Ekstracelulārā acidoze ierobežo viena oglekļa vielmaiņu un saglabā T šūnu cilmes

Skābo vielmaiņas atkritumu produktu uzkrāšanās audzēja mikrovidē kavē audzēju piepūšošo limfocītu (TIL) efektoru funkcijas. Tomēr joprojām nav skaidrs, kā skāba vide ietekmē T šūnu metabolismu un diferenciāciju. Šeit mēs parādām, ka ilgstoša skābes iedarbība pārprogrammē T šūnu intracelulāro metabolismu un mitohondriju piemērotību un saglabā T šūnu cilmes. Mehāniski paaugstināta ekstracelulārā acidoze pasliktina metionīna uzņemšanu un metabolismu, samazinot SLC7A5 regulēšanu, tādējādi mainot H3K27me3 nogulsnēšanos galveno T šūnu cilmes gēnu promotoros. Šīs izmaiņas veicina "stumbra veida atmiņas" stāvokļa saglabāšanu un uzlabo ilgstošu in vivo noturību un pretaudzēju efektivitāti pelēm. Mūsu atklājumi atklāj ne tikai negaidītu ekstracelulārās acidozes spēju saglabāt T šūnu cilmes līdzīgās īpašības, bet arī uzlabo mūsu izpratni par to, kā metionīna metabolisms ietekmē T šūnu cilmes.

cistanche augu paaugstinošā imūnsistēma

Noklikšķiniet šeit, lai skatītu Cistanche Enhance Immunity produktus

【Jautājiet vairāk】 E-pasts:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Audzēja antigēnam specifisku T šūnu adopcija ir būtisks progress vēža terapijas jomā, jo tā ir novedusi pie atsevišķu ļaundabīgu audzēju pilnīgas regresijas. Tās terapeitiskā efektivitāte lielā mērā ir atkarīga no pārnesto T šūnu noturības un diferenciācijas statusa1, 2. Mazāk diferencētas atmiņas T šūnas ir vēlamā populācija adoptīvai T šūnu pārnešanai (ACT), ņemot vērā to cilmes šūnām līdzīgās pašatjaunošanās un multipotences īpašības3, 4. Patiešām, ir pierādīts, ka cilmes veida atmiņas T šūnu izmantošana ACT nodrošina labāku pretaudzēju reakciju5. Salīdzinot ar galīgi diferencētām efektoru T šūnām, cilmes līdzīgām T šūnām ir atšķirīgas pazīmes6. Gan cilvēka, gan peles cilmes T šūnām ir raksturīga ar antigēnu saistītu molekulu ekspresija, tostarp ar augstu CD62L un CCR7 līmeni (7. atsauce). Mūsu izpratne par transkripcijas profiliem, epiģenētiskajām modifikācijām un vielmaiņas ceļiem, kas regulē cilmes līdzīgās T šūnas, pēdējos gados ir dramatiski attīstījusies 8–10. Ir ziņots, ka vairākiem transkripcijas faktoriem, piemēram, TCF1, KLF2 un LEF1, ir būtiska loma T šūnu cilmes vadīšanā vai uzturēšanā9. Proti, TCF1 ir galvenais transkripcijas faktors, kas veicina ilgstošas ​​atmiņas T šūnu veidošanos11. Hronisku infekciju laikā neliela TCF1+ cilmes veida T šūnu daļa uztur T šūnu reakciju pret sekundāro infekciju1,12. Epiģenētiskās izmaiņas nodrošina T šūnām iespēju gan uzsākt transkripcijas izmaiņas, kas ir atmiņas šūnu īpašību iegūšanas pamatā, gan uzturēt šos transkripcijas ekspresijas modeļus13. Vairāki pētījumi ir parādījuši, ka histona H3 trimetilēšana pie K4 (H3K4me3), kas ir ar aktivāciju saistīta modifikācija, tiek iegūta ar atmiņu saistītos gēnu lokusos, tostarp TCF7, KLF2, LEF1, CCR7 un SELL, diferencējot naivu CD{47. }} T šūnas pārvēršas atmiņas T šūnās, savukārt H3 trimetilēšana pie K27 (H3K27me3), kas ir represīva modifikācija, tiek zaudēta šajos lokosos13–15. Un otrādi, ar efektoriem saistītie gēni (GZMB, PRF1, IFNG un TBX21) uzrāda samazinātas represīvās un palielinātas aktivizējošās epiģenētiskās modifikācijas šajos lokusos efektoru T šūnās13, 16. Visbeidzot, uzkrājošie pierādījumi liecina, ka vielmaiņas ķēdes nosaka T šūnu likteņa lēmumus un veido to epiģenētiskos un funkcionālos stāvokļus17. Īslaicīgas efektoru T šūnas ir ļoti glikolītiskas un atkarīgas no viena oglekļa metabolisma 18, 19, turpretim cilmes tipa atmiņas T šūnām ir atšķirīgi vielmaiņas profili, kam raksturīga paaugstināta taukskābju oksidēšanās (FAO) un mitohondriju rezerves elpošanas spēja (SRC), galvenais. īpašības, kas saistītas ar ilgstošu noturību20–22. Tāpēc vielmaiņas pārprogrammēšana ir svarīga efektīvai cilmes iegūšanai un T šūnu ilgstošai izdzīvošanai.

cistanche priekšrocības vīriešiem - stiprina imūnsistēmu

Imūnsupresīvā audzēja mikrovide (TME), kam raksturīgs zems pH līmenis, hipoksija, glikozes trūkums un pienskābes bagātināšana, ir galvenā barjera, kas kavē pareizu T šūnu paplašināšanos, diferenciāciju un funkcionalitāti23, 24. Patiešām, TME izraisītais vielmaiņas stress pasliktina mitohondriju kapacitāti un piemērotību, izraisot intratumorālu T šūnu vielmaiņas mazspēju un disfunkciju 25–28. Interesanti, ka lielākā daļa audzēju infiltrējošo limfocītu (TIL) ir disfunkcionāli, bet nelielai daļai ir cilmes līdzīga atmiņa vai prekursoru īpašības 7, 29. Šī kātam līdzīgā TIL apakškopa saglabā proliferācijas potenciālu un noturību un ir saistīta ar labvēlīgu reakciju uz imūnās kontrolpunkta blokādi (ICB) un TIL-ACT cilvēkiem ar vēzi 11, 30. Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka paaugstināta ekstracelulārā acidoze (↑[H+ ]) nomāca T šūnu citolītisko aktivitāti gan in vitro, gan in vivo31–33. Turklāt skābajam TME ir ievērojama ietekme uz audzēju infiltrējošo mieloīdo šūnu, piemēram, dendritisko šūnu (DC) un ar audzēju saistīto makrofāgu (TAM) 34–36, aktivitāti un diferenciāciju. Tomēr ↑ [H+ ] ietekme uz T šūnu cilmes un vielmaiņas piemērotību joprojām nav zināma. Šeit mēs ziņojam, ka ilgstoša in vitro ↑[H+ ] iedarbība veicina cilvēka un peles cilmes veida CD8+ T šūnu diferenciāciju uz termināla efektora CD8+ T šūnu rēķina. Mēs noskaidrojām, ka ilgstoša ↑ [H+ ] terapija pārveido T-šūnu metabolismu un uztur mitohondriju elpošanas spēju. Turklāt pastāvīga ↑ [H+ ] iedarbība pasliktina metionīna uzņemšanu un vielmaiņu, kā rezultātā samazinās ar atmiņu saistītu gēnu H3K27me3 nogulsnēšanās, tādējādi veicinot “stumbra veida atmiņas” statusa saglabāšanu. Visbeidzot, ↑ [H+ ] apstākļos kultivētu T šūnu pārnešana uzrāda spēcīgu pretvēža aktivitāti in vivo atbilstoši to mazāk izsmeltajam fenotipam. Tādējādi mūsu pētījums atklāj ekstracelulārās acidozes negaidīto lomu T šūnu cilmes saglabāšanā, pārveidojot šūnu metabolismu un epiģenētiskos modeļus.

Rezultāti

↑[H+ ] iedarbība veicina CD8+ T šūnu cilmes veidošanos

Lai noteiktu, vai ārpusšūnu ↑[H+ ] ietekmē cilmes veida T šūnu diferenciāciju, mēs veicām galveno cilmes tipa fenotipu plūsmas citometrisko analīzi cilvēka T šūnām, kas kultivētas 12 dienas jebkurā kontroles barotnē, ↑[H+ ] barotnē, kas satur 10 mM pienskābi. (atdarinot laktāta koncentrāciju patofizioloģiskās situācijās23,35) vai skābā vidē (~pH 6,6, ar sālsskābi) (1.a att.). Lielāks cilmes veida CD8+ T šūnu īpatsvars, tostarp agrīnā atmiņa (CD45RO−CD27+ ) un centrālā atmiņa (CD45RO+ CD27+ ), tika novērota T šūnās, kas kondicionētas ↑. [H+ ] pret kontroles vidi (paplašinātie dati 1.a att.). Turklāt mēs atklājām, ka T šūnām, kas kultivētas ↑[H+ ] barotnē, bija lielāks cilmes veida šūnu (CCR7+ CD62L+ ) procentuālais daudzums (1.b attēls). Jāatzīmē, ka mēs novērojām ievērojami palielinātu TCF1 ekspresiju, kas ir galvenais faktors, kas veicina cilmes veida un centrālās atmiņas diferenciāciju, proteīna līmenī gan cilvēka, gan peles CD8+ T šūnās, kas pakļautas ↑[H+] iedarbībai (1.c attēls un Paplašinātie dati 1.b att.). Turklāt bija no [H+ ] koncentrācijas atkarīga ietekme uz CCR7 un TCF1 ekspresiju (paplašinātie dati 1.c att.). Saskaņā ar ↑[H+] kondicionēto T šūnu cilmes fenotipu šajās šūnās tika ievērojami samazināta intracelulārā interferona- (IFN-) un audzēja nekrozes faktora (TNF-) ražošana (1.d attēls).

Lai labāk pārbaudītu T šūnu diferenciācijas statusu, mēs veicām RNS sekvencēšanas (RNS-seq) analīzi un atklājām, ka ilgstoša in vitro ↑[H+ ] iedarbība izraisīja atšķirīgu transkripcijas profilu (paplašinātie dati 1.d attēls). ↑[H+ ] iedarbība izraisīja ievērojami samazinātu gēnu, kas kodē efektormolekulas, piemēram, PRF1, GZMB un IFNG, un koinhibējošā receptora BTLA ekspresiju (1.e, f attēls un paplašinātie dati 1.e att.). Turpretim ↑[H+ ] kultivētās T šūnās bija augstāka BACH2, CCR7, LEF1 un TCF7 ekspresija, kas korelē ar T šūnu stumbru (1.e, f att. un paplašinātie dati 1.e att.). Gēnu kopas bagātināšanas analīze (GSEA) parādīja, ka ↑[H+ ] iedarbības izraisītais transkripcijas modelis bija līdzīgs atmiņas T šūnām (1.g attēls un paplašinātie dati 1.f att.). Turklāt kvantitatīvā polimerāzes ķēdes reakcijas (qPCR) analīze apstiprināja palielinātu BACH2, KLF2, LEF1 un TCF7 mRNS ekspresiju pēc ↑[H+ ] apstrādes (1.h att.). Kopā šie novērojumi apstiprina faktu, ka ↑ [H+ ] apstrāde lielā mērā veido T šūnu transkripcijas profilus, lai izveidotu stumbru. Jāatzīmē, ka mēs atklājām, ka ↑ [H+ ] apstrāde kavē T šūnu proliferāciju un novirzīja šūnu cikla sadalījumu virzienā uz G1 fāzi un prom no S fāzes (papildu 1.a–c attēls). Pēc tam mēs pārbaudījām T šūnu aktivāciju pēc ↑[H+] apstrādes TCR stimulācijas laikā un atklājām, ka ↑[H+] iedarbībai nav būtiskas ietekmes uz T šūnu aktivācijas marķieru ekspresiju vai šūnu izmēru (papildu 2.a, b attēls). Turklāt mēs apstiprinājām, ka ↑ [H+ ] iedarbība pēc T šūnu aktivācijas joprojām var izraisīt T šūnu cilmes stāvokli (papildu 2.c–f attēls). Šie atklājumi izslēdz iespēju, ka T šūnas, kas pakļautas ↑ [H+ ], vienkārši ir izturīgas pret stimulāciju, nevis pieņem stumbram līdzīgu stāvokli.

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

Iepriekšējie ziņojumi ir parādījuši, ka skābā vide akūti kavē T šūnu citolītisko aktivitāti gan in vitro, gan in vivo 23, 31. Mēs arī atklājām, ka īslaicīga ↑ [H+ ] iedarbība pasliktināja citokīnu veidošanos, bet tai bija neliela ietekme uz cilmes veida fenotipu T šūnās (paplašinātie dati 1.g–i un papildu 3.a–c att.). Turklāt citokīnu ražošanas inhibējošā iedarbība, iedarbojoties ar ↑[H+ ], ir pārejoša un atgriezeniska, jo ↑[H+ ] noņemšana ātri atjauno T šūnu citokīnu ražošanu (paplašinātie dati 1.h att.). Tādējādi T šūnu efektora funkcijas kavēšana skābā vidē ir ļoti ātra, savukārt T šūnu cilmes pārprogrammēšanai nepieciešama ilgstoša ↑ [H+ ] iedarbība. Tā kā laktāts šķīdumā atrodas vai nu nedisociētā veidā (pienskābe), vai kā jonu sāls (nātrija laktāts), mēs pēc tam centāmies noteikt, vai nātrija laktātam ir līdzīga ietekme uz T šūnu cilmes struktūru, un konstatējām, ka nātrija laktāts arī veicināja stumbra pazīmes, lai gan tā efektivitāte bija daudz zemāka nekā apstrādei ar pienskābi (10 mM) (paplašinātie dati 1.j, k att. un papildu 4.a–f att.). Šie atklājumi liecina gan par ↑[H+ ] nozīmi, gan par tā atšķirību no laktāta jonu apstrādes CD8+ T šūnu cilmes veida fenotipa indukcijā.

