Farneziltransferāzes inhibitors LNK{0}} mazina aksonu distrofiju un mazina amiloīda patoloģiju pelēm, 1. daļa

Abstrakts

Fons:

Amiloīda plāksnes nogulsnēšanās un aksonu deģenerācija ir agrīni AD patoģenēzes notikumi. A izjauc mikrotubulas presinaptiskos distrofiskajos neirītos, kā rezultātā uzkrājas traucētas endolizosomu un autofagiskas organellus, kas transportē amiloīda prekursoru proteīnu šķelšanas enzīmu (BACE1). Līdz ar to distrofiskie neirīti rada A42 un būtiski veicina aplikuma nogulsnēšanos.

Aksonu deģenerācija ir neiroloģisks traucējums, kas izraisa neironu aksonu bojājumus, tādējādi ietekmējot nervu vadītspēju. Imunitāte ir svarīga cilvēka ķermeņa aizsardzības līnija pretoties svešu mikrobu un vīrusu invāzijai. Tātad, vai pastāv saistība starp aksonu deģenerāciju un imunitāti?

Pirmkārt, aksonu deģenerācija nav imūnsistēmas izraisīta slimība, tāpēc nav jāuztraucas, ka imunitāte to negatīvi ietekmēs. Lai gan konkrētais aksonu deģenerācijas cēlonis nav zināms, daži pētījumi liecina, ka aksonu deģenerācija var būt saistīta ar imūnsistēmas iekaisuma reakcijām. Iekaisuma reakcija ir imūnsistēmas aizsargmehānisms pret svešu patogēnu invāziju. Tomēr, ja tas ir pārāk aktivizēts, tas izraisīs neironu iekaisuma bojājumus un veicinās aksonu deģenerāciju.

Otrkārt, spēcīga imūnsistēma var uzlabot ķermeņa pretestību un samazināt infekciju un slimību risku, kas ir īpaši svarīgi pacientiem ar aksonu deģenerāciju. Tā kā pacientiem ar aksonu deģenerāciju ir bojāta nervu sistēma, organisma pašlabošanās spējas ir salīdzinoši vājas. Ja viņi cieš no citām slimībām, stāvoklis pasliktināsies un vēl vairāk ietekmēs viņu dzīves kvalitāti. Tāpēc veselīga uztura un dzīves paradumu saglabāšana un imunitātes stiprināšana var palīdzēt samazināt citu slimību risku. Tajā pašā laikā tas var uzlabot ķermeņa imūnreakciju un veicināt aksonu atjaunošanos un nervu vadītspējas atjaunošanos.

Rezumējot, lai gan nav vajadzīgās saiknes starp aksonu deģenerāciju un imunitāti, veselīga imūnsistēma var nodrošināt nepieciešamo aizsardzību un atbalstu pacientiem ar aksonu deģenerāciju. Tāpēc mums vajadzētu pievērst uzmanību tam, cik svarīgi ir uzturēt imūnsistēmu, sākot no tādiem aspektiem kā uzturs un dzīves paradumi un aktīvi uzlabojot organisma imūno līmeni, lai liktu stabilu pamatu veselībai un ilgmūžībai. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche deserticola var ievērojami uzlabot atmiņu, jo Cistanche deserticola ir tradicionāls ķīniešu ārstniecības materiāls, kam ir daudz unikālu efektu, no kuriem viens ir atmiņas uzlabošana. Maltās gaļas efektivitāti nodrošina dažādas tajā esošās aktīvās sastāvdaļas, tostarp skābe, polisaharīdi, flavonoīdi utt. Šīs sastāvdaļas var veicināt smadzeņu veselību dažādos veidos.

