkubācija parādīja, ka lielāko Algu degradāciju pavada izmaiņas zarnu mikrobiotā. Turklāt šāda inkubācija noved pie SCFA un gāzes veidošanās pēc 24 stundām [17].

materiāli un metodes

Materiāli

Algīnskābes nātrija sāli piegādāja BASF, Vācija. Kalcija hlorīds (CaCl2) tika iegādāts no Th. Geyer GmbH & Co. KG, Vācija. Oglekļa dioksīdu (tīrības pakāpe 99,5 procenti) piegādāja Praxair (Vācija), 99,8 procentu etanolu ieguva no Carl Roth (Vācija). Visas ķīmiskās vielas tika izmantotas kā saņemtas. ALP mērīšanai tika izmantoti komerciāli diagnostikas komplekti, un kreatinīna komplekti tika iegādāti no Biostsystems SA, Spānija. MO BIO'S PowerMax SoilDNA izolācijas komplekts tika iegādāts no MO BIO Laboratories, ASV. Visa pētījuma laikā tika izmantots dejonizēts ūdens.

Metodes

Aerogela daļiņu sagatavošana.

Pirmais solis aerogela daļiņu sagatavošanā bija izejas šķīduma sagatavošana; šim nolūkam nātrija algināta pulveris (Alg) tika pievienots destilētam ūdenim koncentrācijā 1 % w/w un tika turēts magnētiski maisot nakti istabas temperatūrā. Lai sagatavotu hidrogēla daļiņas, tiek izmantota pieeja, ko aprakstīja Preibisch et al. [18] tika sekots, izmantojot Jet Cutter Type S no genia Lab, Braunschweig (Vācija). Strūklas griešanas procesā algināta šķīdums tika izspiests caur sprauslu (diametrs 350 μm) ar saspiestu gaisu (1–3 bāri), veidojot strūklu (masas plūsmas ātrums 1 g/s). Strūkla tika sagriezta atsevišķās daļiņās ar rotējošu disku (40 stieples ar griešanas disku stieples diametru 100 μm, cilindru attiecība 5). Pēc izlaišanas caur disku polimēra šķīdums nokrita uz leju želejas vannā ar CaCl2 šķīdumu 5 g/l. Lai izvairītos no gēla daļiņu aglomerācijas, želejas vannas tilpums bija vismaz četras reizes lielāks par apstrādātā biopolimēra šķīduma kopējo tilpumu, un vannu saturs tika maisīts ar magnētisko stieni (60 apgr./min.). Attālums starp sprauslu un želejas vannu tika saglabāts 50–70 cm. Pēc gēla daļiņu savākšanas maisīšanu turpināja 60 minūtes, lai nodrošinātu pilnīgu želeju un izvairītos no aglomerācijas. Pēc tam želejas daļiņas tika atdalītas no želejas vannas, izmantojot filtrēšanu, un tika turpināta šķīdinātāja apmaiņa.

Šķīdinātāja apmaiņa (ūdens pret etanolu) tika veikta ar savāktajām daļiņām pakāpeniski (30, 60, 90, 100 % v/v etanols). Lai nodrošinātu pilnīgu apmaiņu, mērcēšanas šķidruma blīvums pēc pēdējā šķīdinātāja apmaiņas posma tika mērīts, izmantojot blīvuma mērītāju (DMA4500, Anton PaarCompany, Austrija). Pēc tam blīvums tika pārrēķināts etanola saturā. Iegūtās alkogela daļiņas galu galā tika iesaiņotas filtrpapīrā un žāvētas ar superkritisko CO2 autoklāvā nemainīgā 50 °C temperatūrā un 120 bāru spiedienā. Tika iestatīta nepārtraukta CO2 plūsma (20–80 g/min), līdz tika veikta pilnīga etanola ekstrakcija (2–4 stundas). Pēc tam tika veikta lēna autoklāva spiediena samazināšana (1–3 bar/min). Kad tika sasniegts apkārtējās vides spiediens, autoklāvs tika atvērts un kalcija algināta aerogela mikrosfēras (turpmāk apzīmētas kā Ca-Alg) tika savāktas un uzglabātas labi noslēgtos traukos sausos apstākļos.