1. att.|↑[H+ ] iedarbība atvieglo cilmes veida CD8+ T šūnu diferenciāciju. a Cilvēka T šūnu aktivācijas shēma norādītajos apstākļos: pH 7,4 (–↑[H+ ], kontrole), pH 6,6 (+↑[H+ ], sālsskābe) vai 10 mM pienskābes (+↑[H+ ]). PBMC, perifēro asiņu mononukleārās šūnas. b, reprezentatīvi CCR7 un CD62L ekspresijas profili cilvēka CD8+ T šūnās dažādos apstākļos 12. dienā. n=3 neatkarīgi paraugi. c, reprezentatīvās histogrammas un TCF1 ekspresijas kvantitatīva noteikšana cilvēka CD8+ T šūnās dažādos apstākļos 12. dienā. n=3 neatkarīgi paraugi. MFI, vidējā fluorescences intensitāte. d, cilvēka T šūnas tika paplašinātas kā a 12 dienas un 4,5 stundas stimulētas ar forbola 12-miristāta 13-acetātu (PMA), kas satur brefeldīnu A (BFA). IFN- un TNF- intracelulārās ekspresijas profils ir attēlots T šūnām pH 7,4 (pa kreisi), 10 mM pienskābes (vidū) vai pH 6,6 (pa labi) stāvoklī. n=3 neatkarīgi paraugi. e,f, RNS-seq analīze cilvēka T šūnām, kuras tika paplašinātas kontrolē (pH 7,4) vai pienskābē (10 mM). Atlasīto gēnu siltuma karte (e) un visu gēnu vulkāna diagramma, kuros tika marķēti gēni, kas saistīti ar atmiņu, efektoru un izsmeltajām T šūnām (f). Vulkāna diagrammā x ass attēlo log2-transformētās locījuma izmaiņas (FC) vērtības šūnām, kas apstrādātas ar pienskābi, attiecībā pret kontrolēm 12. dienā, un y ass attēlo pielāgotās P vērtības. n=4 neatkarīgi paraugi. g, GSEA diagramma, salīdzinot kontroli ar pienskābes kondicionētajām T šūnām efektora un atmiņas bagātināšanai. NES, normalizēts bagātināšanas rādītājs. h, ar T šūnu cilmes (BACH2, KLF2, LEF1, TCF7) transkripcijas faktoru kvantitatīvā mRNS ekspresija T šūnās norādītajos apstākļos. n=3 neatkarīgi paraugi. Dati tiek parādīti kā vidēji ± sem. Statistiskās analīzes tika noteiktas ar nesapārotu Stjudenta t-testu (b–d,h). Nominālās P vērtības un viltus atklāšanas rādītāji (FDR) tika aprēķināti, izmantojot GSEA programmatūras noklusējuma metodi (g).

Paaugstināts [H+ ] izraisa vielmaiņas pārprogrammēšanu

Papildus atšķirīgajām transkripcijas programmām cilmes līdzīgās T šūnas arī iegūst unikālus vielmaiņas atribūtus, tostarp paaugstinātu FAO un ierobežotu glikolītisko metabolismu 17, 20, 37. Lai izpētītu ilgstoši in vitro ↑[H+ ] eksponētu T šūnu vielmaiņas iezīmes, mēs veicām gēnu ontoloģijas (GO) bagātināšanas analīzi un konstatējām būtiskas atšķirības gēnu ekspresijā, kas saistīti ar vielmaiņas ceļiem, piemēram, mazo molekulu metabolismu un glikolīze (2.a att.). Patiešām, ilgtermiņa ar ↑ [H+ ] kondicionētajām T šūnām bija samazināta glikolīze un aminoskābju metabolisms, atšķirībā no palielinātas garās ķēdes taukskābju metabolisma (paplašinātie dati, 2.a, b att.). Atšķirībā no ilgstošas ​​↑[H+] iedarbības, īstermiņa ↑[H+] apstrāde kavēja tikai glikolīzi, bet tai nebija būtiskas ietekmes uz FAO (papildu 5.a attēls). Kvantitatīvā PCR analīze arī apstiprināja, ka glikolīzes gēni SLC2A1, SLC2A3 un LDHA bija ievērojami samazināti ↑[H+ ]-eksponētās T šūnās (paplašinātie dati 2.c att.). Un otrādi, ↑[H+ ] kondicionēšana veicināja karnitīna palmitoiltransferāzes 1 (ko kodē CPT1A), ātrumu ierobežojoša enzīma, kas iesaistīts FAO, ekspresiju (paplašinātie dati 2.c att.). Lai vēl vairāk noskaidrotu ↑[H+] izraisītās vielmaiņas izmaiņas, mēs veicām objektīvu metabolomikas analīzi un atklājām 285 atšķirīgus starpproduktus T šūnās, kas kultivētas ar ↑[H+], salīdzinot ar kontrolēm (paplašinātie dati 2.d attēls). Jo īpaši ↑[H+ ] iedarbība ievērojami samazināja glikolītisko starpproduktu un noteiktu neaizvietojamo aminoskābju daudzumu, nevis palielināja vairākas karnitīna sugas, aktivētās taukskābju formas, kas tiek pārnestas uz mitohondrijiem oksidēšanai (paplašinātie dati, 2.e–g attēls). Metabolisma plūsmas analīze, izmantojot [13C6]glikozi vai [13C16]palmitātu, parādīja, ka ↑[H+ ] iedarbība krasi kavē [13C6]glikozes iekļaušanu TCA starpproduktos un pienskābē, vienlaikus veicinot [13C16]palmitāta iekļaušanu acetil-CoA un citrātā, atbalstot necitrātu. ka ekstracelulārā acidoze nomāc glikolīzi un pastiprina FAO T šūnās (2.b–e att.). Šīm ↑[H+] kondicionētajām T šūnām bija ierobežojumi attiecībā uz barības vielu uzņemšanu, par ko liecina samazināts [13C6]glikozes patēriņš un lipīdu analogu (BODIPY FL C16) uzsūkšanās, kas varētu būt saistīts ar palielinātu elektroķīmisko gradientu. (Paplašinātie dati 2.h, i att.).

Ierobežotā barības vielu uzņemšana un šūnu vielmaiņas slēdzis var izraisīt signālu tīklu izmaiņas T šūnās. Ar pienskābi apstrādāto T šūnu GO bagātināšanas analīze atklāja, ka lielākā daļa skarto gēnu galvenokārt ir saistīti ar PI3K-AKT, mTOR un TCR signalizāciju (paplašinātie dati 3.a att.). mTOR signalizācijai ir galvenā loma imūno signālu un vielmaiņas signālu integrēšanā pareizai T šūnu aktivizēšanai, un mTOR signālu kavēšana novirza šūnas uz atmiņas CD8+ T šūnu veidošanos, nevis efektoru diferenciāciju38–40. Mūsu GSEA analīze liecināja, ka gan AKT-mTOR, gan NF-kB signalizācijas aktivitāte ↑[H+ ]-kondicionētās T šūnās bija samazināta, salīdzinot ar to kontroles T šūnās (2.f att. un paplašinātie dati 3.b att.). To vēl vairāk apstiprināja samazinātā S6 (pie Ser235 un Ser236), 4EBP1 (pie Thr37 un Thr46), AKT (pie Ser473) un NF-KB (pie Ser536) fosforilēšanās ↑[H+] kondicionētās T šūnās (att. 2g,h un paplašinātie dati 3.c att.). Ir zināms, ka mTOR ir būtisks dažādu bioloģisko procesu regulators, tostarp šūnu lielums, enerģijas ražošana un olbaltumvielu sintēze41. Patiešām, mēs atklājām, ka ↑[H+] kondicionēto T šūnu šūnu izmērs ir samazināts, salīdzinot ar kontroles T šūnām (paplašinātie dati 3.d attēls). Pēc tam mēs novērtējām no bioenerģijas atkarīgo proteīnu sintēzi ↑ [H+ ] kondicionētās T šūnās, izmantojot SCENITH, jaunizveidoto metodi, kas izmanto puromicīna iekļaušanu kā proteīnu sintēzes līmeņu nolasījumu42. Kā gaidīts, ↑[H+ ] iedarbība nomāca energoietilpīgo proteīnu sintēzi (2.i attēls), kas liecina, ka enerģijas metabolisms CD8+ T šūnās ir izmainīts. Šie rezultāti saskan ar iepriekšējiem atklājumiem, ka mTOR aktivitātes inhibīcija ar rapamicīnu palielināja ar stublāju saistīto transkripcijas faktoru ekspresiju (paplašinātie dati 3.e, f att.). Apkopojot rezultātus, mēs secinām, ka ilgstoša ↑ [H+ ] iedarbība organizē vielmaiņas slēdzi un nomāc mTOR aktivitāti, tādējādi atvieglojot T šūnu cilmes iegūšanu un uzturēšanu.

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

↑ [H+ ]-mediēts metionīna metabolisma ierobežojums saglabā epiģenētisko cilmes struktūru

Uzkrājošie pierādījumi liecina, ka viena oglekļa metabolisms nosaka T-šūnu likteņa lēmumus un veido to funkcionālos stāvokļus 43, 44. Mūsu RNS-seq analīze parādīja vāju viena oglekļa vielmaiņas procesa bagātināšanu un metionīna cikla parakstu T šūnās, kas pakļautas ilgstošai, nevis īslaicīgai ↑[H+ ] apstrādei (3.a att., paplašinātie dati, 4.a att., un papildu 5.b attēls). Attiecīgi ↑[H+ ] iedarbība kavēja ar metionīna ciklu saistītus enzīmus (MTR, AHCY un BHMT), kā arī folātu metabolismu (SHMT1 un SHMT2) kodējošo gēnu ekspresiju (paplašinātie dati 4.b att.). Papildu metabolomikas analīze atklāja, ka pienskābē kultivētās T šūnas uzrādīja ievērojamu metionīna ciklā iesaistīto intracelulāro metabolītu, tostarp metionīna, S-adenozilmetionīna (SAM) un S-adenozilhomocisteīna (SAH) samazināšanos, bet palielināja serīna un homocisteīna līmeni (paplašināts). Dati 4.c att.). [13C5]metionīna izsekošana vēl vairāk apstiprināja, ka metionīna, ar 13C iezīmētā intracelulārā SAM (m+5), SAH (m+4) un 5′-metiltioadenozīna (MTA, m) uzņemšana un intracelulārais daudzums. +1) bija ievērojami samazinātas ↑[H+ ] pakļautajās T šūnās (3.b–d. attēls un paplašinātie dati, 4.d attēls). Jāatzīmē, ka eksogēnā metionīna papildināšana atjaunoja [13C5] metionīna uzņemšanu un intracelulāro pārpilnību, kā arī attiecīgo starpproduktu daudzumu ↑[H+ ] pakļautajās T šūnās (3.c un d attēls un paplašinātie dati 4.d att.), kas liecina, ka eksogēnais metionīns papildināšana varētu atjaunot metionīna uzņemšanu un metabolismu ↑ [H+ ] pakļautajās T šūnās. Pēc tam mēs pētījām, vai metionīna ierobežojums var veicināt T šūnu cilmes veidošanos. Mēs atklājām, ka metionīna trūkums patiešām veicināja TCF1+ CD8+ T šūnu populācijas indukciju, bet neietekmēja CD62L un CD44 ekspresiju (paplašinātie dati, 4.e, f att.). Lai turpinātu pētīt metionīna metabolisma lomu ↑[H+ ]-inducētā T šūnu cilmes veidošanā, mēs kultivējām T šūnas ar ↑[H+] barotni, kas papildināta ar metionīnu, SAM vai SAH. Ekstracelulārās acidozes izraisītā T šūnu cilmes fenotips patiešām tika daļēji aizliegts, papildinot to ar metionīnu vai SAM, bet ne ar SAH (3.e att. un paplašinātie dati, 4. g–i). Intracelulārais metionīns tiek pārveidots par SAM, svarīgu metilgrupu donoru DNS un histona metilēšanas reakcijām (paplašinātie dati 5.a att.). Tādējādi mēs raksturojām histona metilēšanas modeļus un atklājām, ka paaugstināts [H+ ] ievērojami samazināja kopējo H3K27me3 līmeni T šūnās, bet tam nebija būtiskas ietekmes uz citu histona metilēšanas marķieru ekspresiju (3.f att. un paplašinātie dati 5.b att.). Kā gaidīts, metionīna papildināšana T šūnām ↑[H+] iedarbības laikā atjaunoja kopējo H3K27me3 ekspresijas līmeni (3.f attēls). Īpašais H3K27me3 līmeņa samazinājums, kas novērots T šūnās, kurām tika veikta ilgstoša ↑[H+] ārstēšana, lika mums izvirzīt hipotēzi, ka ↑[H+] iedarbība selektīvi regulē H3K27me3 nogulsnēšanai raksturīgo metiltransferāzi. Patiešām, mēs novērojām ievērojami samazinātu EZH2, H3K27me3 galvenās metiltransferāzes, ekspresiju gan mRNS, gan proteīna līmenī ↑[H+] pakļautajās T šūnās (paplašinātie dati, 5.c, d attēls). Turklāt EZH2 aktivitātes inhibīcija ar ļoti specifisku inhibitoru GSK126 palielināja TCF1 ekspresiju, kā arī CCR7+ CD62L+ CD8+ T šūnu procentuālo daudzumu (paplašinātie dati, 5.e, f att.) , kas atbilda iepriekšējam ziņojumam, ka EZH2 var regulēt atmiņas T šūnu potenciālu, izmantojot selektīvas epiģenētiskas modifikācijas45. Lai identificētu genoma mēroga izmaiņas ↑[H+ ] izraisīto T šūnu cilmes epiģenētiskajos modeļos, mēs veicām CUT&Tag-seq testu un konstatējām minimālas H3K4me3 un H3K27me3 nogulsnēšanās proporcionalitātes izmaiņas dažādās apstrādātajās grupās gar promotoru, gēna ķermeni un starpgēnu reģioni (paplašinātie dati 5.g att.). Konkrēti, epigenomiskā profilēšana atklāja samazinātu represīvā histona marķiera H3K27me3 līmeni ar atmiņu saistītos gēnu lokos (piemēram, TCF7, CCR7, ID3, LEF1 un KLF2) ilgstoši ar ↑[H+] apstrādātās T šūnās (3.g attēls). . Svarīgi ir tas, ka metionīna pievienošana ↑[H+ ] iedarbībai daļēji atjaunoja H3K27me3 līmeni iepriekšminētajos lokusos, kā arī to gēnu ekspresiju, kas liecina par metionīna nozīmīgu lomu šo ar atmiņu saistīto gēnu epiģenētiskajā modulācijā (3.g un 3. att. Paplašinātie dati 5.h att.). Saskaņā ar iepriekšējo pētījumu14 efektorgēni, piemēram, PRF1, GZMB, IFNG, TBX21 un NR4A2, labvēlīgi ieguva aktivizējošu histona metilēšanas modeli (H3K4me3hi un H3K27me3lo) (3.g attēls). Jāatzīmē, ka H3K4me3 noslogojums šo efektorgēnu promotoru reģionos tika traucēts T šūnās, kas tika kultivētas ↑[H+] ekspozīcijā, un tika atjaunotas, pievienojot metionīnu (3.g attēls). Kopumā šie atklājumi liecina, ka ↑[H+]-mediēta metionīna cikla pārtraukšana veicina T šūnu cilmes epiģenētisko saglabāšanos.

