Gosipitrīns, dabiski sastopams flavonoīds, mazina dzelzs izraisītus neironu un mitohondriju bojājumus 3. daļa

Lūdzu sazinietiesoscar.xiao@wecistanche.comlai iegūtu vairāk informācijas

4. Materiāli un metodes 4.1. Reaģenti

Visi reaģenti tika iegūti no Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO, ASV). Gos izejas šķīdumus sagatavoja DMSO un pievienoja šūnu kultūrām vai mitohondriju preparātiem 1/1000 (o/o) atšķaidījumos.

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

4.2.Augu materiāls

Augu materiāli (ziedi) no Talipariti elatum (Sw.) (Syn. Hisbiscus elatus Sw.) (Malvaceae) tika savākti 2020. gada martā no Farmācijas un pārtikas zinātņu institūta, La Lisa, Pētniecības un bioloģiskās novērtēšanas centra apkārtējām teritorijām. , Havana, Kuba. To autentiskumu apstiprināja Kamagijas universitātes herbārijas speciālisti Ignacio Agramonte Loynaz, kur tika deponēti kuponu paraugi: G. Pardo., HPC-12 520 (HIPC).

Cistanche var uzlabot imunitāti

4.3. Ekstrakta un parauga sagatavošana

Theetanolsekstrakti tika sagatavoti no Telatum sarkanajiem ziediem, kā ziņots iepriekš [29]. Pēc rotācijas iztvaicēšanas cietās vielas tika attīrītas ar atkārtotas kristalizācijas procedūrām[29]. Izolētie savienojumi tika raksturoti ar 1D'H(400 MHz) un 13C (100 MHz) KMR. KMR datu apstrāde tika veikta ar MestReNova programmatūras versiju 6.1.0-6224 operētājsistēmai Windows (papildu materiāli, S1-S3 attēli). No Gos savāktie KMR dati tika salīdzināti ar iepriekšējiem rezultātiem [56].

4.4. UV/Vis un IR spektroskopiskie pētījumi

UV/Vis spektri tika veikti kvarca kivetēs ar 10 mm optiskā ceļa garumu, un absorbcija tika reģistrēta UV-Vis.spektrofotometrsUltrospec 2100 Pro no Amersham BioSci (Little Chalfont, UK) istabas temperatūrā savienots ar datoru ar Wave Scan programmatūru (SWIFT I, 1.2). Mijiedarbība starp Gos un dzelzs joniem tika mērīta, novērojot izmaiņas UV/Vis spektrā. Lai noteiktu stehiometrisko attiecību starp Gos un Fe (II) jonu, tika izmantota Džoba metode. Gos un Fe (lI) izejas šķīdumus katru dienu sagatavoja attiecīgi metanola un fosfāta buferšķīdumā. IR spektri tika reģistrēti ar JASCO FI/IR-440 spektrometru diapazonā 4000-400 cm-I, paraugu sagatavošanai izmantojot kālija bromīda granulas.

4.5. Šūnu kultūras

PelehipokampuHT-22 šūnas (ATCC) tika kultivētas DMEM barotnē, kas papildināta ar 10% FCS, L-glutamīnu (1 mM) un penicilīnu/streptomicīnu (1 procents), un tika uzturēta 37 grādu temperatūrā mitrinātā 5% CO2. inkubators. Šūnas (2 × 104 šūnas/iedobē) tika iesētas 96-iedobju plāksnēs (Nunc, Roskilde, Dānija) 200 μL barotnes 24 stundas 37 °C temperatūrā.

4.6. Šūnu Oxidaticoe bojājumu izraisīšana un ārstēšana ar Gos

Gos (0.001-100 μM）) neiroprotektīvā darbība tika pārbaudīta uz HT-22, 24 h līdzinkubējot ar Gos vai Trolox (500 μM), FeCl2 (100 μM) , un citrāts (1 mM). Pēc 24 stundām šūnu supernatants tika noņemts un šūnu dzīvotspēja tika noteikta ar [3-(4,5-dimetiltiazols-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds] (MTT) kolorimetriskā pārbaude.

4.7. Šūnu dzīvotspējas tests

Pēc apstrādes šūnas (2 × 104) 3 stundas 37 ° C temperatūrā inkubēja ar 10 uM MTT. Pēc tam krāsainais MTT atvasinājums tika izšķīdināts 50 μL DMSO, un absorbcija tika skaitīta pie 570 nm mikroplašu lasītājā (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberga, Vācija). Šūnu dzīvotspēja ir izteikta procentos pret neapstrādātu šūnu kontroli.

