Vīnogu sēklu ekstrakta veselībai labvēlīgās īpašības un tā ietekme uz atsevišķiem bioķīmiskiem marķieriem Rattus Norvegicus asinīs, aknās un nierēs
Mar 10, 2022
Abstract:Kadmijs (Cd) ir smagais metāls, kas sastopams visās vides zonās, tostarp barības ķēdē. Organismā tas izraisa oksidatīvo stresu, radot brīvos radikāļus, kas ir kaitīgi šūnām. Vīnogu kauliņu ekstrakts (GSE) satur plašu bioloģiski aktīvo komponentu klāstu, kas palīdz neitralizēt brīvo radikāļu nelabvēlīgo ietekmi. Šajā pētījumā tika uzraudzīta GSE, kas pagatavota no daļēji rezistentas vīnogu šķirnes Season, kas ir bagāta ar fenoliem, ietekme uz brūno žurku bioķīmiskajiem marķieriem, kas pakļauti kadmija iedarbībai. GSE palielināja plazmas antioksidantu aktivitāti un,nieresun aknās, Cd saturs tika ievērojami samazināts, vienlaikus lietojot GSE. Attiecīgi, GSE vienlaicīga lietošana palēnināja kreatinīna satura un alanīna aminotransferāzes aktivitātes pieaugumu un kadmija izraisīto katalāzes un superoksīda dismutāzes aktivitāšu samazināšanos. Šī darba rezultāti atklāj, ka vīnogu kauliņu ekstrakts nodrošina aizsargājošu efektu pret smago metālu iekļūšanu organismā.
1. Ievads
Kadmijs (Cd) ir smagais metāls, kas sastopams visās vides zonās; tā ir daļa no Zemes garozas, atrodas ūdenī, uzkrājas augos un atrodas organismos. Papildus pārtikas ķēdei (augiem lielākā daļa graudaugu, sakņu kultūru un dārzeņu ir avoti, savukārt dzīvnieku orgānos galvenokārt aknas unnieresir avots), svarīgs kadmija avots cilvēkiem ir cigarešu dūmi, izelpas no dažāda veida sadegšanas, metalurģijas nozares un dažas elektroinstalācijas [1,2]. Organismā kadmijs galvenokārt saistās ar metalotioneīnu, albumīnu un citiem plazmas proteīniem asinīs. Kadmijs ir bīstams toksisks metāls, kas izraisa oksidatīvo stresu, radot brīvos radikāļus, kas ir kaitīgi šūnām. Brīvie radikāļi var bojāt olbaltumvielas, lipīdus, enzīmus un DNS, tāpēc pirms iekļūšanas šūnās tie ir neitralizēti ar antioksidantiem [3].
Ja Cd netiek neitralizēts, tas izraisa sarkano asins šūnu sadalīšanos [4], uzkrājas organismā, īpaši aknās unnieres—un tā līdzības dēļ ar cinku, kas ir būtisks elements, viegli iekļūst fermentatīvās reakcijās un piedalās bioķīmiskos procesos [5]. Tas no organisma izdalās ļoti lēni un ar grūtībām [6]. Ir labi zināms, ka antioksidantiem var būt aizsargājoša iedarbība pret oksidatīvo stresu un smago metālu bojājumiem, un šis eksperimentālais darbs tika balstīts uz šo faktu. Vīnogu sēklu ekstrakts (GSE) savā matricā satur plašu bioloģiski aktīvo komponentu klāstu [7], kas palīdz neitralizēt brīvo radikāļu nelabvēlīgo ietekmi. GSE aizsargā šūnas no bojājumiem, regulējot šūnu oksidatīvos bojājumus, samazinot orgānu bojājumus, uzlabojot līdzsvaru starp oksidantiem un antioksidantiem un samazinot iekaisuma mediatoru izdalīšanos. Tam ir arī pretiekaisuma, antiapopotiska un proproliferatīva iedarbība [8]. Īpaši nozīmīgs ir augsts kondensētā flavan-3-ola vai procianidīnu saturs, kas tiek pētīti kā alternatīva nopietnu slimību ārstēšanas metode [9,10]. Tomēr vīnogu sēklu fenola saturu un sastāvu, kā arī sēklu ekstrakta antioksidantu aktivitāti var ietekmēt vīnogu šķirne, potcelms, klimatiskie apstākļi vai audzēšanas metodes [11–13] un līdz ar to antioksidanta īpašības, kā kā arī betona ekstrakta aizsargājošo iedarbību, nevar viegli paredzēt. Šī darba mērķis bija izpētīt no daļēji rezistentas vīnogu šķirnes Cerason iegūtās GSE aizsargājošo iedarbību uz bioķīmiskajiem marķieriem asinīs, plazmā, aknās unnieresbrūnajām žurkām, kuras bija pakļautas kadmija iedarbībai.