Noklikšķiniet uz zināt 10 veidus, kā uzlabot atmiņu

Farneziltransferāzes inhibitori (FTI) nesen tika pētīti, lai tos pārvietotu uz neirodeģeneratīvu traucējumu ārstēšanu un bloķē farneziltransferāzes (FTase) darbību, lai katalizētu farnezilāciju, kas ir pēctranslācijas modifikācija, kas regulē proteīnus, kas iesaistīti lizosomu funkcijā un mikrotubulu stabilitātē. Pēcnāves AD smadzenēs FTase un tās pakārtotā signalizācija tiek regulēta. Tomēr FTI ietekme uz amiloīda patoloģiju un distrofiskiem neirītiem nav zināma.

Metodes:

Mēs pārbaudījām FTIR LNK-754 un lonafarniba ietekmi amiloīda patoloģijas 5XFAD peles modelī.

Rezultāti:

2-mēnesi vecām 5XFAD pelēm, kuras tika hroniski ārstētas 3 mēnešus, LNK-754 samazināja amiloīda aplikuma slodzi un tau hiperfosforilāciju, kā arī mazināja BACE1 un LAMP1 uzkrāšanos distrofiskajos neirītos. 5-mēnesi vecām 5XFAD pelēm, kuras tika akūti ārstētas 3 nedēļas, LNK{11}} samazināja distrofiskā neirīta izmēru un LysoTracker-Green uzkrāšanos, neietekmējot A nogulsnes. Akūta ārstēšana ar LNK{13}} uzlaboja atmiņu un mācīšanās trūkumus hAPP/PS1 amiloidpelēm.

Atšķirībā no LNK-754, ārstēšana ar lonafarnibu bija mazāk efektīva, lai samazinātu plāksnes, tau hiperfosforilāciju un distrofiskus neirītus, ko varēja izraisīt samazināta iedarbība pret FTāzi, salīdzinot ar LNK-754. Mēs pētījām FTI ietekmi uz endolizosomu organellu aksonu apriti un atklājām, ka lonafarnibs un LNK{2}} uzlaboja retrogrādo aksonu transportu primārajos neironos, norādot, ka FTI varētu atbalstīt aksonu vēlo endosomu nobriešanu lizosomās. Turklāt ārstēšana ar FTI palielināja LAMP1 līmeni peles primārajos neironos un 5XFAD peļu smadzenēs, parādot, ka FTI stimulēja endolizosomu organellu bioģenēzi.

Secinājumi:

Mēs parādām jaunus datus, kas liecina, ka LNK{0}} veicināja aksonu apriti un endolizosomu nodalījumu darbību, kas, mūsuprāt, samazina aksonu distrofiju, samazina BACE1 uzkrāšanos un kavē amiloīda nogulsnēšanos 5XFAD pelēm. Mūsu rezultāti sakrīt ar iepriekšējo darbu, kurā FTase tika identificēts kā terapeitisks mērķis proteinopātiju ārstēšanai, un tam varētu būt nozīmīga terapeitiska ietekme AD ārstēšanā.

Atslēgvārdi:

Alcheimera slimība, distrofiski neirīti, farneziltransferāzes inhibitori.

Fons

Alcheimera slimība (AD) ir progresējoša neirodeģeneratīva slimība, kas ir visizplatītākais demences cēlonis iedzīvotāju novecošanai un kam raksturīgi būtiski traucējumi mācībās un atmiņā. Molekulārā līmenī AD smadzeņu raksturīgās iezīmes ir amiloīda (A) plāksnīšu uzkrāšanās un hiperfosforilētu tau ieslēgumu klātbūtne.

Agrīnās, asimptomātiskās AD stadijās A uzkrājas smadzenēs vairāk nekā divas desmitgades vai ilgāk pirms atmiņas traucējumu rašanās [1–3]. Līdz ar to smadzeņu A līmeņa samazināšana ir bijusi AD ārstēšanas stratēģiju galvenā uzmanība [4]. Pašlaik vienīgā slimību modificējošā terapija, ko nosacīti apstiprinājusi FDA, ir anti-A antiviela, kas no smadzenēm attīra agregētās A formas [5], apstiprinot, ka A mērķēšana smadzenēs ir daudzsološa pieeja AD ārstēšanai.

