Nieru D vitamīna un ar fosfatonīnu saistīto gēnu izpausme aitu osteoporozes modelī

Lūdzu sazinietiesoscar.xiao@wecistanche.comlai iegūtu vairāk informācijas

Abstract:Osteoporoze ir nozīmīga sabiedrības veselības problēma visā pasaulē, un aptuveni 3/4 gadījumu rodas osteoporoze pēcmenopauzes periodā estrogēna deficīta dēļ. Šajā pētījumā 18 vecām merino aitām tika veikta olnīcu izņemšana, bet 10 bija kontroles. Trīs no aitām, kurām veikta olnīcu izņemšana, katru nedēļu tika ārstētas ar 400 mg metilprednizolona 5 mēnešus, bet trīs — ik nedēļu 2 mēnešus, kam sekoja 3-mēneša atveseļošanās periods. Pēc 2 mēnešiem pieci kontroles dzīvnieki un seši dzīvnieki, kuriem tika veikta olnīcu izņemšana, tika eitanizēti. Pēc 5 mēnešiem visas atlikušās aitas tika eitanāzijas. Nieru paraugi tika savākti pēcnāves NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1Illc, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA un NCX1 qPCR analīzei. Aitām, kurām veikta olnīcu izņemšana, bija ievērojami lielāka VDR ekspresija, salīdzinot ar citām grupām. Aitām, kurām veikta olnīcu izņemšana, kas tika ārstēta ar glikokortikoīdiem 2 mēnešus, kam sekoja eitanāzija 5 mēnešos, tika konstatētas būtiskas atšķirības TRPV5, CYP24A1 un kloto gēna ekspresijā, salīdzinot ar citām grupām. Atšķirības kloto izteiksmē bija visizteiktākās pēc korekcijas atkārtotiem mērījumiem (p=0.1). Klotho ir pazīstams kā "pret-novecošanās" hormons un ir iesaistīts kalcija un fosfora metabolismā. Kloto var būt iesaistīts kaulu minerālā blīvuma atjaunošanā aitām, kurām veikta olnīcu izņemšana un kuras 2 mēnešus ārstēja ar glikokortikoīdiem, kam seko eitanāzija 5 mēnešus. Ieteicams veikt turpmākus pētījumus par kloto lomu.

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

Atslēgvārdi:osteoporoze; aitas; D vitamīns; fosfatēšana; qPCR; kalcija metabolisms; fosfora metabolisms; klotho

1. Ievads

Osteoporoze ir nozīmīga sabiedrības veselības problēma pasaules iedzīvotāju novecošanai, kas arvien vairāk noveco, Amerikas Savienotajām Valstīm 205. gadā izmaksājot gandrīz 17 miljardus ASV dolāru, un tiek prognozēts, ka 2025. gadā tas pieaugs līdz 25 miljardiem ASV dolāru [1,2]. Aptuveni 70-75 procentus no osteoporozes slodzes izraisa sieviešu pēcmenopauzes osteoporoze [1], primārā osteoporoze, kur estrogēna deficīts samazina kaulu veidošanos un palielina kaulu rezorbciju, kā rezultātā samazinās kaulu masa un kaulu trauslums [3] . Osteoporoze var rasties arī īpašu iemeslu dēļ, piemēram, ārstēšana ar glikokortikoīdiem. Aita ir vispāratzīts liels dzīvnieku modelis dažādām cilvēka skeleta slimībām, tostarp osteoporozei[4]. Viena no liela dzīvnieku modeļa, piemēram, aitas, priekšrocībām ir iespēja pārbaudīt ortopēdiskos implantus, ķirurģiskās metodes un biomateriālus. [4] Turklāt aitai ir salīdzinoši zemas izmaksas, tās ir viegli apstrādājamas un nodrošina bagātīgu materiālu testēšanai. [4,5].