4.8. Mitohondriju membrānas potenciāla (△Y) tests HT-22 šūnās

Mitohondrijumembrānas potenciāls tika novērtēts, pamatojoties uz fluorescējošās katjonu zondes rodamīna 123 šūnu aizturi [57,58]. Pēc 2 h dzelzs/askorbāta ievainojuma, ja nav (kontroles) vai Gos (0.001-100 μM） vai Trolox（500 μM）) klātbūtnes, neironu šūnas （2 ×10*) tika inkubēti 10 minūtes ar 1 μM rodamīnu 123. Pēc centrifugēšanas un atkārtotas suspendēšanas 1 ml 0,1% Triton X-100 zondes koncentrācija tika noteikta supernatantā, izmantojot mikroplašu lasītāju (FLUOstar Omega, BMG). LABTECH, Ortenberga, Vācija) pie 505/535 nm ierosmes / emisijas viļņa garuma pāra. Dati ir izteikti procentos pret neapstrādātu šūnu kontroli.

4.9.ATP tests

Šūnu ATP tika noteikts ar ugunspuķu luciferīna/luciferāzes testa sistēmu [59] tādos pašos apstākļos kā AY. Bioluminiscence tika mērīta ar Sigma-Aldrich testa komplektu saskaņā ar ražotāja norādījumiem, izmantojot mikroplašu lasītāja luminiscences opciju (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberg, Vācija).

4.10.Dzīvnieki

Wistar žurku tēviņi (200 g) tika iegūti no Laboratorijas dzīvnieku ražošanas centra (CENPALAB saskaņā ar tā spāņu akronīmu Havana, Kuba) un tika izmitināti dzīvnieku aprūpes iestādē 1 nedēļu pirms eksperimentiem temperatūrā, kas kontrolēta vide (22-24 grāds), ar 12-h gaismas/tumsas ciklu un piekļuvi pārtikai un ūdenim ad libitum.

4.11.Mitohondriju izolācija

Žurku priekšējo smadzeņu mitohondriji tika izolēti ar diferenciālu centrifugēšanu, kā aprakstīts iepriekš [60]. Digitonīns 10 procenti tika izmantots, lai izjauktu sinaptosomas un iegūtu ne-sinaptosomu un sinaptosomu mitohondriju maisījumu. Visa procedūra tika veikta 4 grādu temperatūrā. Elpošanas kontroles attiecība (stāvoklis 3/stāvoklis 4 elpošanas biežums) vienmēr bija diapazonā no 4,5 līdz 6,0, mērot, izmantojot 5 mM sukcinātu kā substrātu.

4.12. Nepārtrauktas uzraudzības mitohondriju testi

Mitohondriju membrānas potenciāls tika noteikts spektrofluorimetriski, izmantojot 10 μM safranīna O kā zondi 【58,61】 mikroplašu lasītājā (FLUOstar Omega, BMG LABTECH, Ortenberga, Vācija) pie 495/586 nm ierosmes/emisijas viļņa garuma; šīs pārbaudes tika veiktas 0,1 mM EGTA un 2 mM K, HPOA klātbūtnē. Mitohondriju pietūkums tika novērtēts spektrofotometriski no šķietamās absorbcijas samazināšanās pie 540 nm. Pārbaudēm mitohondriji tika baroti ar 5 mM kālija sukcinātu (plus 2,5 uM rotenonu) standarta barotnē, kas sastāvēja no 125 mM saharozes, 65 mM KC un 10 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 30 grādu temperatūrā.

4.13. Lipīdu peroksidācijas testi

Lipīdu peroksidācija tika novērtēta pēc malondialdehīda (MDA) veidošanās [28,62]. Mitohondriji (1 mg/mL) tika pakļauti 4 mM terc-butilhidroperoksīda vai 50 uM Fe(II) plus 1 mM nātrija citrāta iedarbībai 37 °C temperatūrā. MDA koncentrācija tika aprēķināta, izmantojot tā ekstinkcijas koeficientu (c =1). 56 × 105 M-1.cm-1).

4.14. Fe(II) koncentrācijas noteikšana

Fe(ⅡI) koncentrācija tika noteikta 10 mM fosfāta buferšķīdumā pH 6,5 (2 ml), veidojot sarkanu kompleksu ar 1,10-fenantrolīnu (5 mM), kā aprakstīts iepriekš [24,28].

