Osteopontīna ģenētika pacientiem ar hronisku nieru slimību: Vācijas hroniskas nieru slimības pētījums Ⅳ

Bāzes mainīgie un mērījumi

Standartizēts biomarķieru komplekts tika mērīts centrālajā sertificētā laboratorijā, izmantojot standartizētus protokolus [81]. Cita starpā kreatinīns un albumīns no seruma un urīna tika kvantificēti, izmantojot attiecīgi IDMS izsekojamo metodoloģiju (Creatinine plus, Roche, Vācija) un turbidimetrisko metodi (Tina-quant, Roche, Vācija) Roche/Hitachi MODULAR P. Glomerulārās filtrācijas ātrums (GFR) tika novērtēts, izmantojot CKD-EPI uz kreatinīna bāzes (vienība: ml/min/1,73 m2, [82]). UACR tika aprēķināts kā urīna albumīns/urī kreatinīns (mg/g, [83]). Sākotnējā apmeklējuma laikā tika ziņots par vecumu un dzimumu. 2015. gadā OPN tika mērīts no sākotnējās seruma paraugiem no visas GCKD pētījuma kohortas, izmantojot kvantitatīvu sendviča enzīmu imūntesta metodi (cietās fāzes ELISA; Quantikine Human OPN Immunoassay DOST00 no R&D Systems (R&D Systems Europe, Abingdon, Apvienotā Karaliste). )). Kvantitatīvā noteikšana tika veikta Klīniskās ķīmijas un laboratorijas medicīnas institūtā Greifsvaldē, Vācijā. Variācijas koeficienti (intratestā) bija attiecīgi 4,5%, 5,3% un 3,5% zemam, vidējam un augstam līmenim. Starppārbaudes variācijas koeficients bija 6,4%. Reaģenti un sekundārie standarti tika izmantoti, kā ieteicis ražotājs.

BIOLOĢISKS TRADICIONĀLS AUGS NIERU VESELĪBAI

Genotipēšana, kvalitātes kontrole un imputācija

Sīkāka informācija par genotipēšanu un datu tīrīšanu GCKD pētījumā ir aprakstīta iepriekš [18]. Īsumā, DNS tika izolēta no pilnām asinīm un genotipizēta ar 2 612 357 variantiem 5 123 GCKD dalībniekiem, izmantojot Illumina HumanOmni2.5 Exome BeadChip masīvu (Illumina, GenomeStudio, genotipēšanas moduļa versija 1.9.4) Minhenes centrā Helmholtz centrā. Datu tīrīšana tika veikta atsevišķi Omni2.5 saturam un masīva eksome mikroshēmas saturam. Pamatojoties uz standartizētiem protokoliem [84], Omni2.5 satura kvalitātes kontrolei (QC) tika izmantoti pielāgoti rakstiski skripti (R, Perl) un programmatūra Plink1.9 [85]. Uz paraugiem balstītās kvalitātes kontroles darbības ietvēra zvanu ātruma, dzimuma, heterozigotitātes, ģenētiskās izcelsmes un radniecības pārbaudes, kā rezultātā tika izslēgti 89 paraugi. Varianta līmenī viena nukleotīda polimorfismi (SNP) tika izslēgti, ja zvanu ātrums bija<0.96, and whenever the assumption of the Hardy-Weinberg equilibrium was violated (p-value <1.0E-05). After removing SNPs on duplicate positions, the cleaned dataset contained 5,034 individuals and 2,337,794 SNPs (S1 Fig). Genotypes were then imputed using minimac3 v2.0.1 at the Michigan Imputation Server [86]. The Haplotype Reference Consortium (HRC) haplotypes version r1.1 were used as the reference panel, and Eagle 2.3 was used for phasing. The final dataset contains data of 5,034 participants and 7,750,367 high-quality autosomal bi-allelic variants (imputation quality of R2 �0.3, MAF �1%). For the exome chip content, QC was similarly conducted [18]. In addition, checks specific for exome variants were added [87]. In brief, 96 individuals and 3,818 SNPs were removed, the latter of which had a call rate <0.95 and a Hardy-Weinberg equilibrium p-value <1.0E−05. The final exome chip dataset contains 5,027 participants with 226,233 variants (S1 Fig). For the exome chip association analysis, the genotypes were post-processed using zCall with a zscore threshold of six [88]. Genomic positions base on human genome build GRCh37.