Visizplatītākie osteoporozes modeļi ir aitas, kurām 12 mēnešus pēc operācijas veikta olnīcu izņemšana, un 6-mēneša olnīcu izņemšanas aita, kuras uzturā lieto kalcija un D vitamīna deficītu un saņem glikokortikoīdus[4]. Izmantojot zināmu osteoporozi izraisošu faktoru kombināciju, tostarp olnīcu izņemšanu, ārstēšanu ar glikokortikoīdiem un diētu ar zemu kalcija līmeni, mēs esam spējuši izveidot aitu osteoporozes modeli tikai 5 mēnešos [6,7], tādējādi samazinot mājokli, darbaspēku, un barības izmaksas, kas saistītas ar modeļa izstrādi. Šajā modelī tika konstatēts, ka ovariektomija palielina I tipa kolagēna C-gala telopeptīdu (CTX-I, kaulu rezorbcijas marķieris) un osteokalcīna (kaulu apgrozījuma marķieris) koncentrāciju serumā, salīdzinot ar kontroles aitām. Aitām, kuras saņēma glikokortikoīdu terapiju 2 mēnešus, bija augstāka CTX-I koncentrācija serumā un zemāka osteokalcīna koncentrācija serumā. Turklāt mugurkaula augšstilba un jostas daļas kaulu blīvums un proksimālā stilba kaula kopējais un trabekulārais tilpuma kaulu minerālais blīvums bija zemāks eksperimentāli ārstētajās grupās, salīdzinot ar kontroles grupām, īpaši ar glikokortikoīdu ārstētām aitām, kurām veikta olnīcu izņemšana [6]. Tika konstatēts, ka aminoskābju un lipīdu metabolisms ir izmainīts arī aitām, kurām veikta olnīcu izņemšana un kuras ārstētas ar glikokortikoīdiem [7].cistanche wirkungLīdzīgas izmaiņas ir konstatētas arī citos aitu osteoporozes modeļos [8].

Cistanche var novērst novecošanos

Uz D vitamīnu reaģējošie gēni un fosfatēšanas sistēma iepriekš nav pētīti aitu modeļos ar olnīcu izņemšanu. D vitamīns, kura aktīvā forma ir 1,25-dihidroksivitamīns, galu galā palielina jonizētā kalcija un fosfora koncentrāciju plazmā, saistoties ar D vitamīna receptoru (VDR)-retinoīda X receptoru heterodimēru un mainot daudzu vitamīnu izpausmes. Uz D reaģējoši gēni, piemēram, kalciju saistoši proteīni (kalbindīns D9 un 28k (CalD9k, CalD28k)) un kalcija kanāli (pārejoša receptoru potenciāla katjonu kanālu apakšģimenes V loceklis 5 un 6 (TRPV5, TRPV6), plazmas membrānas kalcija ATPāze (PMCA) , nātrija-kalcija apmaiņas 1(NCX1)[9]. 1,25-dihidroksivitamīna D ražošana ir stingri regulēts posms, kurā nieru lo hidroksilāze (CYP27B1) katalizē 25-hidroksivitamīna D pārveidi. 1,25-dihidroksivitamīns D, un enzīms 24-hidroksilāze (CYP24A1) sadala gan 25-hidroksivitamīnu D, gan 1,{29}}dihidroksi vitamīnu D neaktīvos blakusproduktos.cistanche LielbritānijāFosfatēšanas sistēma kontrolē arī fosfora un kalcija koncentrāciju plazmā[10]. Šajā sistēmā linčpins ir fibroblastu augšanas faktors 23, ko ražo osteocīti kaulos un galvenokārt kontrolē fosfora koncentrāciju plazmā, saistoties ar kloto kofaktoru, lai samazinātu nātrija-fosfāta līdztransportētāju (NPT1, NPT2a, NPT2c) ekspresiju. [11]. Parathormona un 1,25-dihidroksi vitamīna D savstarpēji saistītās iedarbības dēļ FGF23 ietekmes uz kalcija metabolismu noteikšana ir bijusi sarežģīta, taču ir pierādījumi, kas liecina, ka tas var regulēt kalcija uzsūkšanos zarnās un nierēs. kalcija reabsorbcija[12,13].

Glikokortikoīdi daudzējādā ziņā ietekmē kalcija un fosfora metabolismu, tostarp kavē kalcija uzsūkšanos zarnās, samazina kalcija reabsorbciju nierēs un fosfora reabsorbciju nierēs [14-16]. Turklāt maz pētījumu ir pētījuši estrogēna deficīta ietekmi uz D vitamīnu reaģējošiem gēniem un fosfatēšanas sistēmu [17, 18].

Šis olnīcu noņemšanas diēta ar zemu kalcija saturu, ar glikokortikoīdiem ārstēto aitu osteoporozes modelis sniedza iespēju iegūt provizorisku informāciju par šīs ārstēšanas ietekmi uz fosfatēšanas un D vitamīnu reaģējošo gēnu ekspresiju aitu nierēs. Šī pētījuma mērķi bija divi: (1) noteikt, vai ovariektomija vai ovariektomija un ārstēšana ar glikokortikoīdiem mainīja D vitamīna un ar fosfātu saistīto gēnu ekspresiju nierēs; (2) noteikt attiecības starp nieru D vitamīnu un ar fosfātu saistītajiem gēniem, seruma D vitamīns un seruma kaulu maiņas marķieri (CTX-I un osteokalcīns).