Tomēr lielākā daļa klīnisko pētījumu, kas vērsti uz A, ir bijuši neveiksmīgi drošības vai efektivitātes apsvērumu dēļ, un tagad uzsvars ir likts uz mērķiem, kuru pamatā ir dažādas AD hipotēzes, tostarp tau izplatīšanās, iekaisums, kalcija dishomeostāze un neirovaskulāri faktori [4, 6, 7 ]. Turklāt pieaug interese par lizosomu degradācijas ceļu aktivizēšanas terapeitisko potenciālu kā metodi patogēno proteīnu samazināšanai, kas ir raksturīga neirodeģeneratīvām slimībām [8–12].

Plaša endolizosomālo un autofagisko ceļu disfunkcija ir labi dokumentēta kā agrīns AD patoģenēzes notikums. Daudzi AD jutības ģenētiskie loki ir saistīti ar subcelulāro endolizosomālo transportu un lizosomu funkciju [13], un palielināti disfunkcionāli endolizosomālie un autofagiskie organelli uzkrājas AD smadzenēs distrofisko neirītu ietvaros [14, 15].

Šķiet, ka distrofiskie neirīti rodas pēc neironu bojājumiem, un AD gadījumā tiek ierosināts, ka tas ir mikrotubulu destabilizācija, ko izraisa A [16]. Tā rezultātā rodas fokusa aksonu pietūkums, kas izjauc A ražošanā iesaistīto galveno proteīnu, tostarp BACE1, normālos tirdzniecības un degradācijas ceļus [16, 17]. Rezultātā distrofijas rada A 42 un būtiski veicina ārpusšūnu aplikuma nogulsnēšanos un aksonu distrofiju [18], uzsākot padeves ceļu, izraisot sinaptiskos zudumus, neirodeģenerāciju un kognitīvos traucējumus [16].

Terapeitiskās stratēģijas, kas uzlabo endolizosomu un autofagisko organellu transportēšanu un aktivitāti, varētu novērst neirītisko distrofiju, uzturēt patogēno proteīnu degradāciju un būt kritisks mehānisms BACE1 un A līmeņa samazināšanai AD.

Turpinoties efektīvas AD ārstēšanas meklēšanai, atkārtoti izmantoto zāļu skaits AD klīniskajos pētījumos ir ievērojami pieaudzis, jo klīniski novērtētajām zālēm ir zināmas drošības un efektivitātes problēmas, tādējādi paātrinot zāļu izstrādes procesu [7, 19]. Pēdējos gados pētījumi ir identificējuši FTI kā zāļu klasi, ko var atkārtoti izmantot neirodeģeneratīvu slimību ārstēšanai.

FTI inhibē farnezilāciju, pēctranslācijas modifikāciju, kas regulē proteīnus, kuros farnezilpirofosfāts tiek kovalenti pārveidots par cisteīna atlikumiem proteīnos, kas satur CAAX motīvu [20]. Sākotnēji FTI tika izstrādāti, lai bloķētu onkogēno Ras aktivitāti, inhibējot tā prenilāciju, bet to lietošana tika pārtraukta vēža ārstēšanas klīniskajos pētījumos pēc alternatīvu Ras prenilēšanas ceļu atklāšanas [21, 22].

Tomēr pastāv daudzi FTāzes substrāti [23–25], kā rezultātā tiek novērtēti FTI attiecībā uz dažādiem traucējumiem, tostarp sirds un asinsvadu slimībām, D hepatītu un progēriju [20, 26]. Turklāt FTI ir pierādījuši solījumus attiecībā uz neirodeģeneratīvām slimībām, kurām raksturīga olbaltumvielu agregātu uzkrāšanās. Grauzēju un šūnu kultūru proteīnopātiju modeļos FTI inducē lizosomu aktivitāti un slimībai specifisku toksisku proteīnu proteolīzi [8, 9, 27, 28].\

Iepriekš mēs parādījām, ka LNK-754, FTI, kas pārbaudīts vēža pētījumos, uzlaboja lizosomu hidrolāzes apriti un samazināja alfa-sinukleīna (-sinukleīna) agregātus Parkinsona slimības (PD) pacientu izcelsmes neironos un PD peles modeļos [8 ].