Vairāki metionīna transportētāji (SLC), tostarp SLC7A5, SLC38A1, SLC38A2 un SLC43A2, var veicināt metionīna transportēšanu46. Lai izpētītu, kā ↑[H+ ] iedarbība samazina metionīna uzņemšanu un vielmaiņu T šūnās, mēs analizējām dažādu SLC ekspresijas modeļus un atklājām, ka ↑[H+ ] dramatiski samazināja SLC7A5 un SLC38A2 ekspresiju, bet maz ietekmēja SLC38A1 ekspresiju (paplašināts). Dati 6.a,b att.). Turklāt ↑[H+ ] iedarbība samazināja MYC ekspresiju un aktivitāti (paplašinātie dati 6.c, d att.), kas, kā ziņots, regulē metionīna transportētāju, piemēram, SLC7A5, ekspresiju (47. atsauce). Mēs arī parādījām augstu MYC noslogojumu SLC7A5 promotorā un mazākā mērā SLC38A2 promotorā (paplašinātie dati 6.e att.). Svarīgi, ka ievērojami samazināta MYC saistīšanās ar šiem lokusiem tika novērota ilgstoši ar ↑[H+ ] apstrādātām T šūnām (paplašinātie dati 6.e att.). Saskaņā ar šiem novērojumiem pārmērīga MYC ekspresija ievērojami atjaunoja SLC7A5 un SLC38A2 ekspresiju ↑[H+] pakļautajās T šūnās (paplašinātie dati 6.f att.). Šie rezultāti apstiprina MYC svarīgo lomu metionīna transportētāju ekspresijas samazināšanā pēc ↑[H+ ] iedarbības. Interesanti, ka mēs atklājām, ka papildināšana ar metionīnu var arī atjaunot MYC un SLC7A5 ekspresiju ↑[H+] pakļautajās T šūnās (paplašinātie dati 6.g att.), kas liecina, ka metionīna papildināšana varētu atjaunot T šūnu metionīna uzņemšanas spēju, regulējot metionīna transportera SLC7A5 ekspresiju no MYC atkarīgā veidā. Iepriekšējais pētījums parādīja, ka SLC7A5 ir visizplatītākais metionīna transportētājs aktivētajās T šūnās47. Tas kopā ar mūsu iepriekšējiem atklājumiem liecina, ka SLC7A5 varētu būt nozīmīga loma ↑ [H+ ] izraisītā metionīna ierobežojumā un kātam līdzīga stāvokļa uzturēšanā. Patiešām, mēs noskaidrojām, ka SLC7A5 pārmērīga ekspresija daļēji pasliktināja ↑[H+ ] izraisīto cilmes veida fenotipu (paplašinātie dati 6.h, i att.), vēl vairāk atbalstot metionīna transportētāja SLC7A5 iesaistīšanos ↑[H+] inducētā T šūnu atmiņā. - līdzīgs fenotips. Analizējot dažādas audzējos infiltrējošās CD8+ T šūnu apakšpopulācijas, mēs atklājām samazinātu gan MYC, gan SLC7A5 ekspresiju atmiņai līdzīgos CD8+ TIL (paplašinātie dati, 7.a, b att.), kas ir vienā rindā. ar mūsu in vitro atklājumiem. Tādējādi šie atklājumi liecina, ka MYC – SLC7A5 – metionīna ass potenciāli varētu veicināt TIL atmiņas līdzīgā statusa saglabāšanu.

2. att.|↑ [H+ ] iedarbība izraisa vielmaiņas pārprogrammēšanu un nomāc mTOR signālu pārraidi. a, GO analīze, izmantojot RNS-seq datus, parādot reprezentatīvus atšķirīgi ekspresētus vielmaiņas gēnus kontroles un pienskābes kondicionētās cilvēka T šūnās (koriģētā P vērtība < 4,23 × 10–2). b, [13C6]glikozes vai [13C16]palmitāta marķēšanas shēmu shēma. c, norādītā m+3 laktāta procentuālā daļa no kopējā laktāta vai m+3 piruvāta no kopējā piruvāta T šūnās. n=3 neatkarīgi paraugi. d, izotopomēru procentuālais daudzums TCA starpproduktiem, piemēram, citrātam (m+2), malātam (m+2) un sukcinātam (m+2), kas iegūts no [13C6]glikozes. n=3 neatkarīgi paraugi. e, norādītā m+2 acetil-CoA procentuālā daļa no kopējā acetil-CoA vai m+2 citrāta izotopa no kopējā citrāta T šūnās no [13C16] palmitāta. n=4 neatkarīgi paraugi. f, GSEA ar gēnu kopas statistisko analīzi, kas saistīta ar mTORC1 signalizāciju kontrolē, salīdzinot ar pienskābes kondicionētu (pa kreisi) vai pH 6.{33}}kondicionētām (labajā) cilvēka T šūnām. g,h, plūsmas citometriskā analīze un kvantitatīva noteikšana S6, kas fosforilēts pie Ser235 un Ser236 (g), un 4EBP1, kas fosforilēts pie Thr37 un Thr46 (h) cilvēka CD8+ T šūnās norādītajos apstākļos. n=3 neatkarīgi paraugi. I. Plūsmas citometriskā analīze un energoietilpīgas proteīnu sintēzes kvantitatīva noteikšana kontroles vai pienskābes vai pH 6.{47}}kondicionētās cilvēka T šūnās. n=3 neatkarīgi paraugi. Dati ir parādīti kā vidēji ± sem. Statistiskās analīzes tika noteiktas ar vienpusēju Fišera precīzo testu ar Benjamini–Hochberg vairāku salīdzinājumu testu (a) vai nepāra divpusējo Stjudenta t-testu (c–e,g–i). Nominālās P vērtības un FDR tika aprēķinātas ar noklusējuma metodi GSEA programmatūrā (f).

3. att.|Palielināts [H+ ] maina T šūnu metionīna metabolismu, lai saglabātu epiģenētisko cilmes struktūru. gēnu komplekta GSEA diagramma, kas saistīta ar viena oglekļa metabolismu un cisteīna un metionīna metabolismu kontrolē, salīdzinot ar pienskābes kondicionētām cilvēka T šūnām. b, [13C5]metionīna marķēšanas modeļu shēma. c, intracelulārā SAM (m+5), SAH (m+4) un MTA (m+1), kas iegūta no [13C5]metionīna, procentuālā daļa no to attiecīgajiem kopējiem krājumiem, T šūnas, kas kultivētas kontroles apstākļos vai ar 10 mM pienskābi vai 10 mM pienskābi, kas papildināta ar metionīnu (10 mM + Met). n=3 neatkarīgi paraugi. d, [12C5] metionīna un [13C5] metionīna relatīvais daudzums T šūnās. e, reprezentatīvā histogramma un TCF1 kvantitatīva noteikšana cilvēka CD8+ T šūnās, kas kultivētas dažādos apstākļos. n=3 neatkarīgi paraugi. f, metionīna papildināšanas ietekme uz histona metilēšanu cilvēka T šūnās. H3K4me3, histons H3 trimetilēts pie K4; H3K79me2, H3 dimetilēts pie K79; H3K27me3, H3 trimetilēts pie K27; H3K9me2, H3 dimetilēts pie K9. n=3 neatkarīgi paraugi. g, Genoma trases skats uz reprezentatīviem gēnu lokiem, kas parāda H3K27me3 (sarkans, virs līnijas) vai H3K4me3 (zils, zem līnijas) virsotnes. CUT&Tag-seq dati ir no diviem neatkarīgiem paraugiem. Dati tiek parādīti kā vidējās ± sem Nominālās P vērtības, un FDR tika aprēķināti, izmantojot GSEA programmatūras noklusējuma metodi (a). Statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot divvirzienu dispersijas analīzi (ANOVA) ar Tukey vairāku salīdzinājumu testu (c–f).

↑[H+ ] iedarbība uztur mitohondriju piemērotību 

Ņemot vērā samazināto energoietilpīgo proteīnu sintēzi ↑[H+] kondicionētajās T šūnās, mēs izvirzījām hipotēzi, ka ilgstoša ↑[H+] iedarbība var izraisīt ievērojamas izmaiņas šūnu enerģētiskajā metabolismā. Gan kontroles, gan ↑[H+ ]-kondicionētās T šūnas tika analizētas, izmantojot SCENITH42, lai aprēķinātu glikozes atkarību, mitohondriju atkarību, glikolītisko spēju un FAO un aminoskābju oksidācijas spēju (4.a att. un paplašinātie dati 8.a att.). Saskaņā ar mūsu metabolomikas un izotopu izsekošanas rezultātiem mēs novērojām palielinātu mitohondriju metabolismu ↑[H+] pakļautajās T šūnās, bet glikolīzes ātrums bija samazināts (4.b, c un paplašinātie dati 8.b att.), norādot uz intracelulārās sistēmas pārprogrammēšanu. enerģētiskā vielmaiņa ↑[H+ ]-kondicionētās T šūnās. Jūras zirdziņa analīze arī atklāja, ka ↑[H+ ]-kondicionētajām T šūnām bija augstāks skābekļa patēriņa līmenis (OCR), kā arī SRC, kas ir galvenā ilgstošas ​​atmiņas CD8+ T šūnu iezīme22 un zemāks ārpusšūnu paskābināšanās ātrums ( ECAR) (4.d–h att. un paplašinātie dati 8.c–f att.). Tā kā palielināta mitohondriju masa / saplūšana un samazināts mitohondriju membrānas potenciāls (Δψm) ir svarīgs T šūnu stumbra uzturēšanai48–50, mēs tālāk pētījām ↑[H+ ] kondicionēto T šūnu mitohondriju daudzumu un kvalitāti un atklājām, ka ↑[H+ ] ārstēšana palielināja mitohondriju masu gan cilvēka, gan peles T šūnās (4.i, j att. un paplašinātie dati 8.g, h att.), kas arī uztur zemāku Δψm (4.k att. un paplašinātie dati 8.i att.). Ultrastruktūras analīze ar elektronu mikroskopiju (EM) atklāja, ka ↑[H+] pakļautajām T šūnām bija lieli, blīvi iesaiņoti mitohondriji, kas izkliedēti citoplazmā, un tām bija daudz blīvu, šauru kristu, salīdzinot ar kontroles T šūnām, kas atbilst publicētajiem rezultātiem saistībā uz mitohondriju morfoloģiju atmiņas T šūnās (4l,m att.). Saskaņā ar šo konstatējumu mēs novērojām arī vairāku mitohondriju saplūšanas kritisko regulatoru palielinātu gēnu ekspresiju ↑[H+ ]-kondicionētās T šūnās (paplašinātie dati 8.j att.), kam, kā tiek uzskatīts, ir nepieciešama loma atmiņas T šūnu veidošanā50. Kopumā šie atklājumi liecina, ka ↑[H+] iedarbība uzlabo mitohondriju masu/saplūšanu un piemērotību, lai veicinātu cilmes līdzīgu T šūnu veidošanos.

cistanche augu paaugstinošā imūnsistēma

↑[H+ ] iedarbība uzlabo CD8+ T šūnu pretvēža aktivitāti 

Cilmes līdzīgās T šūnas veicina transplantāciju, paplašināšanos un pretaudzēju efektivitāti adoptīvajā imūnterapijā51. Lai izpētītu, vai ilgstošas ​​in vitro ↑[H+ ] uzturētas CD8+ T šūnas uzrāda pastiprinātu izplešanos vai noturību pēc pārneses, CD45.1+ OT-I T šūnas, kas tika paplašinātas kontroles vai ↑[ H+ ]-kondicionēta barotne tika pārnesta uz CD45.{13}}C57BL/6N peles bez implantēta audzēja (5.a attēls). Lai gan pēc ↑[H+] kondicionēšanas tika konstatēts nedaudz palielināts apoptotisko šūnu skaits (paplašinātie dati 9.a att.), to peļu perifērajās asinīs, kas tika pārnestas ar T šūnām, kas paplašinātas ↑[H+] stāvoklī, bija ievērojami lielāks T šūnu skaits. salīdzinot ar tiem, kas paplašināti kontroles barotnē (kontroles T šūnās) (5.b attēls). Līdzīgi tika konstatēts ievērojami augstāks T šūnu biežums liesā un limfmezglos (LN) (paplašinātie dati 9.b, c att.). Turklāt mēs atklājām ievērojami palielinātu T šūnu uzkrāšanos audzējos, liesā un drenējošajos limfmezglos pelēm ar B16-OVA audzēju, kurām ↑[H+ ] paplašinātās šūnas tika pārnestas, salīdzinot ar pelēm, kurām bija audzējs. saņēma kontroles šūnas, kas liecina, ka CD8+ T šūnām, kas uzturētas ↑[H+ ], ir uzlabojusies noturība (5.c–e. att. un paplašinātie dati 9.d). Saskaņā ar šiem atklājumiem atmiņas T šūnu procentuālais daudzums tika ievērojami palielināts to peļu liesās un LN, kuras saņēma ↑[H+ ]-kondicionētas T šūnas (5.f attēls un paplašinātie dati, 9.e att.). Proti, ar ↑[H+] paplašinātām OT-I T šūnām bija ievērojami aizkavēta audzēja augšana, salīdzinot ar kontroles T šūnām (5.g attēls). Pēc tam mēs pētījām ↑[H+] paplašinātu CD19 himērisko antigēnu receptoru modificēto (CAR) T šūnu terapeitisko efektivitāti ar in vivo audzēja modeli, kurā CD19-K562 audzēja šūnas tika subkutāni injicētas audzēja sānos. NCG peles (5.h att.). Mēs atklājām, ka ↑[H+ ] iedarbība arī veicināja CAR-T šūnu cilmes veidošanos, taču tai nebija ietekmes uz apoptozi (paplašinātie dati 9.f att.), par ko liecina ievērojami palielinātie CCR7+ CD62L+ cilmes veida CAR-T procenti. šūnām, kā arī paaugstināta TCF1 ekspresija (paplašinātie dati 9. g, h att.). Turklāt pēc ↑[H+] kondicionētu T šūnu infūzijas bija lielāks CAR-T šūnu uzkrāšanās ātrums audzēju vietās un NCG peļu liesās (5.i attēls). Kā gaidīts, NCG pelēm, kas tika pārnestas ar CAR-T šūnām, kas bija paplašinātas ↑[H+ ], uzrādīja lielāku klīrensu no implantēta CD19+ audzēja, salīdzinot ar pelēm, kuras saņēma CAR-T šūnas, kas bija paplašinātas. kontroles barotnē (5.j att.). Kopumā šie dati parādīja, ka ↑[H+] apstrāde veicina T šūnu noturību in vivo un pretvēža aktivitāti.