2. Materiāli un metodes

Iepriekš ir publicētas detalizētas metodes osteoporozes aitu modeļa izstrādei ar olnīcu izņemšanu un glikokortikoīdiem ārstētu aitu [6]. Īsumā, vecas merino aitas (7-9 gadus vecas, n=28) tika nejauši iedalītas grupās: kontroles (n=10) olnīcu izņemšana (OVX) (n=12), ovariektomija un glikokortikoīdu terapija (40 mg metilprednizolona subkutānas injekcijas veidā) ik mēnesi 2 mēnešus, kam seko bez ārstēšanas 3 mēnešus (n=3) un glikokortikoīdu terapija (400 mg metilprednizolona) reizi mēnesī 5 mēnešus (n{12}}) .citrusaugļu bioflavonoīdiAitas tika izmitinātas kūtī un barotas ar kontroles (115 g/kg kalcija; 2,2 g uz aitu dienā) vai ar zemu kalcija līmeni (5 g/kg kalcija; 1 g uz aitu dienā) aitu granulu koncentrāta barību [19]. Uzturēšanas prasības negrūsnām aitām ir 1,2 g uz aitu dienā[19].

Asins paraugi tika savākti, izmantojot jugulāro venipunkciju 2 mēnešus un 5 mēnešus pēc operācijas. Osteokalcīns tika mērīts, izmantojot Micro Vue Osteocalcin imūntesta komplektu, un CTX-I, izmantojot IDS Serum CrossLaps ELISA komplektu, kā ziņots iepriekš [6]Kopējā kalcija un fosfora koncentrācija serumā tika mērīta, izmantojot spektrofotometriju ar AU680 klīniskās ķīmijas analizatoru (Beckman Coulter, Brea , CA, ASV). 25-hidroksivitamīna D koncentrācija serumā tika mērīta, izmantojot izotopu atšķaidīšanas šķidruma hromatogrammu; masspektrometriju Endolab, Canterbury Health Laboratories, Kraistčērča, Jaunzēlande.

Pēc mēnešiem 5 aitas no kontroles grupas un 6 aitām no OVX grupas tika eitanāzētas un veiktas autopsija. 5 mēnešos tika eitanāzijas arī atlikušās aitas (kontroles grupa n =5, OVX grupa n=6, OVX plus 2 miljoni glikokortikoīdu n=3 un OVX plus 5 miljoni glikokortikoīdu n=5 ) un veikta autopsija. Nieru paraugi tika savākti 30 minūšu laikā pēc nāves un sadalīti divās daļās, vienu paraugu ievietojot 10% neitrālā buferētā formalīnā un apstrādājot histoloģijai, bet otru paraugu sasaldēja šķidrā slāpeklī un uzglabāja -80 grādu temperatūrā līdz hematoksilīna un Primārais autors pārbaudīja ar eozīnu krāsotas nieru sekcijas un apstiprināja, ka nav nozīmīgu bojājumu.

Visas eksperimentālās procedūras apstiprināja Masejas universitātes Dzīvnieku ētikas komiteja (apstiprinājuma numurs 14/103), un tās tika veiktas saskaņā ar Ētiskās uzvedības kodeksu dzīvu dzīvnieku izmantošanai pētniecībā Massey University, Palmerston North, Jaunzēlande.

RNS ekstrakcija un qPCR tika veikta, kā aprakstīts iepriekš [20,21]. Īsumā, Tri Reagent (Gigma-Aldrich Inc, Merck KGaA, Darmštate, Vācija) tika izmantots RNS ekstrahēšanai saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Genomiskā DNS tika noņemta ar Ambion Turbo DNS nesaturošu (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. RNS koncentrācija tika noteikta, izmantojot Qubit 2.0 fluorometru un Qubit RNA plaša diapazona testu komplektu (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ASV), un RNS kvalitāte tika novērtēta, nosakot attiecību 260/280 un palaižot. uz agarozes želejas. cDNS sintezēšanai tika izmantots Transcriptor pirmās ķēdes cDNS sintēzes komplekts (Roche). Katrs 20 μL reakcijas maisījums saturēja 600 ng RNS, 2,5 μM oligo (dT), 8 mM RT reakcijas buferšķīduma, 1 mM dNTP, 10 U reversās transkriptāzes, 20 U RNāzes inhibitoru un RNāzes nesaturošu ūdeni. Reakcija tika veikta 55 grādos 30 minūtes, 85 grādos 5 minūtes un pēc tam atdzesēta 4 grādos, izmantojot Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ASV). Reāllaika qPCR tika veikta, izmantojot StepOne Plus reāllaika PCR iekārtu (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA, ASV). Katrs PCR maisījums saturēja 5 ul Power SYBR Green PCR galvenā maisījuma (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ASV), tiešos un reversos praimerus S1 tabulā norādītajās koncentrācijās, 10 ng cDNS un pēc tam uzpildīja līdz 10 μL. ar RNāzi, ūdeni bez DNāzes. PCR protokols sastāvēja no 95 grādiem 20 s, 40 cikliem pie 95 grādiem un 60 grādiem un, visbeidzot, kušanas līknes diapazonā no 60 grādiem līdz 95 grādiem ar sildīšanas ātrumu 0, 3 grādi / 15 s. Ūdens un reakcijas maisījums bez reversās transkriptāzes tika iekļauti kā negatīvās kontroles katrā PCR darbībā, un visi paraugi tika veikti divos eksemplāros. Tika novērtēti šādi gēni: NPT1, PTH1R, NPT2a, NPT2c, Klotho, FGFR1IIC, VDR, CYP24A1, CYP27B1, TRPV5, TRPV6, CalD9k, CalD28k, PMCA un NCX1. Iepriekš tika konstatēts, ka PKG1 un SDHA ir stabili ekspresēti aitu nierēs [20], un paraugi tika normalizēti attiecībā pret šo gēnu ekspresiju un gēnu efektivitāti, izmantojot 2-AACt metodi [22].

Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot R Studio 1.3.1093[23] ar R versiju

4.0.3 un tidyverse, nlme 3.1-150 un Gerijs

2.1.2 pakas. Lineārie modeļi tika piemēroti log10 pārveidotajiem gēnu krokas ekspresijas datiem. Pirmajā modelī gēnu ekspresija bija iznākuma mainīgais, savukārt grupa (kontrole vai OVX, bet izņemot ar glikokortikoīdiem ārstētas aitas) un laiks (eitanizēta 2 m vai 5 m attālumā) bija atkarīgi mainīgie, iekļaujot mijiedarbības terminu (grupa: laiks). Otrajā modelī gēnu ekspresija bija iznākuma mainīgais, savukārt grupa (kontrole, OVX, OVX ar glikokortikoīdu ārstēšanu 2 m un OVX ar glikokortikoīdu ārstēšanu 5 m) bija atkarīgais mainīgais.cynomorium priekšrocībasTā kā tika pārbaudīti vairāki iznākuma mainīgie (gēni) attiecībā uz atšķirībām starp grupām, p-vērtības tika pielāgotas vairākkārtējai testēšanai, izmantojot secīgo Holma procedūru [24]. Kalcija, fosfora un 25-hidroksivitamīna D koncentrācijas serumā tika pārbaudītas gēnu ekspresijas modeļos, taču tās nebija nozīmīgas un, ņemot vērā būtisku atšķirību trūkumu starp grupām, tika noņemtas. Turklāt tika izmantota galveno komponentu analīze, lai novērtētu, vai log10 transformētās gēnu krokas ekspresijas dati atšķiras atkarībā no grupas, eitanāzijas laika vai 25-hidroksivitamīna D koncentrācijas serumā. Spīrmena pāru korelācija un izkliedes diagrammas tika izmantotas, lai pētītu korelāciju starp log10 transformētā gēna krokas ekspresijas datiem un seruma analītiem.

3. Rezultāti

3.1. Ovariektomijas, laika kopš olnīcu noņemšanas un ārstēšanas ar glikokortikoīdiem ietekme uz kalcija, fosfora un 25-hidroksivitamīna D koncentrāciju serumā

Pilni seruma kalcija, fosfora un 25-hidroksivitamīna D koncentrācijas rezultāti katrā grupā ir parādīti 1. attēlā."Seruma kalcija, fosfora un 25-hidroksivitamīna D koncentrācijās nebija būtisku atšķirību starp ovariektomijas un zema kalcija diētas grupa un atbilstoša kalcija diētas grupa bez olnīcu noņemšanas, un laiks kopš olnīcu izņemšanas 2 mēneši un 5 mēneši. Šie rezultāti liecina, ka olnīcu izņemšana kopā ar diētu ar zemu kalcija saturu neietekmēja kalcija koncentrāciju serumā. Aitas, kurām tika veikta olnīcu izņemšana un mēnešiem ilgi ārstēti ar glikokortikoīdiem, kam sekoja eitanāzija 5 mēnešos, bija ievērojami zemāka kalcija koncentrācija serumā (p =0.0462, adj R20.13), salīdzinot ar 5 m olnīcu izņemšanu ar diētu ar zemu kalcija līmeni un 5 m olnīcu izņemšanu diēta ar zemu kalcija līmeni un ar glikokortikoīdiem ārstētas aitas. Tomēr datu izpēte liecina, ka tas varētu būt saistīts ar vienu dzīvnieku, kuram bija hipokalciēmija (1,52 mmol/L, atsauces diapazons 2.0-2,7 mmol/L); noņemšana no šis dzīvnieks noņēma jebkādu nozīmi.tuksneša hiacinteVisām pārējām aitām kalcija koncentrācija serumā bija atsauces diapazonā. Fosfora vai 25-hidroksivitamīna D koncentrācijā serumā atšķirības netika novērotas 5 m olnīcām un ar glikokortikoīdiem ārstētām aitām.