Citi pētījumi ir ziņojuši par līdzīgiem FTI rezultātiem olbaltumvielu agregātu samazināšanai; PD šūnu kultūras modeļu ārstēšana ar FTI{0}} samazinātu sinukleīnu [28] un lonafarnibu, FDA apstiprinātu FTI progērijas ārstēšanai [29], palielinātu lizosomu aktivitāti un samazinātu tau ieslēgumu tauopātijas peles modelī [ 9]. Turklāt nesen veikts pētījums parādīja, ka neironu FTāzes ģenētiskā nojaukšana AD APP/PS1 peles modelī novērsa A paaudzi [30]. Iepriekšējos pētījumos, kuros tika novērtēti FTI proteīnopātijām, galvenā uzmanība tika pievērsta FTāzes substrātu lomai lizosomu aktivitātē un autofagijā.

Tomēr ir zināms, ka FTI veicina mikrotubulu (MT) stabilitāti un sinerģē ar MT stabilizējošām zālēm, lai uzlabotu tubulīna acetilāciju, izmantojot Ras neatkarīgu ceļu [31–33]. MT stabilizācija kavē AD patoloģiju APP/PS1 pelēm [34], un pašlaik AD ārstēšanai tiek klīniski pētīti vairāki MT stabilizējoši līdzekļi [35]. Tāpēc būtiski pierādījumi liecina, ka FTI var dot labumu slimībām, kurām raksturīgi disfunkcionāli proteīnu homeostāzes mehānismi, piemēram, AD. Tomēr mērķi un ceļi, kas savieno olbaltumvielu farnezilēšanu ar samazinātiem proteīnu agregātiem neirodeģeneratīvās slimībās, nav pilnībā izprotami.

Šajā pētījumā mēs novērtējām, vai farmakoloģiskā ārstēšana ar FTI var uzlabot ar A saistītu AD patoloģiju. Mēs novērtējām LNK-754 un lonafarniba, divu FTI, par kuriem zināms, ka tie samazina proteīnu agregātus neirodeģeneratīvos traucējumos, ietekmi uz aplikuma slodzi un distrofiskiem neirītiem amiloīda patoloģijas 5XFAD peles modelī. Mūsu rezultāti sniedz ieskatu ceļos, kurus ietekmē FTāzes inhibīcija, un stingri atbalsta turpmāku izmeklēšanu par FTI kā terapeitisku līdzekli AD un citām neirodeģeneratīvām slimībām, kurām raksturīga olbaltumvielu agregācijas palielināšanās.

materiāli un metodes

Dzīvnieki un narkotiku ārstēšana

Viss darbs ar dzīvniekiem tika veikts ar Ziemeļrietumu universitātes Institucionālās dzīvnieku aprūpes un lietošanas komitejas (IACUC) apstiprinājumu. Peles tika barotas ar standarta grauzēju čau diētu un ūdeni ad libitum, un tās tika izmitinātas ar standarta 12-stundu gaismas/tumsas ciklu. 5XFAD peles uz C57BL6 fona (Jackson Laboratories) tika uzturētas, krustojot transgēnu pozitīvas hemizigotas C57BL6 peles ar transgēnu negatīvām C57BL6 peļu mātītēm (Jackson Laboratories).

Mūsu hroniskās ārstēšanas protokolā ārstēšana ar zālēm tika uzsākta 2 mēnešu vecumā, vecumā, kurā sākas aplikuma nogulsnēšanās [36, 37]. Akūtās ārstēšanas protokolā ārstēšana ar zālēm tika uzsākta 5 mēnešu vecumā, pēc tam aplikuma nogulsnēšanās un aksonu deģenerācija ir plaši izplatīta [38, 39].