Atslēgvārdi:vīnogu sēklu ekstrakts; antioksidanti; kadmijs; rattus norvegicus; bioķīmiskie marķieri; aizsargājoša iedarbība; nieres, nieres
CISTANČE UZLABOS NIeru/NIeru FUNKCIJU
2. Rezultāti un diskusija
2.1. Vīnogu sēklu ekstrakta antioksidanta aktivitāte un fitoķīmiskais sastāvs
Vīnogu sēklu ekstraktam, kas sagatavots no daļēji izturīgās šķirnes Cerason, tika pārbaudīta antioksidanta aktivitāte, kopējais polifenolu saturs un atlasīti atsevišķi antioksidanti. Antioksidantu aktivitāte tika noteikta spektrofotometriski, izmantojot četras metodes, kas balstītas uz dažādiem principiem (DPPH• , ABTS• plus , FRAP, FR), un kopējais polifenolu savienojums tika noteikts ar Folina-Čokalteu metodi. Atkarībā no izmantotās metodes antioksidanta aktivitāte bija robežās no 7 līdz 31 mg/g gallskābes ekvivalenta (GAE), un kopējais polifenolu saturs bija 9,3 mg/g GAE (1. tabula). Šīs eksperimenta daļas rezultāti norādīja uz augsto antioksidantu potenciālu vīnogu sēklās.
2.2. Vīnogu sēklu ekstrakta iedarbības noteikšana in vivo žurkām
2.2.1. Kadmija satura noteikšana asinīs, aknās un nierēsKadmijs ir visizplatītākais toksiskais metāls barībā. Pēc iekšķīgas lietošanas tas uzsūcas no zarnām, tiek transportēts uz aknām un konjugēts ar metalotioneīna (MT) tiola grupām. Bez tam Cd var būt saistīts arī ar albumīnu vai citiem proteīniem asinīs [14]. Pēc tam Cd uzkrājas organismā, izdalās no organisma tikai lēni ar urīnu un fekālijām, un tā bioloģiskais pusperiods ir aptuveni 20 gadi. Lielākais daudzums (apmēram trešdaļa) kadmija ir atrodamsnieresgaroza. Asinīs lielākā daļa kadmija (apmēram 90 procenti) atrodas sarkanajās asins šūnās. Tas ir toksisks daudziem orgāniem, un galvenie mērķi irnieres, kauli un plaušas [15–17]. Ir ziņots, ka GSE samazina kadmija koncentrāciju sarkanajās asins šūnās unnieres,tā kā ir ziņots, ka tā saturs aknās palielinās [14]. Rezultāti par kadmija saturu asinīs šajā pētījumā ir parādīti 1.A attēlā. Eksperimenta sākumā dzīvnieku asinīs tika konstatēts 3,2 µg/kg kadmija. Eksperimenta laikā pēc 14 dienām vidējā kadmija vērtība grupā ar GSE un kadmija pievienošanu bija ievērojami augstāka nekā citās grupās (10,8 µg/kg, p=0,023). Pēc 28 dienām datu mainīgums bija pārāk liels, lai novērotu statistisko nozīmīgumu.