3.2.Ovariektomijas un laika kopš olnīcu noņemšanas ietekme uz D vitamīna un ar fosfatonīnu saistīto gēnu ekspresiju nierēs

D vitamīna un ar fosfātu saistīto gēnu gēnu ekspresija nebija saistīta ar ovariektomiju vai laiku kopš ovariektomijas (2. attēls). Izņēmums bija D vitamīna receptors (VDR), kur OVX grupai bija ievērojami lielāka VDR ekspresija (p=0.05, adj R2 0.16); tomēr šī nozīme izzuda pēc pielāgošanas atkārtotiem pasākumiem.

3.3. Ovariektomijas un glikokortikoīdu terapijas ietekme uz D vitamīnu un ar fosfatonīnu saistīto gēnu ekspresiju NIERĒS 5 mēnešus pēc operācijas

Pilni rezultāti ir parādīti 3. attēlā. PTH1R ekspresija bija ievērojami lielāka OVX aitām, kuras 5 mēnešus tika ārstētas ar glikokortikoīdiem, salīdzinot ar citām grupām (p=0.04, adj R40.18), savukārt TRPV5 (p{ {8}}.01, adj R20.31) un CYP24A1(p=0.005, adj R40.40) ekspresija bija ievērojami lielāka OVX aitām, kuras 2 mēnešus tika ārstētas ar glikokortikoīdiem, salīdzinot ar citām grupām.

Kloto ekspresija bija ievērojami atšķirīga visās grupās (p =0.01, adj R20.48), ar zemāko ekspresiju kontroles aitām. Visaugstākā izteiksme bija OVX aitām, kuras tika ārstētas ar glikokortikoīdiem 2 mēnešus (p =0.002), kam sekoja OVX aitas (p=0.008) un pēc tam OVX aitām, kuras 5 mēnešus ārstēja ar glikokortikoīdiem (p{). {10}}.03). Tomēr, pielāgojot atkārtotiem mērījumiem, gēnu ekspresija šajās grupās būtiski neatšķīrās, un klots uzrādīja vislielāko atšķirību OVX aitām, kuras tika ārstētas ar glikokortikoīdiem 5 mēnešus (p=0.1).

Tāpat VDR izteiksme bija ievērojami atšķirīga visās grupās (p=0.03, adj R20.38). Vislielākā VDR izpausme bija OVX aitām, kuras vairākus mēnešus tika ārstētas ar glikokortikoīdiem (p=0.009), kam sekoja OVX aitām (p=0.01), pēc tam OVX aitām, kas tika ārstētas ar glikokortikoīdiem 5 mēnešus. (p=0.05), un zemākā izteiksme bija kontroles aitām.

3.4. Vispārējās gēnu ekspresijas PCA starp grupām

OVX, kontroles un eitanāzijas PCA analīzē pēc 2 un 5 mēnešiem neizdevās izdalīt dažādas grupas (S1 attēls). PCL un PC2 izskaidroja 69,6 procentus no variācijas. Tāpat arī PCA analīze grupām, kuras tika eitanāzētas 5 mēnešos, arī neizdevās nodalīt dažādas grupas. PCL un PC2 izskaidroja 53,2 procentus no variācijas (S2. attēls). PCA analīze parādīja, ka kopējo gēnu ekspresiju nevar izskaidrot ar kalcija un fosfora 25-hidroksivitamīna D koncentrāciju serumā (S3. attēls).

3.5. Pāru korelācija starp visiem analītiem un gēnu ekspresiju

Neatkarīgi no ovariektomijas statusa, kalcija satura diētā, laika kopš ovariektomijas (2 m vai 5 m) vai ārstēšanas ar glikokortikoīdiem statusa, NPT1 gēna ekspresija bija nozīmīgi un pozitīvi korelēta (p<001) with="" pth1r,="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" trpv5,="" cald9k,="" and="" cald28k="" gene="" expression.="" pth1r="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><001) with="" npt2c,="" klotho,="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" npt2a="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" fgfr1wic.="" klotho="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cyp24a1,="" cyp27b1,="" trpv5,="" and="" cald28k.="" cyp24a1="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" trpv5="" and="" cald28k.="" trpv6="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cal9dk="" and="" pmca,="" while="" cal9dk="" was="" significantly="" positively="" correlated=""><0.001) with="" cald28k="" and="" pmca.="" none="" of="" the="" serum="" analytes="" measured="" (osteocalcin,="" ctx,="" 25ohd,="" ca,="" and="" p)="" were="" correlated="" with="" the="" expression="" of="" any="" genes.="" the="" full="" pairwise="" correlations="" are="" shown="" in="" figure="">