Aerogela daļiņu raksturojums

aerogela daļiņu specifiskās virsmas tika mērītas, izmantojot zemas temperatūras slāpekļa adsorbciju/desorbciju (BET) (Quantachrome Nova 3000e, Odelzhausen, Vācija un Micromeritics TriStar II 3020, Vācija). Pirms mērījumiem paraugus žāvēja 20 minūtes vakuumā (< 1="" mpa)="" at="">

Sagatavoto aerogela daļiņu ārējās morfoloģijas izpēte tika veikta, izmantojot skenējošā elektronu mikroskopa (SEM) analīzi (Zeiss Supra VP55, Jēna, Vācija) pie paātrinājuma sprieguma 3 kV un darba attāluma 9.0– 9,4 mm. Pirms attēlveidošanas paraugi tika izsmidzināti ar zeltu (10 nm biezumā), lai samazinātu uzlādi un uzlabotu attēla kontrastu.

Daļiņu izmēra sadalījuma mērījumi tika veikti trīs reizes katram paraugam, kas sastāvēja no aptuveni 10,000 daļiņām. Dinamiskā attēla analīze tika veikta, izmantojot aCamsizer XT ar X-Jet moduli (Retsch GmbH, Vācija) ar gaisa spiedienu 50 kPa.

Aknu un nieru funkcijas un zarnu mikrobiotas pētījumi

Tika veikts izmēģinājuma pētījums ar nelielu skaitu dzīvnieku, kas sadalīti dažādās grupās, lai aptvertu četrus ārstniecības vielu devu līmeņus. Tas tika veikts īsu laiku (1 nedēļu), lai redzētu maksimālo iespējamo Ca-Alg aerogēlu devu, kam nav būtiskas ietekmes uz nieru vai aknu funkcijām un kas neuzrāda saslimstības vai mirstības pazīmes. Devas tika pārdomāti izvēlētas, ņemot vērā ziņoto algināta perorālo LD50 (vairāk nekā 5,000 mg/kg ķermeņa svara) [19]. Tomēr maksimālā iespējamā deva, kas tika sasniegta, minimāli uzbudinot dzīvnieku, bija 2,000mg/kg ķermeņa svara.

Pētījuma otrajā daļā dzīvnieki tika pakļauti fiksētas devas līmenim divas nedēļas. Attiecībā uz vecuma un svara izmaiņām un audzēšanas apstākļiem šī pētījuma laikā tika ievērotas Ekonomiskās sadarbības un attīstības organizācijas (OECD) vadlīnijas (kods Nr. 206). Visus eksperimentālos protokolus apstiprināja Jordānijas Lietišķās zinātnes privātās universitātes (ASU) Ētikas komiteja (IRB, apstiprinājuma numurs: 2019-PHA-12, pievienots S1 failā). Visi ASU dzīvnieku novietnes darbinieki ir labi apmācīti, lai uzraudzītu jebkādas izmaiņas, kas dzīvniekam varētu rasties iejaukšanās rezultātā. Konkrēti, tie uzrauga tādus parametrus kā svara izmaiņas, nenormāla uzvedība, izlocītas kažokādas, ierobežota mobilitāte, ķermeņa poza vai noteiktu ķermeņa šķidruma marķieru izpausme. Jebkādu nopietnu patoloģisku izmaiņu gadījumā dzīvnieka statusā viņiem ir atļauts izmantot humānā beigu punkta protokolu, ko apstiprinājusi ASU Ētikas komiteja. Eksperimentu beigās žurkas tika eitanāzētas ar atasiņošanu vispārējā anestēzijā, izmantojot 2,5% tiopentāla nātrija (Abbott Laboratories, North Point, Honkonga) 20 mg/kg intravenozi.

Dzīvnieks

Gan īstermiņa, gan ilgtermiņa in vivo pētījumos desmit nedēļas vecas, veselas Wistar žurkas ar vidējo svaru 240 ± 37 g tika turētas 21–23 ˚C temperatūrā un 35–70 procentu mitrumā. kontrolētās telpās, ar 12 h gaismas – 12 h tumsas cikliem. Žurkas tika identificētas un ievietotas atsevišķi sprostos ar skaidrām malām, lai atvieglotu novērošanu, netraucējot to uzvedību. Koka skaidas tika izmantotas kā pakaiši. Žurkas tika barotas ar komerciāli pieejamu barību (Local Sup plier, Jordānija), un tika brīvi piedāvāts saldūdens.