Eksperimenta sākumā kadmijs netika konstatēts eksperimentālo dzīvnieku aknās (1.B attēls). Attiecīgi eksperimenta laikā kontroles un GSE grupas dzīvnieku aknās netika konstatēts kadmijs. Savukārt pēc 14 eksperimenta dienām vidējā kadmija vērtība grupā ar kadmija pievienošanu bija 5,8 mg/kg un grupā ar kadmija un GSE pievienošanu vidējā vērtība bija 5,2 mg/kg. Abas šīs vērtības būtiski atšķīrās no kontroles grupas (attiecīgi p=0,002 un p=0,018 tikai kadmija grupai un grupai ar kadmiju un GSE). Pēc 28 dienām vidējā vērtība grupā ar kadmija pievienošanu bija palielinājusies līdz 6,7 mg/kg, kas būtiski atšķīrās no kadmija līmeņa grupā ar kadmija un GSE pievienošanu, kas bija nedaudz samazinājies līdz 4,8 mg/kg. (p=0.008).
Eksperimenta sākumā kadmijs netika atklātsnieres(1.C attēls). Attiecīgi kadmijs netika konstatētsnieresno kontroles un GSE grupas dzīvniekiem eksperimenta laikā. Savukārt pēc 14 dienām vidējā kadmija vērtība grupā ar kadmija pievienošanu bija 9,5 mg/kg un grupā ar kadmija un GSE pievienošanu vidējā vērtība bija 6,5 mg/kg. Abas šīs vērtības būtiski atšķīrās no kontroles grupas (p < 0,001="" abām="" grupām).="" pēc="" 28="" dienām="" vidējā="" vērtība="" grupā="" ar="" kadmija="" pievienošanu="" bija="" palielinājusies="" līdz="" 16,6="" mg/kg,="" kas="" būtiski="" atšķīrās="" no="" kadmija="" līmeņa="" grupā="" ar="" kadmija="" un="" gse="" pievienošanu,="" kas="" bija="" tikai="" nedaudz="" palielinājusies="" līdz="" 10,4="" mg/kg.="" kg="" (p="0.009)." tādējādi="">nieresun aknās Cd saturs tika ievērojami samazināts, ievadot GSE. GSE satur fenola savienojumus, kas var helatēt Cd, tādējādi samazinot Cd uzkrāšanos. Šo helātu veidošanās, iespējams, izraisīja samazinātu olbaltumvielu spēju saistīt Cd, ko tādējādi varēja efektīvāk izvadīt no organisma [18].
2.2.2. Kreatinīna un urīnvielas satura noteikšana
Attiecībā uz kadmija uzkrāšanosnieres,nieresir viens no svarīgākajiem Cd izraisītās toksicitātes mērķa orgāniem. Tāpēc,nieresplazmā tika noteikti marķieri kreatinīns un urīnviela. Kreatinīna noteikšana ir labs glomerulārās filtrācijas rādītājs, un to galvenokārt izmanto, lai uzraudzītunieru slimība. Saistība starp kreatinīna koncentrāciju un glomerulāro filtrāciju ir hiperboliska; samazinoties glomerulārajai filtrācijai, samazinās arī kreatinīna sekrēcija [19]. Palielināta smago metālu kadmija uzņemšana noved pienieru bojājumi, un tādējādi samazināta kreatinīna sekrēcijas efektivitāte. Tā rezultātā paaugstināts kreatinīna līmenis asinīs norāda anierutraucējumi [20].