Genoma mēroga asociācijas pētījums par izplatītiem variantiem

Kā ziņots iepriekš [17,18], GWAS tika veikta GCKD dalībniekiem ar pilnīgu genotipēšanu (Omni2.5), eGFR, UACR un log2(OPN) mērījumiem (N=4,897), izmantojot log2 lineāro regresiju. (OPN) uz SNP (aditīvais ģenētiskais modelis) ar MAF �1%, pielāgots vecumam, dzimumam, log (eGFR) un log (UACR) (S1 attēls). Asociācijas analīze tika veikta, izmantojot SNPTEST v2.5 [89]. Kopsavilkuma statistikas kvalitāte tika pārbaudīta, izmantojot GWAtoolbox [90], un inflācija, izmantojot genoma kontroli [91]. Tomēr genoma kontroles korekcija netika pieprasīta (λ=1.01). Asociācijas ar p-vērtību<5.0E-08 were considered significant. Per chromosome, an index SNP was defined as the SNP with the lowest genome-wide p-value with a 1-Mb interval centered around this SNP. This approach was repeated until no further SNP outside the interval(s) was available passing the genome-wide significance threshold. In order to discover further independent signals, we repeated GWAS analysis for chromosomes with significant results by conditioning on the genotype of the SNP with the lowest association pvalue of the respective chromosome. This procedure was repeated until no further genomewide signal was observed.

Variantu funkcionālā anotācija tika veikta, izmantojot ANNOVAR[92], SNiPA [93], Open Targets Genetics [94], FAVOR [95] un RegulomeDB [96]. Reģionālās asociācijas parauglaukumi tika uzzīmēti, izmantojot LocusZoom v1.3 [97].

Precīza kartēšana

Statistical fine-mapping [21] was carried out as previously described [17] for the two replicated SNPs within a region ±500kb. Approximate Bayes factors (ABFs) were then derived from the original GWAS statistics estimates. The SD prior was chosen as 0.61 because 95% of the effect size estimates fell within the −1.2 to 1.2 interval [21]. The ABF of the SNPs were used to calculate the posterior probability for each variant driving the association signal (PPA, 'causal variant'). Credible sets were determined by summing up PPA-ranked variants until the cumulative PPA was >99%.

Kolokalizācijas analīzes

Lai vēl vairāk izprastu asociāciju pamatā esošos molekulāros mehānismus un saistītos fenotipus, mēs veicām OPN GWAS kopsavilkuma statistikas kolokalizācijas analīzi saistībā ar diviem atkārtotajiem OPN lokusiem ar GWAS kopsavilkuma statistiku no trim citiem avotiem, kā norādīts tālāk. Visām kolokalizācijas analīzēm mēs izmantojām funkciju coloc.fast no R pakotnes gtx ar noklusējuma parametriem un iepriekšējām definīcijām (https://github.com/tobyjohnson/gtx), kas ir ieviesta kolokalizācijas metodes pielāgota versija. Giambartolomei et al. [98]. Mēs uzskatām par pozitīvu kolokalizāciju, ja dalīta cēloņsakarības varianta posterior varbūtība asociācijas lokusā abām pazīmēm (H4, p12) bija > 0.8.

Gēnu ekspresija.

Pirmkārt, mēs izmantojām GWAS kopsavilkuma statistiku par gēnu ekspresijas datiem no GTEx projekta [99] un NEPTUNE pētījuma [100]. eQTL dati no GTEx V8 (49 audi) un NEPTUNE pētījuma (NephQTL no glomeruliem un tubulointersticiālām nieru daļām) tika lejupielādēti no GTEx portāla (https://www.gtexportal.org/home/) un NephQTL tīmekļa vietnes (http://www.gtexportal.org/home/). attiecīgi ://nephqtl.org/. Kolokalizācijas analīzes soļi ir sīki aprakstīti citur [17]. Pirmkārt, tika iegūti GWAS kopsavilkumi par GTEx un NephQTL genoma reģionos ± 100 kb no diviem OPN SNP. Ekstrahētajā GWAS tiek identificēti gēni, un katram gēnam tiek noteikts cis logs ar 500 kb, kas atrodas blakus gēna sākumam un beigām. Pēc tam katram šādam cis gēna logam, kurā vismaz vienam SNP ir asociācijas p vērtība < 0, 001, tika iegūti GTEx un NephQTL audu GWAS kopsavilkumi, kā arī OPN GWAS un izmantoti kā ievade kolokalizācijas analīzei.