LNK{{0}} sintezēja Link Medicine (Massachusetts, ASV), un lonafarnibu ieguva no Cayman Chemical Company (Ann Harbor, MI). Dzīvnieku ārstēšanai LNK-745 un lonafarnibu pagatavoja karsētā 0,5% karboksimetilcelulozes (Sigma-Aldrich) šķīdumā kā nesējs koncentrācijā 0,10 mg/ml, līdz šķīdums izšķīdināja. skaidrs.

Alikvotas injekcijām tika sasaldētas –20 grādu temperatūrā un pēc tam atkausētas un uzglabātas 4 grādu temperatūrā katrai ārstēšanas nedēļai. Peles tika ārstētas pēc noteikta protokola, kas, kā zināms, uzlabo lizosomu aktivitāti [8]. Hroniskas ārstēšanas protokolā 2-mēnešus vecām 5XFAD pelēm katru dienu, izmantojot 29-izmēra insulīna šļirci, intraperitoneāli (ip) injicēja vai nu nesēju, LNK754 vai lonafarnibu 12 nedēļas, līdz pelēm bija 5 gadi. mēnešus vecs. Akūtās ārstēšanas shēmā 5-mēnešus vecām 5XFAD pelēm injicēja katru dienu 3 nedēļas.

Pēc ārstēšanas pabeigšanas peles tika anestēzijas un perfūzijas, un smadzenes tika savāktas turpmākām analīzēm (skatīt tālāk sadaļas). Šūnu kultūras eksperimentiem LNK-754 un lonafarnibs tika izšķīdināti DMSO un pievienoti peļu primāro neironu kultūrām 10 nM koncentrācijā 48 stundas. Transportlīdzekļa apstrāde bija līdzvērtīgs DMSO daudzums. Šūnas tika savāktas un analizētas, kā aprakstīts tālāk.

Antivielas

Imunofluorescences eksperimentos izmantotās antivielas bija žurku anti-LAMP1 (#1D4B, DSHB), trušu anti-A 42 (#700254, Invitrogen), trušu anti-BACE1 (#ab108394, Abcam), trušu anti-III tubulīnu (#ab18207, Abcam). Imunoblotēšanai izmantotās antivielas bija trušu anti-aktīns (#926–42,210, LI-COR), truša antip44/42 MAPK (pErk1/2) (#CS9101, Cell Signaling Technology), trušu anti-44/42. (Erk1/2) (#CS137F5, šūnu signalizācijas tehnoloģija), trušu anti-LAMP1 (#CS3234, šūnu signalizācijas tehnoloģija), peles anti-BACE (3D5; Zhao et al., 2007), peles anti-APP (6E10) ( #803001, BioLegend), trušu anti-p-tau (ser404) (#CS20194, šūnu signalizācijas tehnoloģija), peles anti-Tau1 (#MAB3420, Millipore Sigma), prelamīns-A, (#MABPT858, Millipore Sigma) un peles anti-Tau. -HDJ-2 (#sc-59,554, Santakrusa). Imunoblotiem tika izmantotas sekundārās anti-trušu vai peles antivielas no Vector Laboratories.

Uzvedības pārbaude

Dzīvnieki un narkotiku ārstēšana

Uzvedības analīzi veica reMYND, Inc., izmantojot hAPP/PS1 peles modeli ar cilvēka amiloīda prekursora proteīna klīniskā mutanta neironu specifisko ekspresiju kopā ar cilvēka presenilīna 1 klīnisko mutantu [40]. Šī dubultā transgēnā pele parāda spontānu, progresējošu A uzkrāšanos smadzenēs, kas galu galā izraisa amiloīda plāksnes subikulā, hipokampā un garozā 6 mēnešu vecumā. Šajā pētījumā tika izmantotas 48 hAPP/PS1 peļu mātītes FVB x C57Bl/6J fonā 6 mēnešu vecumā kombinācijā ar 12 vecuma atbilstošām mātītēm savvaļas tipa kontrolēm FVB x C57Bl/6J fonā. LNK-754 deva 0,9 mg/kg/dienā tika ievadīta ar orālo zondi vienu reizi dienā 12 dienas pēc kārtas. Dzīvnieku nogalināšana tika veikta 2 stundas pēc pēdējās dozēšanas.