Mūsu pētījumā kreatinīna līmeni paaugstināja Cd saskaņā ar iepriekš publicētajiem rezultātiem [21]. Vidējā kreatinīna satura vērtība (2.A attēls) eksperimenta dzīvniekiem eksperimenta sākumā bija 3.0 mg/L. Grupā, kas saņēma kadmiju, novērotās vērtības ievērojami palielinājās līdz 5,1 mg/l (pēc 14 dienām, p=0.015) un līdz 6,2 mg/L (pēc 28 dienām, p < 0.001).="" grupā,="" kurai="" gse="" tika="" lietots="" vienlaikus="" ar="" kadmiju,="" šī="" marķiera="" pieaugums="" bija="" mazāks="" (4,2="" mg/l="" pēc="" 14="" dienām="" un="" 5,5="" mg/l="" pēc="" 28="" dienām)="" un="" statistiski="" nozīmīgs="" tikai="" pēc="" 28="" dienām,="" salīdzinot="" ar="" kontroli="" (="" p="">< 0,001).="" tādējādi="" gse="" vienlaicīga="" lietošana="" palēnināja="" kreatinīna="" koncentrācijas="" pieaugumu,="" kas="" liecina="" par="" kadmija="" izraisītās="" toksiskās="" iedarbības="" samazināšanos.="" grupā,="" kas="" saņēma="" tikai="" gse,="" bija="" normālas="">
Urīnviela kvantitatīvi ir vissvarīgākais aminoskābju un olbaltumvielu sadalīšanās produkts. Tas veidojas aknās no amonjaka, kas izdalās deaminācijas reakcijās aminoskābju metabolisma laikā. Tas no organisma izdalās galvenokārt arnieresglomerulārās filtrācijas un tubulārās rezorbcijas ceļā [22]. Gadījumā, janieru slimības, urīnvielas ražošanas ātrums pārsniedz tā klīrensa ātrumu, kā rezultātā palielinās urīnvielas līmenis asinīs. Turklāt kadmijs kavē aminoskābju iekļaušanu olbaltumvielās, izraisot urēmiju [21]. Savukārt, ja aknu darbība ir traucēta, samazinās urīnvielas sintēze un līdz ar to arī tā koncentrācija plazmā [20]. Tādējādi urīnvielas koncentrācija asinīs ir atkarīga no olbaltumvielu satura uzturā,nieruizdalīšanos un aknu vielmaiņas funkciju.
Mūsu pētījumā urīnvielas līmeni paaugstināja Cd saskaņā ar iepriekš publicētajiem rezultātiem [21]. Vidējā urīnvielas satura vērtība (2.B attēls) eksperimenta dzīvniekiem eksperimenta sākumā bija 207 mg/l. Grupā, kas saņēma kadmiju, novērotās vērtības ievērojami palielinājās līdz 329 mg/l (pēc 14 dienām) un 425 mg/l (pēc 28 dienām). Grupā, kurai GSE tika ievadīts vienlaikus ar kadmiju, šī marķiera pieaugums bija tikai nedaudz mazāks — 325 mg/l pēc 14 dienām un 381 mg/l pēc 28 dienām. Abas grupas, kas saņēma tikai kadmiju un kadmiju kopā ar GSE, būtiski atšķīrās no kontroles grupas pēc 14 (attiecīgi p=0,001 un p=0,002) un 28 eksperimenta dienām (p < 0,001).="" abiem).="" grupā,="" kas="" saņēma="" tikai="" gse,="" tika="" konstatētas="" normālās="">
2.2.3. Plazmas antioksidantu aktivitātes noteikšana
Kadmijs izraisa virkni efektu, kas galvenokārt saistīti ar oksidatīvo stresu. Tā kā Cd nav redoksaktīvs, tas tieši nerada reaktīvās skābekļa sugas. Neskatoties uz to, to ražošana pēc Cd iedarbības ir ziņots daudzos pētījumos, un tos ir pārskatījuši Cuypers et al. [23]. Mehānismi, kas izraisa redoksu traucējumus Cd iedarbības laikā, ietver samazināta glutationa samazināšanos, ko izraisa Cd afinitāte pret tiola grupām, Fe aizstāšanu ar Cd proteīnos, kas palielina redoksaktīvā brīvā Fe koncentrāciju, mitohondriju disfunkciju un NADPH oksidāzes, kas katalizē superoksīda radikāļu veidošanos [23]. Oksidatīvā stresa laikā antioksidanti, piemēram, fenoli, var pārtraukt jaunu reaktīvo sugu veidošanos, pārvēršoties stabilās radikāļu formās. Tāpēc ar fenoliem bagāti augu ekstrakti var nodrošināt aizsargājošu iedarbību pret Cd vai Cd saturošiem savienojumiem [24].