↑[H+ ] iedarbība ierobežo T-šūnu izsīkumu

Lai turpinātu pētīt ilgstošas ​​↑[H+ ] iedarbības ietekmi uz T šūnu izsīkumu in vitro, mēs izmērījām LAG-3 un TIM-3 ekspresiju ar ↑[H+ ] sagatavotās cilvēka T šūnās, kurām tika veiktas vairākas pārbaudes kārtas. turpmāka stimulēšana ar anti-CD3 antivielām un tika kondicionēta kontroles barotnē (6.a attēls). Mēs atklājām, ka gan LAG-3, gan TIM-3 ekspresija ir samazināta ↑[H+ ] eksponētās T šūnās (6.b att. un paplašinātie dati 10.a att.), kas norāda, ka ↑[H+ ] terapijas rezultātā samazinās T šūnu izsīkums. Turklāt mēs atklājām, ka augsta metionīna koncentrācija palielina inhibējošo marķieru, piemēram, PD-1, LAG-3 un TIM-3, ekspresiju, savukārt ārstēšana ar zemu metionīna koncentrācija nedaudz samazināja šo marķieru ekspresiju (papildu 6.a–c attēls). Jāatzīmē, ka pēc ilgstošas ​​in vitro ↑[H+ ] iedarbības TIM-3+ LAG-3+ infiltrācijas OT-I T šūnās un CD19-CAR T šūnās audzējos lielā mērā bija novērojamas. samazināts pēc adoptējošās pārsūtīšanas (6.c–e att. un paplašinātie dati, 10.b att.), kas atbilst to zemākam izsīkumam in vitro un uzlabotai audzēja kontroles spējai in vivo. Turklāt mēs parādījām, ka ilgstošas ​​↑[H+ ]-kondicionētas T šūnas uzrādīja ievērojami samazinātu TOX ekspresiju gan in vitro, gan in vivo (6.f, g att. un paplašinātie dati 10.c, d att.). Kā aprakstīts iepriekš, izsmeltās T šūnas parasti var iedalīt priekšteču izsmeltajā vai galīgi izsmeltajā apakškopā, ko nosaka TCF1 un TIM-3 izteiksme52,53. Tādējādi mēs izmērījām TCF1 un TIM-3 ekspresijas modeli CD45.1+ TIL un pamanījām, ka TCF1−TIM-3+ galīgi izsmelto T šūnu biežums ir lielā mērā samazināts, un ievērojami palielinājās TCF1+ TIM-3– cilmes T šūnu procentuālais daudzums ↑[H+ ] kondicionēšanas apstākļos (6.h att.). Turklāt mēs parādījām palielinātu LY108+ TIM-3 — cilmes T šūnu populāciju (paplašinātie dati 10.e att.), kā arī palielinātu IFN- + TNF- + T biežumu. šūnas (paplašinātie dati 10.f att.), vēl vairāk apstiprinot faktu, ka ilgstošas ​​in vitro ↑[H+] paplašinātas adoptēti pārnestās T šūnas ierobežo izsīkumu un saglabā stublāju.

Diskusija

Audzējam specifisks ACT ir daudzsološa pieeja, lai ārstētu indivīdus ar ugunsizturīgiem audzējiem, taču terapeitisko efektu lielā mērā ierobežo T šūnu disfunkcija TME. Pēdējā laikā ievērojama uzmanība tika pievērsta T šūnu iepriekšējai kondicionēšanai ar pārejošu glikozes badu, glutamīna ierobežojumu vai paaugstinātu ekstracelulāro kālija līmeni (↑ [K+ ]) in vitro kultivēšanas laikā, lai saglabātu T šūnu cilmes un uzlabotu terapeitiskos rezultātus54–56. Šajā pētījumā mēs parādījām, ka CD8+ T šūnu kultivēšana ar augstu [H+ ] līmeni gruntēšanas laikā pārsteidzoši veicināja T šūnu cilmes iegūšanu un palielināja rezistenci pret T šūnu izsīkumu, ievērojami uzlabojot pretvēža iedarbību. adoptētās T šūnas.

Pārmērīga pienskābes uzkrāšanās TME jau sen tiek uzskatīta par galveno faktoru audzēja imūnsistēmas izkļūšanai. Piemēram, ir pierādīts, ka pienskābe un skābais TME nomāc CD{{0}} T šūnu citolītisko aktivitāti un citokīnu veidošanos31–33,57. Saskaņā ar šiem atklājumiem mēs arī atklājām, ka īslaicīga ↑ [H+ ] iedarbība in vitro bija pietiekama, lai dziļi inhibētu efektora citokīnu veidošanos, bet tai nebija ietekmes uz TCF1 ekspresiju vai ar stumbra saistītām vielmaiņas iezīmēm. Tomēr ilgstoša ↑ [H+ ] ārstēšana negaidīti veicināja TCF1 ekspresiju un saglabāja cilmes līdzīgu T šūnu fenotipu, izmantojot vielmaiņas pārprogrammēšanu un epiģenētisko remodelēšanu. T šūnu pakļaušana ↑ [H+ ] iedarbībai pēc to pilnīgas aktivācijas var izraisīt arī cilmes līdzīgu fenotipu, tādējādi izslēdzot iespēju, ka T šūnas, kas pakļautas zemam pH līmenim, vienkārši ir kļuvušas izturīgas pret stimulāciju, nevis pārņēmušas stumbram līdzīgu stāvokli. Fizioloģiskā pienskābes koncentrācija veselu cilvēku asinīs ir aptuveni 1,5–3,0 mM, bet TME35,58 tā var pieaugt līdz 10–40 mM. Izmantojot noturīgu anti-CD3/CD28 stimulācijas modeli, Feng et al. nesen ziņoja, ka augsta nātrija laktāta koncentrācija paaugstina H3K27ac līmeni TCF7 superpastiprinātāja lokusā, inhibējot histona dezacetilāzes aktivitāti, kā rezultātā palielinās TCF1 ekspresija un tiek veicināta CD8+ T šūnu cilmes veidošanās59. Turpretim mēs noskaidrojām, ka ilgstoša iedarbība uz salīdzinoši zemu pienskābes koncentrāciju (10 mM), bet ne nātrija laktāta, var viegli izraisīt cilmes līdzīgu T šūnu parakstu, ierobežojot metionīna metabolismu un regulējot H3K27me3. nogulsnēšanās ar stumbru saistītos gēnu lokusos, kas skaidri atbalsta atšķirīgu epiģenētisko regulējumu ar nātrija laktāta un pienskābes palīdzību. Tomēr apstrādei ar zemu skābumu (pH 6,9) nav būtiskas ietekmes uz TCF1 ekspresiju pastāvīgas anti-CD3/CD28 stimulācijas laikā, kas liecina, ka CD8+ T šūnu cilmes pazīmes, ko inducē ↑[H+ ] iedarbību var ignorēt TCR stimulācija. TCR aktivācija var uzlabot metionīna uzņemšanu un pārprogrammēt metionīna metabolismu, lai palīdzētu T šūnu aktivācijai 19, 60. Mēs spekulējām, ka TCR stimulācija var pastiprināt metionīna uzņemšanu ar ↑[H+] apstrādātajās T šūnās, kurām bija ierobežots metionīna metabolisms, tādējādi traucējot ↑[H+ ] izraisīto epiģenētisko cilmes struktūru. Turklāt T šūnas varētu izmantot laktāta jonus kā ārpusšūnu oglekļa avotu, lai atvieglotu stumbra iegūšanu pastāvīgas TCR stimulācijas klātbūtnē vai bez tās. Metabolisma aktivitāte ir cieši saistīta ar T šūnu diferenciāciju, un noteiktas vielmaiņas iejaukšanās var ievērojami veicināt ilgstošas ​​​​atmiņas T šūnu veidošanos 21, 37, 61, 62. Attiecīgi mūsu metabolomikas un izotopu izsekošanas analīzes apstiprina domu, ka ilgstoša ↑ [H+ ] iedarbība izraisa pārsteidzošu vielmaiņas pārplānošanu, piemēram, samazinātu glikozes uzņemšanu un samazinātu glikolīzes un TCA cikla metabolismu. Vairāki pētījumi ir parādījuši, ka CD8+ T atmiņas šūnas izmanto FAO, lai apmierinātu savas enerģijas vajadzības, lai gan tas, iespējams, ir pielāgošanās atmiņas līnijas diferenciācijai, un pārmērīga Cpt1 ekspresija veicina T šūnu ilgmūžību21, 22, 63, 64. Tomēr savā modelī par T šūnām specifisko Cpt1a ģenētisko dzēšanu Raud et al. nesen parādīja, ka LC-FAO lielā mērā nav nepieciešams T šūnu aktivizēšanai un CD8+ T atmiņas šūnu veidošanai65. Joprojām ir izaicinājums izskaidrot šādu neatbilstību. Mūsu pētījuma kontekstā mēs spekulējam, ka taukskābju metabolisma pārprogrammēšana, ko izraisa ārpusšūnu acidoze, iespējams, ir saistīta ar atmiņas T šūnu veidošanos, lai gan precīzam šīs hipotēzes pamatā esošajam mehānismam ir nepieciešama turpmāka izpēte. Turklāt mēs atklājām, ka ↑[H+ ] iedarbība kavē mTOR aktivitāti, ko var izraisīt glikolītiskā inhibīcija. Proti, mTOR signālu nomākšana var arī veicināt vielmaiņas pāreju no glikolīzes uz mitohondriju elpošanu. Patiešām, šīm ↑[H+] paplašinātajām T šūnām bija uzlabota mitohondriju piemērotība, par ko liecina izteikti palielināta SRC un mitohondriju masa un samazināts Δψm. Šos mitohondriju parakstus, kas ir bagātināti ar cilmes līdzīgām T šūnām un ir saistīti ar ilgmūžību un izcilu pretvēža aktivitāti in vivo , cieši modulē mitohondriju saplūšana un dalīšanās dinamika 22, 48, 50. Mitohondriju iekšējās membrānas saplūšanas proteīnam OPA1 ir neaizstājama loma atmiņas T šūnu veidošanā50. Saskaņā ar to mēs noskaidrojām, ka ārpusšūnu acidoze arī veicināja OPA1 ekspresiju T šūnās, galu galā izraisot morfoloģijas līdzsvaru pret saplūšanu T šūnās. Ir pierādīts, ka daudzi šūnu metabolīti tieši veicina epiģenētiskās modifikācijas. Piemēram, viena oglekļa metabolisms var radīt universālu metildonora SAM histona metilēšanai66.

4. att.|Mitohondriju piemērotība tiek uzturēta T šūnās, kas pakļautas ↑[H+]. cilvēka T šūnu SCENITH analīze kontroles vai ar pienskābi kondicionētās T šūnās. Tiek parādīts reprezentatīvs tulkojuma līmenis (anti-Puro) (n=3 neatkarīgi paraugi). Pārtrauktā līnija apzīmē fona līmeni, kas iegūts pēc 2-deoksi-d-glikozes + oligomicīna (2-DG+O) apstrādes. b, c, glikolītiskās spējas (b) un mitohondriju atkarības (c) kvantitatīvā analīze a ietvaros. n=3 neatkarīgi paraugi. Kontroles un ar pienskābi kondicionētu T šūnu d–f, OCR (d) tika mērīts reāllaikā pamata apstākļos, reaģējot uz norādītajiem inhibitoriem. FCCP, karbonilcianīds-p-trifluormetoksifenilhidrazons; ROT/AA, rotenons un antimicīns A. Pamata OCR (e), maksimālās elpošanas (e) un SRC (f) reprezentatīva statistiskā analīze. n=9 testi; Tika analizēti 3 neatkarīgi paraugi un katrs paraugs tika mērīts 3 reizes. g,h, kontroles vai ar pienskābi kondicionētu T šūnu ECAR (g), ko mēra, reaģējot uz norādītajiem inhibitoriem. Pamata ECAR un stresa ECAR reprezentatīvā statistiskā analīze (h). n=9 testi; Tika atklāti 3 neatkarīgi paraugi un katrs paraugs tika mērīts 3 reizes. i, COXIV un TIM23 imūnblota analīze cilvēka T šūnās norādītajos apstākļos. Aktīns tika izmantots kā iekraušanas kontrole. j,k, reprezentatīvas histogrammas vai kontūru diagrammas un mitohondriju masas (MTG) (j) un mitohondriju membrānas potenciāla (TMRM) (k) statistiskā analīze attiecīgi kontroles vai pienskābes vai pH 6.{30} }kondicionētās cilvēka T šūnas. n=3 neatkarīgi paraugi. l,m, reprezentatīvā mitohondriju morfoloģija T šūnām, kas kultivētas kontroles stāvoklī, pienskābē vai pH 6,6 stāvoklī 12 dienas, analizēta ar EM (mēroga josla, 1 μM) (l). Atsevišķu mitohondriju platība T šūnās (m), n=45 šūnas. Dati ir parādīti kā vidējais ± sem. Statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot nesapārotu Stjudenta t-testu.

5. att.|↑[H+] paplašinātajām T šūnām ir pastiprināta pretvēža aktivitāte. a,b, kontroles vai ar pienskābi paplašinātās CD8+ T šūnas tika analizētas, lai noteiktu noturību pēc adoptējošās pārvietošanas (n=6 peles). Svaigi izolētas peles CD45.1+ OT-I T šūnas tika aktivizētas ar peles IL-2 un plāksnēm piesaistītām anti-peles CD3 un anti-peles CD28 antivielām 2 dienas un pēc tam uzturētas barotnē ar peles IL-2 līdz adoptīvai pārsūtīšanai (CD3&CD28+IL-2). Eksperimenta ar dzīvniekiem shēma (a), kā arī reprezentatīvi FACS diagrammas un CD45.1+ un CD45.2+ T šūnas asinīs ir parādītas (b). c–g, CD45.{27}} OT-I T šūnas tika paplašinātas kontroles vai pienskābes barotnē 7 dienas un pārnestas uz B16-OVA audzēju nesošajām pelēm, un tika novērtēta attiecība infiltrācija. (n=5 peles). Shematika eksperimentam ar dzīvniekiem, izmantojot B16-OVA audzēju nesošās peles (c), kā arī reprezentatīvus FACS diagrammas (pa kreisi) un statistiku par pārnesto CD45 skaitu (pa labi).{37}} OT- I T šūnas audzējā (d). sc, subkutāna injekcija. Statistika par CD45 procentuālo daļu.1+ T šūnas (e) un reprezentatīvie dati (pa kreisi) un statistika par procentuālo daļu (pa labi) CD62L+ CD44+ CD45.1+ T šūnas (f) ) liesā ir parādīti. Audzēja augšanas līkne (g) (n=5 peles, 14. diena). h–j, CD19-CAR T šūnas tika paplašinātas kontroles vai pienskābes barotnē 12 dienas un pārnestas uz CD19-pārmērīgi ekspresējošām K562 audzēju nesošām NCG pelēm, un infiltrācijas koeficients audzējā un liesā tika sasniegts. novērtētas (n=6 peles). Tiek parādīta eksperimenta ar dzīvniekiem shematiska shēma (h), reprezentatīvs pārnesto T šūnu procentuālais daudzums audzējā un liesā (i) un audzēja augšanas līknes (j) (n=6 peles, 10. diena). Dati ir parādīti kā vidējais ± sem. Statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot nesapārotu Stjudenta t-testu.