4. Diskusija

Šī pētījuma rezultāti liecina, ka vislielākā ietekme uz gēnu ekspresiju ir bijusi ovariektomizētu aitu ārstēšanai ar glikokortikoīdiem, savukārt pašai ovariektomijai un laikam kopš ovariektomijas (2 un 5 mēneši) bija neliela ietekme uz gēnu ekspresiju. Viendimensiju analīzē tika novērotas būtiskas atšķirības TRPV5, CYP24A1 un kloto gēna ekspresijā aitām, kurām olnīcu izņemšana tika ārstēta ar glikokortikoīdiem 2 mēnešus, kam sekoja eitanāzija 5 mēnešos, un PTH1R aitām, kurām veikta olnīcu izņemšana un kuras 5 mēnešus ārstēja ar glikokortikoīdiem. Atšķirības bija visizteiktākās kloto izteiksmē pēc korekcijas atkārtotiem pasākumiem.

Šo aitu proksimālā stilba kaula kvantitatīvā perifērā datortomogrāfija parādīja, ka ovariektomija samazināja kopējo tilpuma kaulu minerālo blīvumu (vBMD) par 8 procentiem, ovariektomija ar glikokortikoīdu ārstēšanu 5 mēnešus par 27 procentiem un olnīcu izņemšana ar glikokortikoīdu un glikokortikoīdu lietošanu 5 mēnešus. par 13 procentiem [6]. Interesanti, ka trabekulārais KMB, trabekulārais laukums un trabekulārā kaula minerālvielu saturs bija līdzīgs vai lielāks nekā kontrolēm aitām, kurām veikta olnīcu izņemšana, kas tika ārstēta ar glikokortikoīdiem 2 mēnešus un eitanāzija tika veikta 5 mēnešos, kas liecina par kaulu masas atjaunošanos [6]. Glikokortikoīdiem ir vairākas labi dokumentētas ietekmes uz kauliem, kas izraisa glikokortikoīdu izraisītas osteoporozes attīstību. Šie efekti ietver osteoblastu cilmes šūnu un osteoblastu veidošanās kavēšanu, osteoblastu apoptozes palielināšanos un osteoīdu ražošanas samazināšanos, kas viss samazina kaulu veidošanos [25, 26]. Tajā pašā laikā glikokortikoīdi palielina kaulu rezorbciju, samazinot OPG ekspresiju, palielinot RANKL ekspresiju, palielinot osteoklastu veidošanos, samazinot osteoklastu apoptozi un palielinot osteoklastu katepsīnu un matricas metaloproteināžu sekrēciju [25, 26].

Klotho ir neatņemama fosfatēšanas sistēmas sastāvdaļa, tādējādi saistās ar fibroblastu augšanas faktoru 23 (FGF23) nierēs. Pēc tam kloto-FGF23 komplekss saistās ar FGFR1IIC receptoru, kas ierosina vairākus šūnu ceļus un galu galā izraisa nieru 24-hidroksilāzes (CYP24A1) ekspresijas paaugstināšanos un nieru la-hidroksilāzes (CYP27B1) un nieru kanāliņu pazeminātu regulēšanu. Na/P II kotransportieri (NPT2a un 2c) [10]. Paaugstināta kloto ekspresija (atšķirības, kas bija visizteiktākās pēc pielāgošanas atkārtotiem mērījumiem) aitām, kuras 2 mēnešus lietoja glikokortikoīdus un pēc tam tika eitanāzētas 5 mēnešos, var izskaidrot palielināto CYP241 ekspresiju, kas novērota arī šajā aitu grupā, lai gan nav būtisku atšķirību 25OHD koncentrācija serumā.