Šajā pētījumā vidējā plazmas antioksidantu aktivitātes vērtība (3. attēls) eksperimentālajiem dzīvniekiem eksperimenta sākumā bija 0,71 mg/L. Visās eksperimentālajās grupās tika novērots neliels pieaugums, salīdzinot ar kontroles grupu. Tomēr vienīgā nozīmīgā atšķirība bija starp GSE ārstēto grupu un kontroles grupu pēc 28 dienām (p=0,012), kas apstiprina GSE pozitīvo ietekmi uz plazmas antioksidantu aktivitāti. Iepriekš ziņotie rezultāti ir neskaidri; dažreiz tika konstatēts GSE izraisīts plazmas antioksidantu potenciāla pieaugums [25] un dažreiz nē [14].
2.2.4. ALT un AST aktivitāšu noteikšana
Oksidatīvais stress ir saistīts ar membrānas arhitektūras funkcionālās integritātes zudumu, ko izraisa palielināta lipīdu peroksidācija. Savukārt palielināta citoplazmas membrānas caurlaidība izraisa aknu marķieru enzīmu (ALT un ASAT) noplūdi asinīs [14]. Patiešām, ALAT un ASAT ir diagnostiski nozīmīgi pat ierobežotu aknu bojājumu gadījumā, ko izraisa intoksikācija, un kadmija izraisīts to pieaugums serumā tika ziņots iepriekš [14], un to apstiprināja šis pētījums. Vidējā ALAT aktivitātes vērtība (4.A attēls) eksperimentālajiem dzīvniekiem eksperimenta sākumā bija 0,84 µkat/L. Grupā, kas saņēma kadmiju, tika reģistrēts ievērojams novēroto vērtību pieaugums līdz vidēji 1,52 µkat/L pēc 14 dienām (p < 0,001)="" un="" 1,87="" µkat/l="" pēc="" 28="" dienām="" (p="" {{="" 13}}.004).="" grupā,="" kurai="" gse="" tika="" ievadīts="" vienlaikus="" ar="" kadmiju,="" šī="" marķiera="" palielināšanās="" bija="" ievērojami="" lēnāka="" nekā="" grupā,="" kas="" saņēma="" tikai="" kadmiju="" (1,23="" µkat/l="" pēc="" 14="" dienām="" un="" 1,92="" µkat/l="" pēc="" 28="" dienām).="" pēc="" 14 dienām="" pēc="" eksperimenta="" šī="" grupa="" atšķīrās="" gan="" no="" kontroles="" grupas="" (p="0.009)," gan="" no="" kadmija="" grupas="" (p="0.026)," savukārt="" pēc="" 28 dienām="" tā="" būtiski="" atšķīrās.="" tikai="" no="" kontroles="" grupas="" (p="0.003)." grupā,="" kas="" saņēma="" tikai="" gse,="" vērtības="" arī="" palielinājās="" līdz="" 1,17="" µkat/l="" pēc="" 14="" dienām.="" šī="" vērtība="" būtiski="" atšķīrās="" no="" kontroles="" grupas="" (p="0.024)" un="" bija="" salīdzināma="" ar="" vērtību="" grupā,="" kas="" saņēma="" gan="" gse,="" gan="" kadmiju.="" pēc="" 28="" dienām="" tikai="" gse="" grupas="" vērtības="" atgādināja="" kontroles="">
Vidējā AST satura vērtība (4.B attēls) izmēģinājuma dzīvniekiem eksperimenta sākumā bija 2,07 µkat/L. Grupā, kas saņēma kadmiju, statistiski nozīmīgs novēroto vērtību pieaugums tika reģistrēts tikai pēc 28 eksperimenta dienām (3,52 µkat/L, p=0,001). Pārsteidzoši, ka grupā, kurai GSE tika lietots vienlaikus ar kadmiju, šī marķiera palielināšanās bija ātrāka un būtiski atšķirīga no kontroles grupas gan pēc 14 dienām, gan pēc 28 dienām (attiecīgi 2,67 un 2,84 µkat/L, p {{15). }}.043 abiem), lai gan vērtība pēc 28 dienām bija nedaudz zemāka nekā tikai kadmiju saturošajai grupai. Tikai GSE variantam bija normālas vērtības.