6. att.|↑[H+ ] iedarbība ierobežo T šūnu izsīkumu. Cilvēka T šūnu hroniskas stimulācijas shēma in vitro. b, reprezentatīvi FACS diagrammas LAG-3 un TIM-3 hroniski stimulētajās cilvēka T šūnās, kas kultivētas kontroles vai pienskābes apstākļos. n=3 neatkarīgi paraugi. c, LAG-3 un TIM-3 ekspresija CD45.1+ TIL no B16-OVA audzēju nesošām C57BL/6N pelēm (n=5 peles ). d, LAG-3, TIM-3 un PD-1 ekspresijas kvantitatīva noteikšana CD45.1+ TIL no B16-OVA-audzēju nesošā C57BL/ 6N peles (n=5 peles). e, LAG-3 un TIM-3 ekspresija audzēju infiltrējošās CD19-CAR T šūnās no CD19-K562 audzēju nesošām NCG pelēm, kā noteikts ar plūsmas citometriju (n=6 peles). f, TOX ekspresija CD45.{34}} TIL no B16-OVA audzēju nesošām C57BL/6N pelēm (n=5 peles). g, TOX histogrammas un statistiskā analīze audzēju infiltrējošās CD19-CAR T šūnās no CD19-K562 audzēju nesošām NCG pelēm (n=6 peles). h, kreisās puses reprezentatīvi plūsmas citometrijas diagrammas TIM-3 un TCF1 CD45.1+ TIL no B16-OVA audzēju nesošām C57BL/6N pelēm (n=5 peles) . Pareizi, TCF1+ TIM-3– vai TCF1–TIM-3+ populāciju procentuālā daļa. Dati ir parādīti kā vidējais ± sem. Statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot nesapārotu Stjudenta t-testu.

Ir ziņots, ka metabolīti, piemēram, S-2-hidroksiglutarāts un hidroksibutirāts, darbojas kā atmiņas-T šūnu diferenciācijas epiģenētiskie regulatori67,68. Mūsu rezultāti parādīja, ka pastāvīga ↑[H+] terapija ierobežo metionīna uzņemšanu un metionīna metabolismu ar samazinātu intracelulāro metionīnu, SAM un SAH, inhibējot metionīna transportētāju ekspresiju. Šie rezultāti var daļēji izskaidrot, kāpēc T šūnas nespēj izkonkurēt audzēja šūnas par metionīna uzņemšanu TME69. Mehāniski mēs parādījām, ka ↑[H+] iedarbība dramatiski samazināja MYC ekspresiju un tās saistīšanos ar SLC7A5 promotoru, tādējādi samazinot SLC7A5 ekspresiju un traucējot metionīna metabolismu T šūnās. Interesanti, ka metionīna papildināšana var atjaunot MYC un SLC7A5 ekspresiju, kā arī metionīna cikla plūsmu ↑[H+] pakļautajās T šūnās, kas liecina, ka metionīna uzņemšanas spējas atjaunošana, iespējams, bija saistīta ar metionīna transportētāja regulēšanu. SLC7A5 no MYC atkarīgā veidā. Ir ziņots, ka mTOR aktivitāte regulē MYC translāciju70. Attiecīgi mēs spekulējām, ka ↑ [H+ ] izraisīta MYC pazemināšanās, iespējams, ir saistīta ar translācijas represijām, ko izraisa progresējoša mTOR inhibīcija un traucēta metionīna uzņemšana. Šādas represijas var mainīt ar eksogēnu metionīna papildināšanu, lai gan precīzam mehānismam ir nepieciešama turpmāka izpēte. Tiek uzskatīts, ka SAM, kas iegūts no metionīna cikla, veicina histona metilēšanu un epiģenētisko remodelāciju efektora-T šūnu diferenciācijas laikā 8, 71 . Saskaņā ar intracelulārā SAM samazināšanos ↑ [H+ ] paplašinātajās T šūnās, mēs noskaidrojām, ka H3K27me3 kopējais daudzums un tā noslogojums T šūnu cilmes lokusu promotorā ir ievērojami samazināts. H3K27me3 un H3K4me3 ir selektīvi modificēti tādā veidā, kas korelē ar gēnu ekspresiju, kas ir centrāli T šūnu efektora vai cilmes programmā14. Patiešām, efektorgēna promotoros H3K4me3 bija mazāk bagātināts ↑[H+] paplašinātajās T šūnās. Tādējādi samazināts metildonora SAM līmenis, ko izraisa traucēta metionīna uzņemšana un metabolisms ↑[H+] stāvoklī, izraisa epiģenētiskas izmaiņas, kas galu galā veicina T šūnu diferenciāciju atmiņas statusā. Interesanti, ka metionīna pievienošana ↑[H+] iedarbībai ne tikai izglābj MYC un SLC7A5 ekspresiju ↑[H+ ] pakļautajās T šūnās, bet arī atjauno kopējo H3K27me3 ekspresijas līmeni, atbalstot MYC – SLC7A5 svarīgu lomu. –metionīna metabolisma ass ↑[H+ ]-inducētā epiģenētiskā stumbra regulēšanā. Patiešām, mēs noskaidrojām, ka SLC7A5 pārmērīga ekspresija daļēji pasliktināja ↑[H+] izraisīto cilmes veida fenotipu, vēl vairāk atbalstot metionīna transportētāja SLC7A5 kritisko lomu T šūnu atmiņai līdzīgā fenotipa iegūšanā ↑[H+] ekspozīcijas apstākļos.

Vēsturiski tika uzskatīts, ka lielākā daļa TIL ir izsmelti, pateicoties nepārtrauktai TCR iedarbībai audzējos, taču paradoksālā kārtā neliela T šūnu klonotipu apakškopa TIL, kas ekspresē transkripcijas faktoru TCF1, saglabā cilmes šūnām līdzīgas īpašības. Mūsu atklājumi atklāja, ka ↑[H+ ] iedarbība kompensē T šūnu efektora funkciju un saglabā T šūnu cilmes struktūru, izmantojot MYC – SLC7A5 – metionīna metabolisma asi, kas sniedz iespējamu skaidrojumu pašreizējam paradoksam, kāpēc neliela daļa TIL joprojām satur cilmes. piemēram, atmiņas vai prekursora īpašības. Faktiski ir ziņots par līdzīgiem atklājumiem, saskaņā ar kuriem kālija joniem TME ir divējāda loma, ietekmējot gan T šūnu efektora funkciju, gan cilmes veidošanos56, 72, vēl vairāk atbalstot TME imūnsupresīvo faktoru sarežģīto ietekmi (piemēram, hroniska TCR stimulācija, hipoksija un zems līmenis). glikoze) uz T šūnu funkciju un diferenciāciju. Turklāt audzēju skābie reģioni ir ļoti dinamiski un gan telpiski, gan laikā regulēti, un ārpusšūnu acidozei pielāgoto T šūnu piemērotība, iespējams, tiek aizēnota, kad tās saskaras ar citiem skarbiem TME faktoriem, kas var ietekmēt intratumorālo T šūnu efektora funkciju un diferenciāciju. Turklāt mēs novērojām augstāku MYC ekspresiju galīgi izsmeltajās T šūnās (LY108−TIM-3+) nekā priekšteču izsmeltajās T šūnās (LY108+ TIM-3– ), kas ir saskaņā ar iepriekšējiem ziņojumiem, ka MYClo T šūnas galvenokārt iegūst atmiņas likteni73. Saskaņā ar samazinātu SLC7A5 ekspresiju un metionīna uzņemšanu ↑[H+ ] pakļautajās T šūnās, SLC7A5 ekspresija tika ievērojami samazināta arī LY108+ TIM-3 — priekšteču izsmelto T šūnu populācijā audzējos, kas liecina, ka MYC – SLC7A5 – metionīna regulējošā ass var darboties arī in vivo . Tagad ir skaidrs, ka mazāk diferencētām cilmes veida atmiņas T šūnām ir labāka pretaudzēju terapeitiskā iedarbība, pateicoties to ilgstošai noturībai un rezistencei pret disfunkcijas attīstību51, 74. Mēs šeit esam snieguši pārliecinošus pierādījumus tam, ka ilgtermiņa ↑[H+ ]-kondicionētās CD8+ T šūnas uzrādīja uzlabotu noturību un izcilu pretaudzēju spēju in vivo ar samazinātu galīgi izsmelto T šūnu populāciju (TCF1−TIM{). {39}} ) un palielināta cilmes veida priekšteču apakškopa (TCF1+ TIM-3– ) audzējos. Noslēgumā jāsaka, ka mūsu pašreizējais pētījums sniedz ieskatu ↑ [H+ ] iedarbības daudzdimensionālajā ietekmē uz T šūnu efektora funkcijas nomākšanu un tās vienlaicīgo ietekmi uz T šūnu cilmes.

Metodes

Peles un šūnu līnijas

Visi eksperimenti ar dzīvniekiem tika veikti ar Sudžou Sistēmu medicīnas institūta (ISM-IACUC-0151-R) Institucionālās dzīvnieku kopšanas un lietošanas komitejas (IACUC) apstiprinājumu, un dzīvnieki tika izmitināti īpašās, patogēnu brīvās peļu telpās. Peles tika izmitinātas standarta apstākļos ar 12-h/12-h gaismas/tumsas cikliem un kontrolētu temperatūru 22–24 grādi un mitrumu 60%, ar neierobežotu barību un ūdeni pieejamība, un tie tika pārbaudīti katru dienu. Visi audzēju slogi nepārsniedza atļauju, ko apstiprinājusi Sudžou Sistēmu medicīnas institūta Institucionālā dzīvnieku aprūpes un lietošanas komiteja. CD45.{9}} OT-I TCR transgēnu peļu mātītes uz C57BL/6N fona tika izmitinātas kopā. CD45.{14}} C57BL/6N peļu mātītes vecumā no 6 līdz 8 nedēļām tika iegādātas no Vital River kā saņēmējas. Peļu mātītes NCG (NOD / ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22 / Gpt) vecumā no 6 līdz 8 nedēļām tika iegādātas no GemPharmatech. Vienam neatkarīgam eksperimentam in vivo CD45.{28}} un CD45.2+ pelēm (6–12 nedēļas) tika noteikts dzimums. HEK-293T šūnas no American Type Culture Collection (ATCC) tika uzturētas DMEM barotnē, kas papildināta ar 10% liellopu augļa serumu (FBS) un 1% penicilīna-streptomicīna. Peļu melanomas šūnu līnija B16 no ATCC tika pārveidota, lai ekspresētu OVA, un uzturēta DMEM barotnē, kas papildināta ar 10% FBS un 1% penicilīna-streptomicīna. K562 šūnas no ATCC tika pārveidotas, lai ekspresētu cilvēka CD19 un kultivētas RPMI 1640 barotnē, kas papildināta ar 10% FBS, 1% penicilīna-streptomicīnu, 1% GlutaMAX, 0,1 M HEPES, 1% neaizvietojamām aminoskābēm, 1 mM nātrija piruvātu un 500. μM -merkaptoetanols. Visi iepriekš minētie reaģenti tika iegādāti no Gibco.

Primārā T šūnu izolācija, aktivizēšana un retrovīrusu transdukcija

Peles CD{{0}} T limfocīti tika izolēti no 6–12 nedēļu OT-I peļu tēviņu vai mātīšu liesām, izmantojot CD8 naivu T šūnu izolācijas komplektu (BioLegend), un kultivēti RPMI{{5} } barotne, kas papildināta ar 10% FBS, 1% penicilīna-streptomicīna, 1% neaizvietojamām aminoskābēm, 1% GlutaMAX, 1 mM nātrija piruvātu, 0,1 M HEPES un 50 μM -merkaptoetanolu peles IL klātbūtnē. -2 (20 V/ml, Peprotech). Vienam neatkarīgam eksperimentam in vitro peļu tēviņi un mātītes (6–12 nedēļas) tika saskaņoti pēc dzimuma. Attīrītās šūnas 48 stundas aktivizēja ar anti-peles CD3 (2 ug/ml, BioLegend) un anti-peles CD28 (1 ug/ml, BioLegend) antivielām. Cilvēka perifēro asiņu mononukleārās šūnas (PBMC) no veseliem donoriem tika iegādātas no Sailybio un kultivētas RMPI-1640 barotnē, kas papildināta ar 5% Human Serum AB (Gemini), 1% penicilīna–streptomicīna, 1% neaizvietojamām aminoskābēm, 1% GlutaMAX, 1 mM nātrija piruvāts, 0,1 M HEPES un 50 μM -merkaptoetanols cilvēka IL-2 klātbūtnē (100 V/ml, Peprotech). Lai aktivizētu PBMC 3 dienas, tika izmantotas pretcilvēka CD3 (1 ug/ml, BioLegend) un anti-cilvēka CD28 (1 ug/ml, BioLegend) monoklonālās antivielas. Attīrītas peles un cilvēka T šūnas tika aktivizētas un paplašinātas norādītajos kultivēšanas apstākļos: pH 7, 4, pH 6, 6, pienskābe (Sangon) vai nātrija laktāts (Sangon). Lai papildinātu pH 6,6 vai pienskābes (10 mM) barotni, tika izmantoti šādi metabolīti: metionīns 800 μM (MCE), SAM 100 μΜ (MCE) vai SAH 100 μM (Sigma). Vīrusu transdukcijai katrā 24-iedobju plāksnīšu iedobē tika aktivizēti 1 × 106 PBMC. Pēc 48 stundu aktivizācijas lielākā daļa barotnes tika aizstāta ar nekoncentrētu retrovīrusu supernatantu ar 10 ug / ml polibrēna (Santa Cruz). Pēc centrifugēšanas pie 600 g 90 minūtes 30 grādos, šūnas tika kultivētas inkubatorā 24 stundas ar svaigu barotni. Transdukcija tika atkārtota 24 stundas vēlāk un pēc tam atgriezta svaigā barotnē kultivēšanai. Infekcijas efektivitātes noteikšanai tika izmantots zemas afinitātes nervu augšanas faktora receptors (LNGFR).