Žurku skaits grupā dažādos eksperimentos tika izvēlēts saskaņā ar iepriekš publicētajiem darbiem (piemēri; [20–22]) un atkarībā no stingrajiem noteikumiem par "dzīvnieku kopšanu un izmantošanu" valsts un starptautiskā mērogā, kas liek samazināt pētniecībā izmantoto dzīvnieku skaits. Tie ietver, bet ne tikai, "Dzīvnieku kopšanas un lietošanas programmu" Kalifornijas universitātē Bērklijā (https://acuc.berkeley.edu/about.html) un Norvēģijas vadlīnijas par dzīvnieku izmantošanu (https:// www.forskningsetikk.no/en/guidelines/ science-and-technology/ethical-guidelines-for-the-use-of-animals-in-research/).

Pilotpētījums in vivo (7 dienas atkārtotas devas)

Tika veikta atkārtota perorāla deva vienu nedēļu, lai noteiktu maksimālo iespējamo aerogēlu devu, kas demonstrē drošību Wistar žurkām. Ca-Alg aerogels tika ievadīts iekšķīgi četros 50, 100, 250 un 500 mg devu līmeņos, kas atbilst vidējai devai attiecīgi 200, 400, 1000 un 2000 mg/kg (ķermeņa svara). Rezultāti tika salīdzināti ar divām pozitīvām kontroles grupām, kurām tika ievadīts 50 un 500 mg neskarta nātrija algināta (Na-Alg), kas atbilst vidēji 200 un 2000 mg/kg ķermeņa svara. Galu galā visas iepriekšējās Ca-Alg aerogela un Na-Alg ārstēšanas grupas tika attiecinātas uz kontroles grupu (placebo). Pēdējā grupa saņēma fosfāta buferšķīdumu devā, kas līdzvērtīga maksimālajai devai, kad to ievadīja kā testējamo vielu nesēja sistēmu. Pilotpētījuma kontroles un ārstēšanas grupās bija 4 žurkas/grupa (divas mātītes un divi tēviņi/grupa). Ca-Alg aerogela un Na-Alg cietie pulveri tika attiecīgi suspendēti fosfāta buferšķīdumā (pH 7, 4) un labi sajaukti tieši pirms perorālās lietošanas, jo žurkas atteicās tos ēst sausā stāvoklī. Visām grupām ievadīšana žurkām tika uzsākta katru dienu vienā un tajā pašā laikā, izmantojot orālo zondi.

Ilgtermiņa in vivo iedarbības pētījums (15 dienu atkārtotas devas pētījums)

Pamatojoties uz iepriekšējās sadaļas rezultātiem, tika izvēlēta 250 mg Ca-Alg aerogela deva, lai to turpmāk novērtētu ilgstošas ​​(15 dienas) iedarbības pētījumā. Wistar žurkām tika novērotas jebkādas tūlītējas vai aizkavētas nieru un/vai aknu blakusparādības. ietekmi, kas varētu rasties, attiecīgi pakļaujot Ca-Alg aerogelam vai Na-Alg iedarbībai. no. Katrai pārbaudītajai vielai tika izmantotas trīs dzīvnieku grupas, kas ietvēra kontroles, ārstēšanas un satelītgrupu. Kontroles grupā bija 6 Wistar žurkas/grupa (3 tēviņi un 3 mātītes), savukārt ārstēšanas un satelītgrupas sastāvēja no 10 Wistar žurkām/grupā (5 tēviņi un 5 mātītes). Wistar žurkas ārstēšanas grupās saņēma 250 mg testējamo vielu (Ca-Alg airgel vai Na-Alg) dienas devu 15 dienas, un tās tika nogalinātas 16. dienā. Kamēr satelītgrupas tika ārstētas tikpat ilgi. tāpat kā ārstēšanas grupām, bet drīzāk tika novēroti vēl 15 dienas pēc ārstēšanas, un tie tika nogalināti 30. dienā.

Ir vērts pieminēt, ka nebija iespējams paralēli veikt divus Ca-Alg aerogela un Na-Alg pētījumus. Šī iemesla dēļ nebija ērti izmantot vienu kontroles grupu abām. Šīs kontroles grupas saņēma perorālo fosfāta buferšķīdumu tikai 15 dienas un pēc tam tika uzraudzītas vēl 14 dienas. Kā īslaicīgs eksperiments, Ca-Alg aerogela un Na-Alg cietie pulveri tika arī suspendēti fosfāta buferšķīdumā (pH 7, 4) un labi sajaukti tieši pirms perorālās lietošanas. Visām grupām ievadīšana žurkām tika uzsākta katru dienu vienā un tajā pašā laikā, izmantojot orālo zondi.