4.15.Skābekļa patēriņa uzraudzība

O patēriņš, kas saistīts ar Fe(ⅡI) oksidāciju, tika mērīts ar Clark tipa elektrodu (Hansatech Instruments, Pentney, King's Lynn, UK) 13-ml stikla kamerā, kas aprīkota ar magnētisko maisītāju, plkst. 30 grādi. Skābekļa patēriņa ātrums (ROC) tika izteikts kā nmol O2/mL minūtē.

4.16.2-Dezoksiribozes oksidācijas tests

Hidroksil("OH) radikāļu veidošanās tika novērtēta, sekojot 2-dezoksiribozes noārdīšanai līdz MDA, kas tika aprēķināta no tā ekstinkcijas koeficienta (e=1.56 × 10 grādi M-1·). cm-), kā ziņots iepriekš [26, 27].

4.17. Gos-Fe(II) kompleksu noteikšana

Fe (ⅡI) (FeCl,0.4-1.6 μM) tika pievienots 2 ml (10 mM) fosfāta buferšķīdumam (pH 6,5), kas satur 2 mM citrāta un 1,6 μM Gos. Viļņa garuma skenēšana no 200-600 nm tika veikta Hitachi 2001 spektrofotometrā (Hitachi, Tokija) 28 grādu temperatūrā.

4.18. Statistiskā analīze

Tika izmantots GraphPad Prism 5.{1}}(GraphPad Software, Inc., Sandjego, CA, ASV). Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot vienvirziena ANOVA, kam sekoja Studenta-Ņūmena-Keula posthoc tests pāru salīdzināšanai. Rezultāti ar p<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" the="" half-effective="" or="" inhibitory="" concentrations="" were="" estimated="" following="" a="" non-linear="" regression="">

Papildu materiāli: tiešsaistē ir pieejami šādi materiāli. S1 attēls: gosipitrīna 1H-NMR (400 MHz) spektrs DMSO-do, S2 attēls:13C-NMR (101 MHz) gosipitrīna spektrs DMSO-d, S3 attēls: gosipitrīna HSQC spektrs DMSO-dg. S1 tabula: Gosipitrīna H (400 MHz) un 13C (100 MHz) dati salīdzinājumā ar iepriekšējo ziņojumu.

Autora ieguldījums:Konceptualizācija, G.LP.-A.; metodoloģija, MAB-V., RFD, YM-P.un GLP-A.; validācija, MAB-V., JM-P., YM-P un RFD; formālā analīze, YM-P, JM-P, RF-A. un GLP-A.; izmeklēšana, MAB-V, AA-L., DA-A., YM-P., RFDun GLP-A.; Datu pārvaldīšana, MAB-V.YM.-PJM-P.un RF-A.; rakstīšana — oriģinālā projekta sagatavošana, MAB-V.; rakstīšana — pārskatīšana un rediģēšana, IM.-P, RF-A., YM-P un GLP-A.; vizualizācija, YM-P. un GLP-A.; uzraudzība, GLP-A.; finansējuma iegūšana, GLP-A.Visi autori ir izlasījuši un piekrituši publicētajai manuskripta versijai.

Finansējums: šo pētījumu finansēja VLIR (Beļģija); dotācijas numurs CU2018TEA457A103 un Ministrio de Ciencia Tecnologia y Medio Ambiente (Kuba); dotācijas numurs PN223LH010-035. APC finansēja VLIR (Beļģija); dotācijas numurs CU2018TEA457A103.

Institucionālās pārbaudes padomes paziņojums:Pētījums tika veikts saskaņā ar Helsinku deklarācijas vadlīnijām, un to apstiprināja Kubas Havanas Universitātes Farmācijas un pārtikas zinātņu institūta Institucionālā ētikas komiteja (protokola kods IFAL-CEI 087-2019, 2019. gada oktobris) .

Informētas piekrišanas paziņojums: Nav piemērojams. Paziņojums par datu pieejamību: Nav piemērojams.

Pateicības:Šo darbu daļēji atbalstīja Vlaamse Interuniversitaire Raad (VLIR)-Beļģija/Ministerio de Educacion Superior (MES)-Kuba projekts CU2018TEA457A103, kas sedza arī rakstu apstrādes maksas, un projekts PN223LH010-035 no "Ministerio de". Ciencia Tecnologia y Medio Ambiente (Kuba), Programa de Ciencias Basicas y Naturales". Interešu konflikti: autori paziņo, ka nav interešu konflikta.

Paraugu pieejamība: Savienojumu paraugi ir pieejami no atbilstošā autora.