Plūsmas citometrija

Šūnas tika iekrāsotas ar fluorescējošām antivielām un pēc tam analizētas ar plūsmas citometriju. Virsmas marķiera krāsošanai šūnas tika iekrāsotas ar fluorescenti konjugētām antivielām un dzīvu/mirušu fiksējamu mirušo šūnu traipu komplektu (Invitrogen) FACS buferšķīdumā (fosfātu buferšķīdums (PBS) ar 2% FBS), pēc tam fiksēts ar 2% paraformaldehīdu (Casmart). 20 minūtes istabas temperatūrā. Fosfoproteīnu intracelulārai krāsošanai iepriekš iekrāsotas šūnas tika fiksētas ar fiksācijas buferi (BioLegend) un pēc tam iekrāsotas ar fosfospecifiskām antivielām permeabilizācijas buferī (Invitrogen). Lai noteiktu intracelulāros citokīnus, šūnas tika stimulētas ar forbola miristata acetātu (PMA) Brefeldin A (BFA) (BioLegend) klātbūtnē 4, 5 stundas. Pēc tam iepriekš iekrāsotās šūnas tika fiksētas un iekrāsotas ar citokīnu antivielām permeabilizācijas buferī. Intracelulārai transkripcijas faktora krāsošanai šūnas tika iepriekš iekrāsotas ar Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit un fluorescējoši konjugētām antivielām FACS buferšķīdumā, lai noteiktu virsmas marķierus. Pēc tam šūnas 30 minūtes fiksēja uz ledus, izmantojot FOXP3 / transkripcijas faktora fiksācijas buferi (Invitrogen), un iekrāsoja ar transkripcijas faktora antivielām permeabilizācijas buferī. Pēc krāsošanas šūnas tika atkārtoti suspendētas FACS buferšķīdumā plūsmas citometrijai. Plūsmas citometrijas datus savāca BD LSR Fortessa un BD FACSDiva (v8.0.2) un analizēja ar FlowJo (v10.4) programmatūru. Reprezentatīvās vārtu noteikšanas stratēģijas ir sniegtas paplašināto datu 10.b attēlā.

RNS sekvencēšana

RNS-seq analīze tika veikta, izmantojot 12-dienu paplašinātās T šūnas, kas kultivētas norādītajos apstākļos, kā parādīts 1.a attēlā. Īsumā, 12 dienas pēc T šūnu paplašināšanās, kopējā RNS tika ekstrahēta, homogenizējot TRIzol (Takara) un sasaldējot RNāzes nesaturošās mēģenēs ar šķidru slāpekli. RNS integritāte tika novērtēta, izmantojot Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent). Bibliotēkas tika izveidotas, izmantojot TruSeq RNS paraugu sagatavošanas komplektu (FC-122-1001, Illumina). Pēc tam bibliotēkas tika sekvencētas, izmantojot Illumina NovaSeq 6000 (PE150) platformu, un tika ģenerēti aptuveni 40 miljoni pāru gala nolasījumu (Novogene). Neapstrādātie nolasījumu skaitļi tika iegūti un pēc tam normalizēti ar to bibliotēkas lieluma faktoriem, izmantojot DESeq2 (v1.28.1). Regulārā logaritma (r-log) transformācija tika izmantota, lai stabilizētu dispersiju visos paraugos. Diferenciāli ekspresētu gēnu GO un KEGG ceļu bagātināšanas analīze tika veikta ar klastera profilu (v3.16.0). Izteiksmes siltuma kartes tika ģenerētas, izmantojot R pakotni 'pheatmap' (v1.0.12). GSEA analīzei tika izmantota GSEA v.4.0.

CUT&Tag-seq

CUT&Tag-seq tika veikts, kā aprakstīts iepriekš75, izmantojot Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina (TD903, Vazyme). Īsumā, cilvēka T šūnas tika paplašinātas 12 dienas kontroles apstākļos, pienskābi vai pienskābi ar 800 μM metionīnu. Pēc tam 1 × 105 T šūnas tika lizētas nukleīna materiālu ekstrakcijai un inkubētas ar ConA lodītēm istabas temperatūrā 10 minūtes. Šūnas tika atkārtoti suspendētas 50 µL antivielu buferšķīdumā, kas iepriekš sajaukts ar primāro antivielu (anti-H3K27me3 vai anti-H3K4me3), un inkubēja nakti 4 grādu temperatūrā. Paraugus inkubēja ar sekundāro antivielu istabas temperatūrā 30 minūtes un pēc tam 1 stundu istabas temperatūrā inkubēja ar proteīna A / G-Tn5 transpozāzi, lai traucētu DNS fragmentāciju. Attīrīta DNS tika izmantota bibliotēkas sagatavošanai un sekvencēta, izmantojot PE150 ar Illumina Nova6000 sekvencētāju.

CUT&Tag-seq analīze

FastQC (v{{0}}.11.4) (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) tika izmantots, lai pārbaudītu sekvences lasīšanas kvalitāti. Izmantojot trimmomatic (v0.39) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic), nolasījumu kvalitāte tika samazināta līdz minimālajam Phred punktam 20. . Visi H3K27me3 un H3K4me3 CUT&Tag-seq nolasījumi tika saskaņoti ar hg38 cilvēka genomu, izmantojot Bowtie2 (v2.2.8) (https://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml) ar opcijām: –local– ļoti-sensitive-local-no-unal-no-mixed-no-discordant-phred33 -I 10 -X 700. Paraugi bez spike-in DNS tika normalizēti, izmantojot ChIPseqSpikeInFree metodi, kas ir jauna normalizācijas metode, lai efektīvi noteiktu mērogošanas faktorus paraugiem dažādos apstākļos un ārstēšanā76. H3K27me3 maksimumi tika izsaukti, izmantojot MACS2 (v2.2.6) (https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lesssons/05_ peak_calling_macs .html) ar opcijām "-g hs -f BAMPE–keep-dup all– wide–broad-cutoff 0.1". H3K4me3 pīķa izsaukšanai tika izmantots MACS2 ar parametriem “-g hs -q 0.{56}}f BAMPE–keep-dup all”. Virsotnes tika anotētas ar ChIPseeker (v1.22.1) (https://guangchuangyu.github.io/software/ ChIPseeker/), un vizualizācijas tika izveidotas, izmantojot deepTools (v3.5.1) (https://deeptools.readthedocs.io/en /develop/) un pyGenomeTracks (v3.7) (https://pygenometracks.readthedocs.io/en/latest/).

qRT-PCR

Kopējā RNS tika izolēta ar TRIzol (Takara) un reversi transkribēta cDNS ar HiScript reverso transkriptāzi (Vazyme) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Kvantitatīvai reāllaika PCR tika izmantota ABI prism 7500 reāllaika PCR sistēma (Thermo Fisher) un 2×SYBR Green qPCR Master Mix (Bimake) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. ACTB tika izmantots kā iekšējais standarts. MRNS relatīvā ekspresija tika aprēķināta, izmantojot 2-ΔΔCT metodi. Primeru sekvences, ko izmanto qPCR, var atrast 1. papildu tabulā.

Western blotēšana

Olbaltumvielu ekspresijas analīzei šūnas tika savāktas un mazgātas ar aukstu PBS, un kopējais proteīns tika ekstrahēts, izmantojot 1% SDS (Sangon) uz ledus. Olbaltumvielu koncentrācija tika mērīta ar BCA proteīna testa komplektu (Merck). Olbaltumvielu paraugi tika atdalīti ar SDS-PAGE gēliem un pēc tam pārnesti uz PVDF membrānām (Millipore). Membrānas tika bloķētas ar 5% beztauku pienu PBS, kas satur Tween20. Pēc bloķēšanas membrānas inkubēja ar primārajām antivielām nakti 4 grādu temperatūrā un ar HRP saistītām sekundārajām antivielām 2 stundas istabas temperatūrā. HRP signālu izstrādāja ar elektroķīmiluminiscenci (ChemeMINI610) un savāca Sage Capture (v2.19.12). Datu analīze tika veikta, izmantojot ImageJ (v1.8.0) programmatūru.

Mitohondriju morfoloģijas analīze

Katrā {{0}}iedobju plātņu iedobē PBMC tika aktivizēti ar cilvēka anti-CD3 un anti-CD28 antivielām 3 dienas un tika kultivēti RPMI-1640 barotnē dažādos apstākļos 12 dienas. Pēc tam 1 × 106 PBMC tika savākti un fiksēti iepriekš atdzesētā fiksācijas buferšķīdumā (2, 5% glutaraldehīds, 0, 1 M fosfāta buferšķīdums (PB), pH 7, 4) nakti 4 grādos. Pēc trīs reizes mazgāšanas ar PBS šūnas 2 stundas pēc tam tika fiksētas 1% osmija tetroksīdā PBS, dehidrētas un iestrādātas Spurr sveķos saskaņā ar standarta procedūru. Īpaši plānas sekcijas tika iekrāsotas ar uranilacetātu un svina citrātu. Mitohondriju morfoloģija tika attēlota, izmantojot Hitachi HT-7800 transmisijas elektronu mikroskopiju (TEM) (v01.20) un AMT-XR81DIR kameru.

Antivielas un reaģenti

Plūsmas citometriskajai analīzei izmantotās antivielas bija šādas. APC pret cilvēku NGFR (kat. Nr. 345108, 1:1, 000 FACS), FITC pret cilvēku CD4 (kat. Nr. 357406, 1:200 FACS), Pacific Blue anti-human CD8 (kat.nr. 300928, 1:200 FACS), APC-Cy7 pret cilvēku/peles CD44 (kat.nr. 103028, 1:200 FACS), PE pretcilvēka CCR7 (kat.nr.353204, 1 :200 FACS), PE anti-cilvēka TNF- (kat. Nr. 502909, 1:200 FACS), PE-Cy7 pret cilvēku CD45RO (kat. Nr. 304230, 1:200 FACS), APC anti- cilvēka IFN- (kat. Nr. 502512, 1:200 FACS), PE-Cy7 anti-cilvēka LAG-3 (kat. Nr. 369310, 1:200 FACS), PE anti-cilvēka TIM{{ 52}} (kat. Nr. 345006, 1:200 FACS), BV711 pret cilvēku PD-1 (kat. Nr. 329928, 1:200 FACS), Percp-Cy5.5 pret cilvēku CD62L (kat.nr. 304824, 1:200 FACS), APC pret cilvēku CD27 (kat.nr. 302810, 1:200 FACS), BV711 pretpeles CD8 (kat.nr. 100748, 1:200 FACS). ), PE-Cy7 pretpeles CD62L (kat. Nr. 104418, 1:200 FACS), APC-Cy7 anti-peles CD45.2 (kat. Nr. 830789, 1:200 FACS), Pacific Blue anti- pele CD45.1 (kat. Nr. 110722, 1:200 FACS), APC pretpeles Ly108 (kat. Nē. 134610, 1:200 FACS), PE pretpeļu LAG-3 (kat.nr. 125207, 1:200 FACS), Alexa Fluor 488 anti-c-MYC antiviela (kat.nr. 626811, 1). :200 FACS), PE pretpeles TNF- (kat. Nr. 506306, 1:200 FACS) un APC pretpeles IFN- (kat. Nr. 505810, 1:200 FACS) tika iegādāti no BioLegend . Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit, PerCP-eFluor710 pretpeles PD-1 (kat. Nr. 46-9981-82, 1:200 priekš FACS), PE phosphor-S6 (Ser235/236) (kat. . nr. 12-9007-42, 1:200 FACS), PE pret cilvēku/peles TOX (kat. Nr. 12-6502-82, 1:200 FACS) un PE-Cy7 pret peles TIM{ {149}} (kat. Nr. 25-5870-82, 1:200 FACS) tika iegādāti no Thermo Fisher. Alexa Fluor 647 anti-TCF1 (kat. Nr. 6709, 1:200 priekš FACS) un fosfora -4E-BP1 (Thr37/46) (kat. Nr. 2846, 1:200 priekš FACS) tika iegādāti no Šūnu signalizācijas tehnoloģija. Alexa Fluor 647 anti-puromicīns (kat. nr. MABE343-AF647, 1:800 FACS) tika iegādāts no Merck. Western blotiem izmantotās antivielas bija šādas. Trušu anti-fosfo-Akt (Ser473) (kat. Nr. 4060, 1:1, 000 IB), anti-fosfo-NF-κB p65 (Ser536) (kat. Nr. 3033, 1:1) ,000 attiecībā uz IB), anti-c-MYC (kat. Nr. 18583, 1:1, 000 priekš IB), anti-EZH2 (kat. Nr. 5246, 1:1,{ {200}} IB), anti-trimetil-histons H3 (Lys27) (kat. Nr. 9733, 1:1, 000 IB), anti-trimetil-histons H3 (Lys4) (kat. Nr. 9751, 1:1, 000 IB), anti-dimetil-histons H3 (Lys9) (kat. Nr. 4658, 1:1, 000 IB) , anti-dimetil-histons H3 (Lys79) (kat. Nr. 5427, 1:1, 000 priekš IB), antihistons H3 (kat. Nr. 9715, 1:1, {{242 }} IB), anti-COXV (kat. Nr. 850, 1:1, 000 IB), anti-trušu IgG (saistīts ar HRP) (kat. Nr. 7074, 1:2,{ {253}} IB) un anti-peles IgG (saistīts ar HRP) (kat.nr. 7076, 1:2, 000 IB) tika iegādātas no Cell Signaling Technology. Peles anti-Tim23 (kat. Nr. 611223, 1:1, 000 priekš IB) bija no BD Biosciences. Peļu anti- -aktīns (kat. Nr. 66009-1-Ig, 1:5,000 IB), anti-SLC7A5 (kat. Nr. 67951-1-Ig, 1: 1,000 IB) un trušu anti-SLC38A1 (kat. Nr. 12039-1-AP, 1:1,000 IB) bija no Proteintech. Trušu anti-SLC38A2 (kat. Nr. BMP081, 1:1, 000 IB) tika iegādāts no Medical & Biological Laboratories.

T-šūnu vielmaiņas tests

Lai pārbaudītu BODIPY FL C16 uzņemšanu kontroles vai ar ↑[H+] apstrādātajās T šūnās, T šūnas 1 stundu kultivēja ar svaigi izšķīdinātu 1 μM BODIPY FL C16 (Invitrogen), pēc tam divas reizes mazgāja ar PBS pirms virsmas krāsošanas. Lai turpinātu pētīt vielmaiņas atkarību dažādās ārstēšanas grupās, tika veikti eksperimenti, izmantojot SCENITH (vienšūnas enerģētiskā metabolisma, profilējot translācijas inhibīciju) metodi42. Īsumā, T šūnas tika iesētas 96-iedobumu plāksnēs ar 1 × 106 šūnas/ml. Pēc tam šūnas tika apstrādātas ar kontroli (Ctrl), 2-deoksi-d-glikozi (galīgā koncentrācija 100 mM), oligomicīnu (galīgā koncentrācija 5 μM) vai inhibitoru maisījumu galīgajā koncentrācijā 40 minūtes 37 °C temperatūrā. grāds . Puromicīns (galīgā koncentrācija 10 ug/ml) tika pievienots pēdējo 30 minūšu laikā. Pēc apstrādes ar puromicīnu šūnas tika mazgātas ar aukstu PBS un iepriekš iekrāsotas ar Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit un antivielām pret virsmas marķieriem. Intracelulārā puromicīna krāsošanai sekoja intracelulāro transkripcijas faktoru krāsošanas process.