Klīniskā un uzvedības novērošana

Saskaņā ar ESAO vadlīnijām 407 dzīvnieki tika katru dienu uzraudzīti, lai atklātu jebkādas patoloģiskas klīniskas pazīmes vai izmaiņas uzvedībā visa pētījuma perioda laikā, īpašu uzmanību pievēršot pirmajās četrās stundās pēc testējamās vielas ievadīšanas. Dzīvnieki satelīta un kontroles grupās tika novēroti vēl 15 dienas bez ārstēšanas. Satelīta grupa ļauj noteikt jebkādas vēlīnās klīniskās pazīmes, kas liecina par ietekmi uz aknām un/vai nierēm, mērot sārmainās fosfatāzes (ALP) un kreatinīna līmeni.

Seruma bioķīmijas un fekāliju analīzes

Spānija. Asins paraugi tika savākti no Wistar žurku orbitālajām sinusa vēnām, kuras pēc tam izmantoja seruma sadalīšanai. Šis savāktais serums no paraugiem tika pārnests uz sterilām Eppendorf mēģenēm un uzglabāts dziļā sasaldē, lai turpmāk pārbaudītu bioķīmiskos parametrus. Katru otro dienu tika savākti arī fekāliju paraugi, lai izpētītu izmaiņas mikrobu kopienas struktūrā. Izkārnījumi tika savākti tīrās sterilās 15 ml mēģenēs ar skrūvējamu vāciņu un tika tieši turētas -20˚C temperatūrā, līdz tika savākti visi paraugi. 15-dienu atkārtotas devas pētījumam katru nedēļu tika savākti tikai asins paraugi, lai noteiktu sārmainās fosfatāzes (ALP) un kreatinīna līmeni, tas ir, 0 dienā, 7. dienā, 14. dienā, 21. diena un 30. diena (21. un 30. diena attiecās tikai uz kontroles un satelītgrupām).

Zarnu mikrobu kopienas analīze

DNS ekstrakcija no savāktajiem fekāliju paraugiem tika veikta, izmantojot MO BIO PowerMaxSoil DNS izolācijas komplektu (MO BIO Laboratories, ASV), ievērojot ražotāja norādījumus. Pēc tam tika veikta polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) attīrīšana un genoma DNS (gDNS) sekvencēšana, izmantojot Mr. DNA Lab (Molecular Research LP, ASV). 16S rRNS gēna PCR amplifikācija un turpmākā sekvencēšana tika veikta, izmantojot Illumina. 16SrRNS gēna V4 mainīgā reģiona PCR primeri ill27F mod (AGRGTTTGATCMTGGCTCAG)/ill519R un mod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) ar svītrkodu uz priekšējā primera tika izmantoti 30 ciklos, izmantojot HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, ASV). Pēc amplifikācijas PCR produkti tika pārbaudīti 2 procentu agarozes gēlā, lai noteiktu amplifikācijas panākumus un joslu relatīvo intensitāti.

Pēc tam apvienotais un attīrītais PCR produkts tika izmantots, lai sagatavotu Illumina DNS bibliotēku. Sekvencēšana tika veikta ar MR DNS, izmantojot mikrobiomu sekvencēšanu (MiSeq), ievērojot ražotāja norādījumus. Sekvencētie dati tika apstrādāti, izmantojot MR DNS analīzes cauruļvadu. Īsāk sakot, sekvences tika apvienotas, pēc tam tika iztukšotas svītrkodus, pēc tam tika noņemtas sekvences < 150="" bpas,="" kā="" arī="" sekvences="" ar="" neskaidriem="" bāzes="" izsaukumiem.="" secības="" tika="" noņemtas,="" tika="" ģenerētas="" operatīvās="" taksonomiskās="" vienības="" (out)="" un="" noņemtas="" himēras.="" otu="" tika="" definēti,="" apvienojot="" klasterus="" ar="" 3="" procentu="" atšķirību="" (97="" procentu="" līdzība).="" galīgie="" otu="" tika="" taksonomiski="" klasificēti,="" izmantojot="" blastn,="" salīdzinot="" ar="" atlasīto="" datu="" bāzi,="" kas="" iegūta="" no="" rdp-ii="" un="" ncbi.="" hierarhiskajai="" klasterizācijai="" tika="" izmantota="" dažādu="" statistisko="" analīžu="" pakotne,="" kas="" iekļauta="" programmatūrā="" "r"="" (versija="" 3.5.1,="" vegan="">