Visas peles tika genotipizētas ar polimerāzes ķēdes reakciju (PCR) 3 nedēļu vecumā un saņēma unikālu identifikācijas numuru, tiklīdz bija zināmi PCR rezultāti. Visas peles pirms pētījuma sākuma tika atkārtoti pārbaudītas ar otro PCR. Visas peles bija aklas randomizētas un atbilstošas ​​vecumam. Pelēm ar datoru tika piešķirts nejaušs skaitlis un nejauši piešķirts ārstēšanai. Ārstēšanas grupa dzīvniekus ievietoja būros 15 dienas pirms pētījuma sākuma, lai viņi varētu iepazīties ar jauno būru kontekstu. Pelēm bija brīva piekļuve iepriekš filtrētam un sterilam ūdenim un standarta peļu ēdienam (Snif® Ms-H, Snif Spezialdiäten GmbH, Soest, Vācija). Pārtika tika uzglabāta sausos un vēsos apstākļos labi vēdināmā uzglabāšanas telpā. Ūdens un pārtikas daudzums tika pārbaudīts katru dienu, piegādāts pēc vajadzības un standarta atsvaidzināts reizi nedēļā. Sākotnēji peles tika izmitinātas apgrieztā dienas un nakts ritmā (14 stundas gaisma/10 stundas tumsa), sākot no pulksten 19.00 standarta RVS T2 tipa metāla būros (laukums 540 cm2).

Būri ir aprīkoti ar cietām grīdām un pakaišu pakaišu kārtām. Peļu skaitu vienā būrī ierobežoja vietējie tiesību akti par dzīvnieku labturību. 15 dienas pirms ārstēšanas sākuma peles tika atkārtoti ievietotas sprostos atsevišķos ventilējamos makrolona T2 būros un transportētas uz laboratoriju, lai aklimatizētu laboratorijas vidē, lai sagatavotos ārstēšanai. Laboratorijā dienas-nakts ritms tika mainīts uz 12h gaisma/12h tumsa, sākot no plkst.19.00.

Morisa ūdens labirints

Morisa ūdens labirints tika veikts 8.–12. ārstēšanas dienā, un dzīvnieki tika nogalināti tieši pēc zondes testa. Baseinā (balts, apaļš trauks 1 m diametrā) bija 20 grādu ūdens ar titāna dioksīdu kā bez smaržas, netoksisku piedevu, lai paslēptu evakuācijas platformu (1 cm zem ūdens līmeņa). Katras peles peldēšana tika filmēta un analizēta (Ethovision, Noldus Information Technology, Wageningen, Nīderlande). Pirms treniņa katra pele tika novietota uz platformas augšpusē uz 15 sekundēm. Vietas navigācijas testiem peles tika apmācītas atrast slēpto platformu septiņos trīs izmēģinājumu blokos četru dienu laikā pēc kārtas.

Katrs izmēģinājums sastāv no piespiedu peldēšanas testa, kas nepārsniedz 120 sekundes, kam seko 10 minūšu atpūta. Tika mērīts laiks, kas katrai pelei bija nepieciešams, lai atrastu platformu. Septiņi secīgie bloki rada mācīšanās līkni. 24 stundas pēc pēdējās apmācības katram dzīvniekam tika veikta zondes pārbaude ar noņemtu platformu. Pelēm tika atļauts meklēt 60 sekundes, un tika mērīts kvadrantu meklēšanas laiks un sākotnējās platformas pozīcijas krustojumi. Pēdējā zondes testa laikā pelēm tika atļauts meklēt platformas iepriekšējo atrašanās vietu 60 sekundes pēc platformas noņemšanas.