Metabolisma analīze ar LC-MS/MS

Metabolisma analīze un paraugu ņemšana tika veikta tāpat kā iepriekšējos ziņojumos77. Īsumā, PBMC tika aktivizēti individuāli 24-iedobju plāksnēs ar cilvēka anti-CD3/CD28 3 dienas un tika kultivēti RPMI 1640 barotnē ar kontroli vai pienskābi līdz 12. dienai. Pēc tam 8 × 106 šūnas no katra parauga (n=4 neatkarīgi paraugi katrā grupā) tika savākti un pārnesti uz 15-ml stobriņu centrifugēšanai pie 300 g 5 minūtes 4 grādos un pēc tam mazgā ar aukstu PBS. Pēc centrifugēšanas pie 300 g vēlreiz 5 minūtes, pievienoja 80% aukstu metanolu un enerģiski maisīja, lai pilnībā izjauktu šūnu granulu, un pēc tam šūnas tika pārvietotas uz saldētavu pie -80 grādiem. Paraugus centrifugēja pie 12,000 g 10 minūtes 4 grādu temperatūrā. Supernatants tika savākts. Visbeidzot, ekstrakti tika liofilizēti un analizēti ar UHPLC-MS / MS Novogene. UHPLC–MS/MS ģenerētie neapstrādāto datu faili tika apstrādāti, izmantojot Compound Discoverer (v3.1, Thermo Fisher), lai veiktu katra metabolīta pīķu izlīdzināšanu, pīķu atlasi un kvantitatīvu noteikšanu. Tālākai datu analīzei tika izmantota Metaboanalyst (v5.0) programmatūra, un pēc tam tika atlasīti ievērojami bagātināti ceļi, izmantojot P <0, 05.

Eksperimenti ar stabilu izotopu marķēšanu

13C vielmaiņas plūsma tika veikta T šūnām, izmantojot iepriekš aprakstītās metodes60,78,79. Īsumā, PBMC tika aktivizēti katrā iedobē 24-iedobju plāksnēs ar cilvēka anti-CD3/CD28 3 dienas, kā aprakstīts iepriekš. Lai izsekotu [13C6] glikozes līmeni, barotne pēc 11 dienām tika pārslēgta uz glikozi nesaturošu RPMI (Gibco), kas papildināta ar 10% dializētu FBS (Thermo Fisher Scientific), 1% penicilīna-streptomicīnu, 1% neaizvietojamām aminoskābēm, 50 μM. -merkaptoetanols un 0,1 M HEPES, kas satur 11 mM [13C6] glikozes (Cambridge Isotope Laboratories) ar kontroli vai 10 mM pienskābi, 24 stundas. [13C16]palmitāta izsekošanas nolūkā 2 × 107 T šūnas tika aktivizētas un ievietotas pabeigtā barotnē ar kontroles vai 10 mM pienskābes apstākļiem, kā aprakstīts iepriekš 12. dienā, kas satur 200 μM [13C16] palmitātu (Cambridge Isotope Laboratories), 8. h. Lai izsekotu [13C5] metionīnu, T šūnas 12 dienas tika paplašinātas kontrolējot pienskābi vai pienskābi ar 800 μM metionīna apstākļiem. Pēc tam 4 × 107 T šūnas tika pārslēgtas uz pilnīgu RPMI barotni, kas nesatur metionīnu (Gibco) un kultivēja kontroles apstākļos, pienskābi vai pienskābi, kas papildināta ar metionīnu (kas satur 100 μM, 100 μM vai 800 μM [13C5] metionīna) (Cambridge Isotope Laboratories), 8 stundas. Attiecīgie supernatanti tika savākti un pēc tam uzglabāti -80 grādu temperatūrā. Šūnas tika granulētas, centrifugējot (300 g, 4 grādi, 5 minūtes), divas reizes mazgātas ar fizioloģisko šķīdumu un nekavējoties sasaldētas šķidrā slāpeklī un uzglabātas -80 grādos. Metabolītus ekstrahēja, izmantojot ledusaukstu HPLC kvalitātes 80% metanolu, un īsi maisīja vorteksā, pēc tam pievienoja 200 ml HPLC kvalitātes ūdens, pēc tam 500 ml HPLC kvalitātes hloroforma (metanola:ūdens:hloroforma attiecība, 5:2:5). ). Maisījums tika maisīts un centrifugēts, lai panāktu fāzes atdalīšanu. Supernatanti tika žāvēti ar vakuuma centrifūgu turpmākai atvasināšanai un pēc tam inkubēti ar 2% (masas/tilp.) metoksiamīna hidrohlorīdu (226904, Sigma-Aldrich) piridīnā 60 minūtes 37 grādu temperatūrā un sililēti ar N-metil-N-( terc-butildimetilsilil) trifluoracetamīds ar 1% terc-butildimetilhlorsilānu (TBDMS, 18162-48-6, Regis Technologies) 30 minūtes 45 grādu temperatūrā. [13C6] glikozes atvasinājumi tika analizēti ar GC-HRMS, Trace 1310 gāzu hromatogrāfu (Thermo Fisher) ar kolonnu DB–35MS (Agilent Technologies) un Q Exactive GC Orbitrap GC–MS/MS sistēmu (Thermo Fisher). GC-MS/MS metabolomikas testus veica Metabo-Profile. Metabolīti tika identificēti un kvantificēti, izmantojot Xcalibur (v4.1) un TraceFinder (v5.1) (Thermo Fisher), tostarp aiztures laiku, jonu fragmentu lādiņa un masas attiecību un maksimālās intensitātes. [13C16] palmitāta un [13C5] metionīna atvasinājumi tika analizēti ar ultraaugstspiediena šķidruma hromatogrāfiju – trīskāršā kvadrupola masas spektrometru (UPLC – TQMS). Neapstrādātie dati no UPLC-TQMS tika analizēti, izmantojot Waters' MassLynx programmatūru (v4.1, Waters), lai iegūtu maksimālo metabolītu, integrāciju, identificētu un kvantitatīvi noteiktu. Turpmākai statistiskai analīzei tika izmantota R valoda (v4.1.1).

B16 audzēja modelis un adoptīvā šūnu pārneses imūnterapija

Lai izpētītu T šūnu pretvēža aktivitāti in vivo, 0,2 × 106 B16-OVA melanomas šūnas tika subkutāni injicētas C57BL/6N peļu mātītēm. Deviņas dienas pēc audzēja implantācijas pelēm intravenozi injicēja 5 × 106 T šūnas no OT-I peļu mātītēm, kas 7 dienas tika paplašinātas dažādos apstākļos. Audzēju nesošās peles pirms ACT saņēma 5 Gy subletālu apstarošanu. Audzēja laukums tika mērīts ik pēc 2 dienām un aprēķināts kā garums (mm) × platums (mm). Peles, kuru audzēja laukums tuvojās 300 mm2, tika eitanāzēts. Lai izpētītu paplašināto T šūnu noturību dažādos apstākļos, 4 × 106 CD45.{19}} T šūnas no OT-I peļu mātītēm tika pārnestas uz C57BL/6N peļu mātītēm. Nedēļu vēlāk peles tika eitanizētas un tika saskaitītas šūnas no izolētām asinīm, liesām un limfmezgliem. Pārnesto T šūnu īpatsvars tika noteikts ar plūsmas citometrijas palīdzību T šūnām, kas ekspresē CD45.1+ un CD45.2+.

NCG peļu modelis un CD{0}}CAR-T terapija

NCG peļu mātītēm subkutāni implantēja 1 × 106 CD19-K562 šūnas. Kad audzēja tilpums sasniedza 75 mm3, peles saņēma 5 × 106 netransducētas T šūnas un CD19-CAR T šūnas, kas tika kultivētas kontroles vai 10 mM pienskābi saturošā barotnē. Audzēja augšana tika mērīta ik pēc 2 dienām ar elektroniskiem suportiem un aprēķināta pēc garuma (mm) × platuma (mm). Peles ar audzēja laukumu, kas lielāks par 300 mm2, tika eitanāzētas. Audzēji tika savākti, sagremoti un apstrādāti ar Percoll (Sigma), un pēc tam ar plūsmas citometriju noteica T šūnu funkciju un fenotipu.

Bāzes skābekļa patēriņa ātruma un ārpusšūnu paskābināšanās ātruma analīze

Metabolisma īpašību analīzei OCR un ECAR novērtēja ar jūras zirga XF24 analizatoru (Agilent). Īsumā, cilvēka T šūnas, kas kultivētas dažādos apstākļos 12 dienas, tika iepriekš apstrādātas ar nebuferētu XF barotni (nebuferētu RPMI 1640, kas satur 10 mM glikozes, 1 mM nātrija piruvātu un 2 mM glutamīnu). . Pēc tam cilvēka T šūnas tika iesētas ar 0,5 × 106 šūnām katrā iedobē XF24 šūnu kultūras mikroplatē un inkubētas inkubatorā bez CO2 1 stundu 37 grādu temperatūrā. Lai uzlabotu šūnu adhēziju, plāksnes 5 minūtes centrifugēja istabas temperatūrā pie 100 g ar nulles bremzi. Skābekļa patēriņš un ārpusšūnu paskābināšanās tika analizēti pamata apstākļos, reaģējot uz 1,25 μM oligomicīna, 50 mM 2-deoksi-d-glikozes, 1,5 μM FCCP, 0,5 μM rotenona un 0,5 μM antimicīna A atņemšanu. pamata OCR no maksimālās OCR.

ChIP-qPCR

Hromatīna imunoprecipitācija (ChIP) tika veikta, ievērojot ražotāja norādījumus, kas piegādāti kopā ar ChIP-IT ekspress fermentatīvās bīdes komplektu (Active Motif). Īsāk sakot, 15 miljoni cilvēka T šūnu, kas kultivētas kontroles vai 10 mM pienskābes apstākļos, tika fiksētas ar formaldehīdu 10 minūtes istabas temperatūrā, un fiksācijas reakcija tika apturēta, pievienojot 1 × glicīnu. Fiksētās šūnas tika granulētas ar PMSF un olbaltumvielu inhibīcijas kokteili un uzglabātas -80 grādu temperatūrā pirms šūnu līzes. Pēc tam atkausētā granula tika atkārtoti suspendēta 1 ml ledusaukstā līzes buferšķīdumā ar PMSF un olbaltumvielu inhibīcijas kokteili uz ledus 30 minūtes, lai iegūtu kodolmateriālu. Kodolgranulas pēc tam tika atkārtoti suspendētas un sagremotas ar fermentatīvu kokteili, lai 15 minūtes grieztu hromatīnu 37 grādu temperatūrā. Nogriezts hromatīns tika inkubēts ar proteīna G magnētiskajām lodītēm ar anti-c-MYC (CST, kat. nr. 18583, 1:100 attiecībā uz ChIP) un anti-IgG (CST, kat. nr. 2729, 1:100 attiecībā uz ChIP) plkst. 4 grādi naktī. Pēc tam magnētiskās lodītes četras reizes mazgāja ar ChIP buferšķīdumiem un eluēja ar 50 ul eluēšanas buferi. Eluētā DNS tika atgriezta šķērssaistīta 2,5 stundas 65 grādos un pēc tam attīrīta ar fenola-hloroforma ekstrakciju. Attīrītā DNS tika izmantota, lai veiktu ChIP-qPCR, lai noteiktu MYC bagātināšanos mērķa gēnu promotoros. ChIP – qPCR izmantotie praimeri ir atrodami 2. papildu tabulā.

Mitohondriju masas un membrānas potenciāla analīze

Mitohondriju masa un membrānas potenciāls tika analizēti, izmantojot MitoTracker Green un tetrametrirodamīna metilesteri (TMRM). Šūnas tika iekrāsotas ar 250 nM MitoTracker Green (Thermo Fisher) vai 50 nM TMRM (Thermo Fisher) inkubatorā 37 grādu temperatūrā (5% CO2) 1 stundu pirms šūnu virsmas krāsošanas. Šūnas trīs reizes mazgāja ar FACS buferšķīdumu, kam sekoja virsmas marķieru krāsošana turpmākai FACS analīzei.

Statistiskā analīze

Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot GraphPad Prism versiju 8.0. Rezultāti tiek parādīti kā vidējais ± sem. Lai salīdzinātu ārstēšanu ar kontroles grupām, tika izmantots Divpusējs Stjudenta t-tests. Vairākiem salīdzinājumiem tika izmantota divvirzienu ANOVA ar Tukey's Sidak vai Dunnett vairāku salīdzinājumu testu. P < 0,05 tika uzskatīts par statistiski nozīmīgu.

Atsauces

1. Gattinoni, L., Speiser, DE, Lichterfeld, M. & Bonini, C. T atmiņas cilmes šūnas veselībā un slimībās. Nat. Med. 23, 18–27 (2017).

2. Gao, S. et al. Cilmes šūnām līdzīgas atmiņas T šūnas: perspektīva no tumšās puses. Šūnu imunols. 361, 104273 (2021).

3. Rosenberg, SA & Restifo, NP Adoptīvā šūnu pārnešana kā personalizēta imūnterapija cilvēka vēža ārstēšanai. Science 348, 62–68 (2015).

4. Ribas, A. & Wolchok, JD Vēža imūnterapija, izmantojot kontrolpunktu blokādi. Science 359, 1350–1355 (2018).

5. Lugli, E., Galletti, G., Boi, SK & Youngblood, BA Atmiņas CD8+ T šūnu cilmes, efektoru un hibrīdstāvokļi. Trends Immunol. 41, 17–28 (2020).

6. Galletti, G. et al. Divas cilmes veida CD8+ atmiņas T šūnu priekšteču apakškopas ar atšķirīgām likteņa saistībām cilvēkiem. Nat. Immunol. 21, 1552–1562 (2020).

7. Gattinoni, L. et al. Cilvēka atmiņas T šūnu apakškopa ar cilmes šūnām līdzīgām īpašībām. Nat. Med. 17, 1290–1297 (2011).

8. Franco, F., Jaccard, A., Romero, P., Yu, YR & Ho, PC T-šūnu izsīkuma metabolisma un epiģenētiskā regulēšana. Nat. Metab. 2, 1001–1012 (2020).

9. Kaech, SM & Cui, W. Transkripcijas kontrole efektoru un atmiņas CD8+ T šūnu diferenciācijai. Nat. Immunol. 12, 749–761 (2012).