Kloto ir pazīstams kā pretnovecošanās proteīns, un pelēm ar kloto deficītu ir zema kaulu veidošanās un kaulu rezorbcija, kas izraisa zemu kaulu apmaiņas osteopēniju [27, 28]. Turklāt specifiski kloto gēnu polimorfismi ir saistīti ar samazinātu kaulu minerālo blīvumu cilvēkiem [29, 30]. Šķīstošais klots pārregulē agrīnās augšanas reakcijas proteīnu 1 (EGR-1) un inducē kaulu diferenciācijas marķieru ekspresiju osteoblastu šūnu kultūrā [31] Turklāt glikokortikoīdi var nomākt fibroblastu augšanas faktoru 232]. Iespējams, lielākas kloto izpausmes aitām, kas lietoja glikokortikoīdus 2 mēnešus un pēc tam tika eitanāzētas 5 mēnešos, atspoguļo šīs aitas atveseļošanās procesu pēc glikokortikoīdu terapijas un, ņemot vērā tās lomu kaulu veidošanā un rezorbcijā, iespējams, ka tas ir galvenais kaulu atjaunošanās dzinējspēks. un tādējādi potenciāli cilvēku osteoporozes ārstēšanas mērķis.

Tomēr OVX aitām bija arī paaugstinātas kloto izpausmes, salīdzinot ar kontroles aitām. Līdzīgi viens pētījums ar pelēm ar aromatāzes deficītu parādīja, ka estrogēna deficīts paaugstināja kloto proteīna līmeni, un ārstēšana ar estradiolu samazināja kloto ekspresiju šajās pelēs[17]. Pelēm estrogēns samazina NPT2a regulēšanu procesā, kas nav atkarīgs no kloto/FGF23 un PTH[18]. Tomēr šajā pētījumā šis efekts netika novērots aitām, kurām veikta olnīcu izņemšana. Pretējā gadījumā ir maz literatūras par estrogēna deficīta ietekmi uz kloto. Turpmākajos pētījumos būtu jāpārbauda gan olnīcu izņemšanas, gan glikokortikoīdu ietekme uz kloto ekspresiju, ņemot vērā tās lomu novecošanā un hroniskas nieru slimības gadījumā.

TRPV5 ir epitēlija kalcija kanāls, kas galvenokārt izpaužas nieru distālajās vītņotajās kanāliņos un savienojošajos kanāliņos [20, 33]. TRPV5 kanāls ir konstitutīvi atvērts, bet tiek pakļauts kalcija atkarīgai inaktivācijai saistībā ar kalmodulīnu, kalciju jutīgu proteīnu [34]. TRPV5 ekspresiju var palielināt ar PTH un 1,25(OH)D3 [35]. Vienai aitai, kas 2 mēnešus lietoja glikokortikoīdus un pēc tam 5 mēnešos tika veikta eitanāzija, bija hipokalciēmija, un kalcija koncentrācija serumā šīs grupas aitām bija ievērojami zemāka, salīdzinot ar citām grupām. Tāpēc ir iespējams, ka palielināta TRPV5 ekspresija ir samazināta kalcija koncentrācija serumā šiem dzīvniekiem. Ir pierādīts, ka glikokortikoīdi samazina kalcija uzsūkšanos zarnās, samazinot TRPV6 un CalD9k ekspresiju [36,37] un palielinot kalcija izdalīšanos ar urīnu [14], taču klīniski nozīmīga hipokalciēmija veseliem indivīdiem ir retāk sastopama. Tāpat aitām ar zemu kalcija koncentrāciju serumā netika novērotas hipokalciēmijas tetānijas klīniskas pazīmes. Alternatīvi, palielināta TRPV5 ekspresija aitām ar glikokortikoīdiem 2 mēnešus un pēc tam eitanāzija 5 mēnešos varētu atspoguļot atveseļošanās procesu, kurā, lai aizstātu atgūto trabekulāro KMB, laukumu un kaulu minerālvielu saturu, ir nepieciešama palielināta kalcija rezorbcija no nierēm.

Aitām, kuras 5 mēnešus ārstēja ar glikokortikoīdiem, PTH1R ekspresija bija paaugstināta salīdzinājumā ar citām grupām. Turklāt, salīdzinot ar citām grupām, aitām grupā bija nelielas izteiksmes atšķirības. Lai gan netika novērotas atšķirības kalcija koncentrācijā serumā aitām, kuras tika ārstētas ar glikokortikoīdiem 5 mēnešus, iespējams, tas varētu būt saistīts ar pastiprinātu PTH un tā receptoru darbību. Glikokortikoīdu ietekme uz PTH sekrēciju un darbību nav skaidra. Dažos pētījumos ar cilvēkiem ir atklāts, ka ar glikokortikoīdiem ārstētiem pacientiem ir paaugstināta PTH koncentrācija serumā, kā arī samazināta kalcija uzsūkšanās, palielināta kalcija izdalīšanās ar urīnu un samazināta kaulu masa [38, 39]. Tomēr lielākajā daļā pētījumu nav konstatētas izmaiņas PTH koncentrācijā serumā cilvēkiem, kuri lieto glikokortikoīdus [38, 40, 41]. Viens pētījums ir parādījis, ka, iespējams, glikokortikoīdu ietekme ietekmē PTH sekrēciju, palielinoties pulsējošajai PTH sekrēcijai ar glikokortikoīdiem ārstētiem indivīdiem[4]. Citi ir arī parādījuši palielinātu PTH1R ekspresiju mezenhimālajās cilmes šūnās un osteoblastiem līdzīgās šūnās, reaģējot uz ārstēšanu ar deksametazonu [43, 44]. Tādējādi nieru PTH1R ekspresijas palielināšanās aitām, kuras 5 mēnešus ārstētas ar glikokortikoīdiem, iespējams, ir saistīta ar 5 mēnešu glikokortikoīdu ārstēšanu.