Mūsu eksperimentā GSE ievadīšana spēja palēnināt ALT aktivitātes pieaugumu. Šis efekts atbilst iepriekš ziņotajiem rezultātiem [14], un to var izraisīt lipīdu peroksīdu attīrīšana, pārejot no fenola savienojuma uz brīvos radikāļus saturošo lipīdu peroksīdu. No otras puses, ilgtermiņā šī ietekme bija zema. Kadmija izraisīto ASAT aktivitātes pieaugumu drīzāk paātrināja GSE ievadīšana. Tomēr ilgākā laika posmā bija vērojama neliela ASAT aktivitātes samazināšanās. Tādējādi GSE var daļēji kompensēt Cd toksisko ietekmi uz šūnu membrānām.
2.2.5. SOD un CAT aktivitāšu noteikšana aknās
Papildus tiešai dalībai oksidatīvās reakcijās kadmijs inhibē antioksidantu enzīmu, piemēram, SOD un CAT, aktivitāti, enzīmus, kas spēj detoksicēt superoksīda radikāļus un attiecīgi ūdeņraža peroksīdu [14]. SOD ir enzīms, kas efektīvi dzēš superoksīda radikāli un pārvērš to mazāk toksiskā ūdeņraža peroksīdā, ko tālāk var sadalīt katalāze vai peroksidāze [26]. CAT ir enzīms, kas atrodams gandrīz visos dzīvajos organismos, kas ir pakļauti skābekļa iedarbībai. Tas darbojas kā katalizators ūdeņraža peroksīda sadalīšanai ūdenī un skābeklī [27]. Tam ir viens no augstākajiem konversijas rādītājiem starp enzīmiem [28], un kā antioksidanta enzīms tas ir viens no aizsardzības mehānismiem, kas palīdz uzturēt līdzsvaru cilvēka organismā [29]. Cd izraisītas enzīmu aktivitātes samazināšanās mehānisms, iespējams, ir tieša Cd saistīšanās ar enzīmu aktīvajām vietām [30].
Šajā pētījumā tika novērota arī SOD un CAT aktivitāšu samazināšanās. Eksperimenta sākumā vidējā SOD enzīma aktivitāte eksperimentālo dzīvnieku aknās (5.A attēls) bija 18,4 U/mg proteīna. Pēc 14 dienām pēc eksperimenta SOD aktivitāte bija ievērojami augstāka grupā, kas saņēma GSE (21,1 U/mg), nekā abās grupās, kas saņēma kadmiju (p < 0.001="" un="" p="" {{).="" 9}},009="" attiecīgi="" tikai="" kadmija="" un="" kadmija="" grupām="" ar="" gse),="" bet="" tikai="" grupā,="" kas="" saņēma="" tikai="" kadmiju,="" sod="" aktivitāte="" bija="" ievērojami="" zemāka="" (16,7="" u/mg)="" nekā="" kontroles="" grupā="" (p="0" .005).="" pēc="" 28="" eksperimenta="" dienām="" abas="" kadmiju="" saņēmējas="" grupas="" būtiski="" atšķīrās="" no="" abām="" kontroles="" grupām="" (16,4="" u/mg,="" p="0,002" un="" 17,6="" u/mg,="" p="0,023" kadmijam).="" tikai="" un="" attiecīgi="" kadmijs="" ar="" gse)="" un="" grupa,="" kas="" ārstēta="" tikai="" ar="" gse="" (attiecīgi="" p="">< 0,001="" un="" p="0,005" tikai="" kadmijam="" un="" kadmijam="" ar="">
Eksperimenta sākumā vidējā CAT enzīma aktivitāte aknās (5.B attēls) bija 32,7 U/mg proteīna. Pēc 14 dienām pēc eksperimenta CAT aktivitāte bija ievērojami augstāka grupā, kas saņēma GSE (33,5 V/mg) nekā abās grupās, kas saņēma kadmiju (p=0,002 un p=0,031). attiecīgi tikai kadmiju un kadmiju ar GSE grupām), bet tikai grupā, kas saņēma tikai kadmiju, CAT aktivitāte bija ievērojami zemāka (23,8 U/mg) nekā kontroles grupā (p=0,005). Tomēr pēc 28 dienām CAT aktivitāte grupā, kas saņēma GSE kopā ar kadmiju, turpināja samazināties līdz 27,1 U/mg, sasniedza tikai kadmiju saturošas grupas vērtības (25,8 U/mg) un būtiski atšķīrās no kontroles grupas (p { {21}}.033). Grupa, kas tika ārstēta ar GSE, būtiski atšķīrās no abām kadmija grupām (attiecīgi p=0.026 un p=0.012 tikai kadmijam un kadmijam ar GSE). Interesanti, ka kadmija izraisīto samazinājumu palēnināja GSE vienlaicīga lietošana. Attiecībā uz CAT šīs GSE sekas ir novērotas iepriekš [14]. GSE esošo fenola savienojumu helātu veidojošais efekts, iespējams, samazina kadmija spēju saistīties ar fermenta aktīvo vietu.