10. Huang, Q. et al. Audzēju specifisko atmiņas CD8+ T šūnu pirmatnēja diferenciācija kā bona fide reaģētāji uz PD-1/PD-L1 blokādi drenāžas limfmezglos. Cell 185, 4049–4066 (2022).

11. Siddiki, I. et al. Intratumorālās Tcf1+ PD-1+ CD8+ T šūnas ar cilmes līdzīgām īpašībām veicina audzēja kontroli, reaģējot uz vakcināciju un kontrolpunktu blokādes imūnterapiju. Immunity 50, 195–211 (2019).

12. Jeannet, G. et al. Wnt ceļa efektora Tcf-1 būtiska loma funkcionālas CD8 T šūnu atmiņas izveidē. Proc. Natl Acad. Sci. USA 107, 9777–9782 (2010).

13. Henning, AN, Roychoudhuri, R. & Restifo, NP. CD8+ T šūnu diferenciācijas epiģenētiskā kontrole. Nat. Immunol. 18, 340–356 (2018).

14. Crompton, JG et al. CD8+ T šūnu apakškopu ciltsraksta attiecības atklāj progresīvas izmaiņas epiģenētiskajā ainavā. Cell Mol. Immunol. 13, 502–513 (2016).

15. Yu, B. et al. Epiģenētiskās ainavas atklāj transkripcijas faktorus, kas regulē CD8+ T šūnu diferenciāciju. Nat. Immunol. 18, 573–582 (2017).

16. Araki, Y. et al. Histona metilēšanas genoma mēroga analīze atklāj uz hromatīna stāvokli balstītu gēnu transkripcijas regulēšanu un atmiņas CD8+ T šūnu funkciju. Immunity 30, 912–925 (2009).

17. Moller, SH, Hsueh, PC, Yu, YR, Zhang, L. & Ho, PC Metaboliskās programmas pielāgo T šūnu imunitāti vīrusu infekciju, vēža un novecošanās gadījumā. Šūnu Metab. 34, 378–395 (2022).

18. Phan, AT et al. Konstitutīvais glikolītiskais metabolisms atbalsta CD8+ T šūnu efektoru atmiņas diferenciāciju vīrusu infekcijas laikā. Immunity 45, 1024–1037 (2016).

19. Sinclair, LV et al. Metionīna metabolisma antigēnu receptoru kontrole T šūnās. eLife 8, e44210 (2019).

20. O'Salivans, D. et al. Atmiņas CD8+ T šūnas izmanto šūnām raksturīgo lipolīzi, lai atbalstītu attīstībai nepieciešamo vielmaiņas programmēšanu. Immunity 41, 75–88 (2014).

21. Pearce, EL et al. CD8 T-šūnu atmiņas uzlabošana, modulējot taukskābju metabolismu. Nature 460, 103–107 (2009).

22. Van der Windt, GJ et al. Mitohondriju elpošanas spēja ir būtisks CD8+ T šūnu atmiņas attīstības regulators. Immunity 36, 68–78 (2012). 23. Boedtkjer, E. & Pedersen, SF Skābā audzēja mikrovide kā vēža izraisītājs. Annu. Rev. Physiol. 82, 103–126 (2020). 24. Thommen, DS & Schumacher, TN T šūnu disfunkcija vēža gadījumā. Cancer Cell 33, 547–562 (2018).

25. Scharping, NE et al. Audzēja mikrovide nomāc t-šūnu mitohondriju bioģenēzi, lai veicinātu intratumorālu t-šūnu metabolisma mazspēju un disfunkciju. Immunity 45, 374–388 (2016).

26. Yu, YR et al. Traucēta mitohondriju dinamika CD8+ TIL pastiprina T-šūnu izsīkumu. Nat. Immunol. 21, 1540–1551 (2020).

27. Chang, CH et al. Metaboliskā konkurence audzēja mikrovidē ir vēža progresēšanas virzītājspēks. Cell 162, 1229–1241 (2015).

28. Scharping, NE et al. Mitohondriju stress, ko izraisa nepārtraukta stimulācija hipoksijas apstākļos, ātri izraisa T-šūnu izsīkumu. Nat. Immunol. 22, 205–215 (2021).

29. Jansen, CS et al. Intra-tumorālā niša uztur un diferencē cilmes veida CD8 T šūnas. Nature 576, 465–470 (2019).

30. Im, SJ et al. CD8+ T šūnu noteikšana, kas nodrošina proliferācijas uzliesmojumu pēc PD-1 terapijas. Nature 537, 417–421 (2016).

31. Haas, R. et al. Laktāts regulē vielmaiņas un iekaisuma ķēdes, kontrolējot T šūnu migrāciju un efektoru funkcijas. PLoS Biol. 13, e1002202 (2015).

32. Wu, H. et al. T-šūnas rada skābes nišas limfmezglos, lai nomāktu savas efektoru funkcijas. Nat. Commun. 11, 4113 (2020).

33. Calcinotto, A. et al. Mikrovides skābuma modulācija maina anerģiju cilvēka un peles audzējos infiltrējošos T limfocītos. Cancer Res. 72, 2746–2756 (2012). 34. Gotfrīds, E. et al. No audzēja iegūtā pienskābe modulē dendritisko šūnu aktivāciju un antigēna ekspresiju. Blood 107, 2013–2021 (2006).

35. Colegio, OR et al. Ar audzēju saistītu makrofāgu funkcionālā polarizācija ar audzēju iegūto pienskābi. Nature 513, 559–563 (2014).

36. Erra Diaz, F. et al. Ekstracelulārā acidoze un mTOR inhibīcija veicina cilvēka monocītu izcelsmes dendritisko šūnu diferenciāciju. Cell Rep. 31, 107613 (2020).

37. Sukumar, M. et al. Glikolītiskā metabolisma kavēšana uzlabo CD8+ T šūnu atmiņu un pretvēža funkciju. Dž.Klins. Invest. 123, 4479–4488 (2013).

38. Scholz, G. et al. MTOR signālu modulācija izraisa cilmes šūnām līdzīgu atmiņas T šūnu veidošanos. EBioMedicine 4, 50–61 (2016).

39. Pollizzi, KN et al. mTORC1 un mTORC2 selektīvi regulē CD8+ T šūnu diferenciāciju. Dž.Klins. Invest. 125, 2090–2108 (2015).

40. Zhang, L. et al. Rapamicīna kompleksa 2 zīdītāju mērķis Foxo1-atkarīgā veidā kontrolē CD8 T šūnu atmiņas diferenciāciju. Cell Rep. 14, 1206–1217 (2016).

41. Zhou, H. & Huang, S. mTOR signālu loma audzēja šūnu kustībā, invāzijā un metastāzēs. Curr. Olbaltumvielu pept. Sci. 12, 30–42 (2011).

42. Arguello, RJ et al. SCENITH: uz plūsmas citometriju balstīta metode, lai funkcionāli profilētu enerģijas metabolismu ar vienas šūnas izšķirtspēju. Šūnu Metab. 32, 1063–1075 (2020).

43. Ron-Harel, N. et al. Mitohondriju bioģenēze un proteomu pārveidošana veicina viena oglekļa metabolismu T-šūnu aktivācijai. Šūnu Metab. 24, 104–117 (2016).

44. Han, C., Ge, M., Ho, PC & Zhang, L. T-šūnu pretaudzēju imunitātes uzpildīšana: atkārtoti apskatīta aminoskābju metabolisms. Cancer Immunol. Res. 9, 1373–1382 (2021).

45. Kakaradovs, B. et al. CD8+ T šūnu diferenciācijas agrīna transkripcijas un epiģenētiskā regulēšana, ko atklāja vienas šūnas RNS sekvencēšana. Nat. Immunol. 18, 422–432 (2017).

46. ​​Wang, W. & Zou, W. Aminoskābes un to transportētāji T šūnu imunitātē un vēža terapijā. Mol. Cell 80, 384–395 (2020).

47. Marchingo, JM, Sinclair, LV, Howden, AJ & Cantrell, DA Kvantitatīvā analīze par to, kā Myc kontrolē T šūnu proteomas un vielmaiņas ceļus T šūnu aktivācijas laikā. eLife 9, e53725 (2020).

48. Sukumar, M. et al. Mitohondriju membrānas potenciāls identificē šūnas ar uzlabotu kātu šūnu terapijai. Šūnu Metab. 23, 63–76 (2016).

49. Alizadeh, D. et al. IL15 uzlabo CAR-T šūnu pretvēža aktivitāti, samazinot mTORC1 aktivitāti un saglabājot to cilmes šūnu atmiņas fenotipu. Cancer Immunol. Res. 7, 759–772 (2019).

50. Buck, MD et al. Mitohondriju dinamika kontrolē T šūnu likteni, izmantojot vielmaiņas programmēšanu. Cell 166, 63–76 (2016).

51. Krishna, S. et al. Cilmes līdzīgās CD8 T šūnas mediē adoptīvo šūnu imūnterapijas reakciju pret cilvēka vēzi. Science 370, 1328–1334 (2020).

52. Burger, ML et al. Antigēnu dominējošās hierarhijas veido TCF1+ priekšteču CD8 T šūnu fenotipus audzējos. Cell 184, 4996–5014 (2021).

53. Guo, Y. et al. Galīgi izsmeltu CD8+ T šūnu metaboliskā pārprogrammēšana ar IL-10 uzlabo pretvēža imunitāti. Nat. Immunol. 22, 746–756 (2021).

54. Kleins Geltinks, RI et al. CD8+ efector T šūnu metabolisma kondicionēšana adopcijas šūnu terapijai. Nat. Metab. 2, 703–716 (2020).

55. Suzuki, J., Nabe, S., Yasukawa, M. & Yamashita, M. Glutamīns regulē CD8 T šūnu pretvēža aktivitāti. Gan To Kagaku Ryoho 47, 11–15 (2020).

56. Vodnala, SK et al. T šūnu cilmes veidošanos un disfunkciju audzējos izraisa kopīgs mehānisms. Science 363, eaau0135 (2019).

57. Bosticardo, M. et al. Cilvēka T limfocītu neobjektīvu aktivāciju zemā ārpusšūnu pH dēļ antagonizē B7 / CD28 kostimulācija. Eiro. J. Immunol. 31, 2829–2838 (2001).

58. Pucino, V. et al. Laktāta uzkrāšanās hroniska iekaisuma vietā veicina slimību, izraisot CD4+ T šūnu vielmaiņas pārveidošanu. Šūnu Metab. 30, 1055–1074 (2019).

59. Feng, Q. et al. Laktāts palielina CD8+ T šūnu stublājus, lai palielinātu pretvēža imunitāti. Nat. Commun. 13, 4981 (2022).

60. Roy, DG et al. Metionīna metabolisms veido T palīgšūnu reakcijas, regulējot epiģenētisko pārprogrammēšanu. Šūnu Metab. 31, 250–266 (2020).

61. Zhang, L. & Romero, P. CD8+ T šūnu likteņa lēmumu un pretvēža imunitātes metabolisma kontrole. Trends Mol. Med. 24, 30–48 (2018).

62. Cham, CM, Driessens, G., O'Keefe, JP & Gajewski, TF Glikozes atņemšana kavē vairākus galvenos gēnu ekspresijas notikumus un efektora funkcijas CD8+ T šūnās. Eiro. J. Immunol.38, 2438–2450 (2008).

63. O'Salivans, D. et al. Atmiņas CD8+ T šūnas izmanto šūnām raksturīgo lipolīzi, lai atbalstītu attīstībai nepieciešamo vielmaiņas programmēšanu. Immunity 49, 375–376 (2018).

64. Lin, R. et al. Taukskābju oksidācija kontrolē CD8+ audu rezidentu atmiņas t-šūnu izdzīvošanu kuņģa adenokarcinomas gadījumā. Cancer Immunol. Res. 8, 479–492 (2020).

65. Raud, B. et al. Etomoksira iedarbība uz regulējošajām un atmiņas T šūnām nav atkarīga no Cpt1a mediētās taukskābju oksidācijas. Šūnu Metab. 28, 504–515 (2018).

66. Sharma, U. & Rando, OJ Metabolic inputs into the epigenome. Šūnu Metab. 25, 544–558 (2017).

67. Tyrakis, PA et al. S-2-hidroksiglutarāts regulē CD8+ T-limfocītu likteni. Nature 540, 236–241 (2016).

68. Zhang, H. et al. Ketoģenēzes radītais beta-hidroksibutirāts ir CD8+ T-šūnu atmiņas attīstības epiģenētiskais regulators. Nat. Cell Biol. 22, 18–25 (2020).

69. Bian, Y. et al. Vēzis SLC43A2 maina T-šūnu metionīna metabolismu un histona metilēšanu. Nature 585, 277–282 (2020).

70. Wall, M. et al. C-MYC translācijas kontrole ar rapamicīnu veicina gala mieloīdu diferenciāciju. Blood 112, 2305–2317 (2008).

71. Yerinde, C., Siegmund, B., Glauben, R. & Weidinger, C. Metabolic control of epigenetics un tās loma CD8+ T šūnu diferenciācijā un funkcijās. Priekšpuse. Immunol. 10, 2718 (2019).

72. Eil, R. et al. Jonu imūnsupresija audzēja mikrovidē ierobežo T šūnu efektora funkciju. Nature 537, 539–543 (2016).

73. Guo, A. et al. cBAF kompleksie komponenti un MYC sadarbojas agrīnā CD8+ T šūnu liktenī. Nature 607, 135–141 (2022).

74. Raynor, JL, Chapman, NM & Chi, H. Metabolic control of memory T-cell generation and stemness. Cold Spring Harb. Perspektīva. Biol. 13, 037770 (2021).

75. Kaya-Okur, HS et al. CUT&Tag mazo paraugu un atsevišķu šūnu efektīvai epigenomiskai profilēšanai. Nat. Commun. 10, 1930 (2019).

76. Jin, H. et al. ChIPseqSpikeInFree: ChIP-seq normalizācijas pieeja, lai atklātu globālas izmaiņas histona modifikācijās bez palielināšanas. Bioinformatics 36, 1270–1272 (2020).

77. Sellick, CA, Hansen, R., Stephens, GM, Goodacre, R. & Dickson, AJ. Metabolītu ekstrakcija no suspensijā kultivētām zīdītāju šūnām globālai metabolītu profilēšanai. Nat. Protok. 6, 1241–1249 (2011).

78. Li, C. et al. Aminoskābju katabolisms regulē hematopoētisko cilmes šūnu proteostāzi, izmantojot GCN2 – eIF2 asi. Cell Stem Cell 29, 1119–1134 (2022).

79. Wenes, M. et al. Mitohondriju piruvāta nesējs regulē atmiņas T-šūnu diferenciāciju un pretvēža funkciju. Šūnu Metab. 34, 731–746 (2022).