Lai gan ovariektomija apvienojumā ar nedaudz zemu kalcija diētu izraisīja minimālas izmaiņas gēnu ekspresijā, šķiet, ka tā mainīja VDR ekspresiju, jo aitām, kurām veikta olnīcu noņemšana ar mēreni zemu kalcija diētu, VDR ekspresija bija lielāka nekā kontroles aitām. Tas ir pretstatā pētījumam ar žurkām ar olnīcu izņemšanu, kurā žurkām, kuras baroja ar uzturu ar normālu kalcija līmeni, bija paaugstināta VDR ekspresija nierēs, savukārt tām, kuras baroja ar zemu kalcija diētu, VDR ekspresija bija samazināta [45]. Šajā aitu pētījumā ir grūti nošķirt ovariektomijas ietekmi uz VDR nieru ekspresiju no zema kalcija satura diētas ietekmes. Tomēr nebija būtisku atšķirību kalcija koncentrācijā serumā starp grupām (izņemot glikokortikoīdu grupu), kas liecina, ka nedaudz zema kalcija diētai bija minimāla ietekme un, iespējams, ietekme uz VDR ir saistīta ar olnīcu izņemšanu. Tomēr, lai izpētītu šīs attiecības, būs nepieciešami turpmāki pētījumi.

Divos iepriekšējos pētījumos ir pētītas atsevišķas attiecības starp gēniem, kas reaģē uz D vitamīnu, un ar fosfātu saistītajiem gēniem aitu nierēs [20, 21]. Tomēr attiecības starp D vitamīnu un fosfatēšanas ceļiem nav pārbaudītas. Interesanti, ka nozīmīgākās korelācijas starp gēniem, par kurām ziņots šajos divos dokumentos, attiecas arī uz gēnu attiecībām šajā aitu pētījumā, kas liecina par pētījumu rezultātu konsekvenci un attiecībām starp šiem gēniem.cistanche salsas ekstraktsNo interesantajām attiecībām, par kurām iepriekš nebija ziņots, kā varētu sagaidīt, ņemot vērā tā galveno lomu kalcija metabolismā, PTH1R ekspresija bija ļoti korelēta ar CalD28k, CalD9k, TRPV5 CYP27B1, CYP24A1, VDR, Klotho un NPT2c. Kloto ekspresija bija cieši saistīta ar TRPV5 gēnu ekspresiju, kas saskan ar citu literatūru, kas parāda, ka kloto pārregulē TRPV5 un veicina kalcija reabsorbciju nierēs [46, 47].

Diemžēl dažādas grupas nevarēja atdalīt, pamatojoties uz D vitamīnu reaģējošo un fosfatēšanas gēnu ekspresiju, izmantojot PCA analīzi. Tas, iespējams, ir saistīts ar šī pētījuma galveno ierobežojumu - mazo izlases lielumu. Tā kā katrā grupā ir tikai 3-6 dzīvnieki, iespējams, tas ir ierobežojis spēju noteikt atšķirības gēnu ekspresijā starp grupām.

5. Secinājumi

Šī pētījuma rezultāti liecina, ka visizteiktākās gēnu ekspresijas atšķirības bija nieru kloto ekspresijā aitām, kurām veikta olnīcu izņemšana un kuras 2 mēnešus ārstēja ar glikokortikoīdiem, kam sekoja 5 mēnešu atveseļošanās periods. Ņemot vērā, ka klots ir "pretnovecošanās" hormons un tam ir izšķiroša nozīme kalcija un fosfātu metabolismā, iespējams, ka šis hormons ir būtiski iesaistīts trabekulārā kaulu minerālā blīvuma un platības atjaunošanā ārstētajām aitām, un tāpēc tas var būt Osteoporozes ārstēšanas mērķis cilvēkiem. Tomēr ir vajadzīgi vairāk pētījumu par glikokortikoīdu un ovariektomijas ietekmi uz kloto.

Šis raksts ir izvilkts no Animals 2022, 12, 67. https://doi.org/10.3390/ani12010067 https://www.mdpi.com/journal/animals