2.2.6. MT satura noteikšana
Kadmijs nav pakļauts nekādiem tiešiem vielmaiņas pārveidojumiem, bet visos audos tas galvenokārt saistās ar metalotioneīnu (MT). MT pieder intracelulāru, zemas molekulmasas, cisteīnu bagātu proteīnu grupai ar molekulmasu 6–10 kDa. MT primārā loma organismā ietver cinka homeostāzes uzturēšanu, smago metālu detoksikāciju un aizsardzību pret oksidatīvo stresu. MT ekspresiju inducē daudzi eksogēni un endogēni faktori, piemēram, UV starojums, smagie metāli, stresa hormoni, brīvie skābekļa radikāļi, iekaisuma, infekcijas, traumas un onkoģenēzes mediatori [31,32]. MT lielā mērā tiek sintezēts aknās unnieresun izdalās asinīs. Lai gan MT ir atbildīgs par kadmija uzkrāšanos audos, samazinot tā izdalīšanos, MT aizsargā pret akūtu, kā arī hronisku Cd izraisītu toksicitāti [33]. Mūsu pētījumā MT saturs tika kontrolēts asinīs, aknās unnieres.
Vidējā MT satura vērtība eksperimenta dzīvnieku asinīs (6.A attēls) eksperimenta sākumā bija 23,9 nmol/g. Pēc 14 dienām izmaiņas bija minimālas, un pēc 28 dienām tika novērotas lielas atšķirības starp atkārtojumiem, izraisot statistisko nepārliecību (p=0,948). Vidējā MT satura vērtībanieres(6.B attēls) eksperimenta dzīvniekiem eksperimenta sākumā bija 21,46 nmol/g. Eksperimenta laikā vērtības būtiski nemainījās nevienā eksperimentālajā grupā (p=0.938). Vidējā MT satura vērtība izmēģinājuma dzīvnieku aknās (6.C attēls) eksperimenta sākumā bija 17,15 nmol/g. Pēc 14 dienām MT saturs nedaudz palielinājās visās eksperimentālajās grupās, un atšķirības no kontroles grupas bija nozīmīgas tikai Cd grupā un tikai GSE grupā (p=0,008 un p=0 .046). Pēc 28 dienām MT saturs GSE grupā atgriezās pie kontroles grupas vērtības, savukārt MT saturs Cd grupā saglabājās paaugstināts un atšķīrās gan no kontroles, gan no GSE grupas (p=0.046 un p=0.035). Grupā, kas saņēma GSE kopā ar kadmiju, MT saturs būtiski neatšķīrās no kontroles, kas atbilda zemākajam kadmija saturam, kas konstatēts šīs grupas aknās, salīdzinot ar grupu, kas satur tikai Cd (atšķirība bija nozīmīga pēc 28 eksperimenta dienas).