Primārā neironu kultūra

Priekšsmadzenes tika sadalītas Henksa līdzsvarotā sāls šķīdumā (HBSS) (Thermo Fisher #14185–052) no grūsnām savvaļas tipa C57BL6 pelēm (Džeksons) uz E15.5, lai iegūtu primāros neironus. Izdalītās priekšējās smadzenes tika sagremotas 2,5% tripsīnā 37 grādu temperatūrā 20 minūtes. Lai atdalītu neironus HBSS, tika izmantota uguns pulēta Pasteur pipete. Pēc tam neironi tika uzklāti uz sešu iedobju plāksnes, kas pārklāta ar poli-L-lizīnu, 2 × 106 neironi katrā iedobē neirobazālā barotnē, kas papildināta ar 2% B-27, 500 μM glutamīnu, 10% zirga serumu un 2,5 μM. glutamāts (viss no Thermo Fisher).

Barotne tika nomainīta 2 stundas vēlāk uz Neurobasal ar 2% B-27, 500 μM glutamīnu un 2,5 μM glutamātu. Pēc 24 stundām barotne tika nomainīta uz Neurobasal plus 2% B-27 un 500 μM glutamīnu. Puse mediju izmaiņas tika veiktas ik pēc 2–3 dienām. Primārie neironi tika kultivēti 7 dienas un apstrādāti ar nesēju (DMSO) vai 10 nM koncentrāciju LNK-754 vai lonafarnibu 48 stundas. Pēc tam neironi tika fiksēti vai tiešā veidā attēloti, kā aprakstīts tālāk.

Fiksācijai neironus inkubēja 20 minūtes 4% paraformaldehīdā, 0,12M saharozes 1XPBS, permeabilizēja 0,5% Triton X-100 un nakti inkubēja ar primārajām antivielām, kam sekoja ēzeļa anti-peles Alexafuor konjugētas sekundārās antivielas (Molecular Probes, 1:1000) un iekrāsotas ar 300 nM DAPI. Pārklājumi tika uzstādīti, izmantojot Prolong Gold (Molecular Probes), un attēli tika iegūti Nikon A1 konfokālajā mikroskopā ar 60X objektīvu (NA 1.4) un NIS Elements programmatūru.

Neironu dzīvā attēlveidošana

Eksperimentiem ar dzīvu attēlveidošanu neironi tika sagatavoti, kā norādīts iepriekš, un 7 dienas tika ievietoti 35 mm stikla dibena trauciņos (MatTek # P35G-1.5-14C) 7 dienas kultūrā. Pēc tam kondicionētajai barotnei pievienoja 10 nM LNK-754 vai lonafarnibu, kontroles kultūras tika apstrādātas ar DMSO kā nesēju. Pēc 48 stundu ilgas apstrādes barotne tika aizstāta ar kondicionētu barotni no neapstrādātām paralēlām neironu plāksnēm. Kondicionētajai barotnei pievienoja 25 nM LysoTracker-Green DND-26 (#L7526, Invitrogen), un neironus inkubēja 30 minūtes 37 grādu temperatūrā.

Neironu laika attēlveidošana tika veikta, izmantojot Ti2 platlauka mikroskopu. Attēlveidošana sākās nekavējoties 30 minūtēs un turpinājās ne ilgāk kā 30 minūtes. 1-s ekspozīcijas tika uzņemtas katru minūti, un 30 minūšu laikā tika attēloti 20–30 atsevišķi apgabali katrā traukā. LysoTracker daļiņu attāluma un ātruma kvantitatīvas noteikšanas un kimogrāfu analīzes tika veiktas, izmantojot NIS Elements programmatūru, un sīkāk aprakstītas tālāk. Atsevišķos eksperimentos kondicionētai datu nesējai tika pievienots 1 μM Lysosensor-Green DND{10}} (#L7535, Invitrogen), un dzīvu neironu attēli tika uzņemti ne ilgāk kā 15 minūtes, izmantojot Nikon A1 konfokālo mikroskopu ar 60 X objektīvu. (NA 1.4) un NIS Elements programmatūru.

For more information:1950477648nn@gmail.com