Kopumā statistiski nozīmīgas Cd izraisītās MT satura izmaiņas tika novērotas tikai aknās. Iepriekš tika ziņots par MT palielināšanos eksperimentālo dzīvnieku asinīs, kuri saņēma kadmiju [34]. Šajā gadījumā rezultāti liecina, ka Cd detoksikācija, izmantojot MT, drīzāk var notikt aknās.
3. Materiāli un metodes
3.1. Eksperimenta dizainsBrūnās Wistar ģints žurkas (astoņas nedēļas vecas, 235 ± 3 g) tika sadalītas četrās grupās pa sešiem indivīdiem: A) žurku kontroles grupa, kas ievēro parasto diētu (n=6); B) žurku grupa, kuru barībai tika pievienots GSE (200 mg GSE/dienā) (n=6); C) grupa, kas saņēma kadmiju (2 mg Cd/dienā — konkrēti, CdCl2 izšķīdināts ūdenī) (n=6); un D) grupai, kas saņēma diētu, kas satur kadmiju (2 mg Cd/dienā), kam tika pievienots GSE (200 mg GSE/dienā) (n=6). Ekstrakts tika ņemts no Cerason vīnogu šķirnes sēklām; tā sagatavošana un raksturojums ir aprakstīts 3.2. sadaļā. (Vīnogu sēklu ekstrakts). Ekstrakts tika nosvērts katru dienu ar 200 mg devu, pirms tika ievadīts eksperimentālajām brūnajām žurkām (200 mg GSE katrai žurkai; 0, 85 g / l kg ķermeņa masas). GSE tika ievadīts ar ūdeni. Žurkām ad libitum tika doti mitri barības maisījumi un nekaitīgs (zīdaiņu) ūdens. Reizi nedēļā dzīvniekiem mainīja pakaišus. Pēc 14 un 28 eksperimentālām dienām trīs dzīvnieki no katras grupas tika eitanizēti, un viņu asinis tika savāktas ar sirds punkciju. Pirms savākšanas intraperitoneālās zāles tika ievadītas ar fraksiparīnu (0, 01 ml / kg), un pēc tam dzīvniekiem inhalācijas anestēzijā tika ievadīts dietilēteris. Pēc tam asins paraugs tika savākts ar heparīnu pārklātās mikromēģenēs (vai mēģenēs ar EDTA — MT un kadmija analīzēm; bez turpmākas centrifugēšanas), un tam sekoja maiga centrifugēšana (800 g/10 min) un asiņu savākšana. plazma turpmākai analīzei. Aknas un pa labinierestika iegūti turpmākai analīzei. Pētījums tika veikts saskaņā ar Helsinku deklarāciju, un protokolu apstiprināja Brno Mendeļa universitātes Eksperimentālo dzīvnieku labturības nodrošināšanas ekspertu komisija (projektam IGA-ZF/2016-AP011).
3.2. Vīnogu sēklu ekstrakts
Vīnogu sēklas (Cerason šķirne — Merlot × Seibel 13 666) tika šķirotas, notīrītas, žāvētas un samaltas. Šķirošana notika, izmantojot atspaidas atdalīšanas mašīnā, kur sēklas tika atdalītas no mizām. Šādā veidā atdalītās sēklas pēc tam tika izskalotas, tukšās sēklas izņemtas un pārējās sēklas notīrītas. Iztīrītās un mazgātās sēklas žāvēja žāvētājā 50 ◦C 12 stundas. Tam sekoja sēklu malšana, izmantojot laboratorijas dzirnaviņas IKA MF 10 Basic (IKA Werke, Staufen im Breisgau, Vācija). Maltās sēklas tika ekstrahētas 75% etanolā 120 stundas (22 ◦C, krata pie 50 RPM; IKA KS 260 Basic, ražotājs: IKA Werke, Staufen im Breisgau, Vācija) proporcijā viena daļa malto sēklu pret desmit daļām. etanola (m/m). Pēc tam ekstraktu ievietoja 25 ml mēģenēs (Eppendorfa, Hamburga, Vācija) un centrifugēja (Hettich MIKRO 220 centrifūga; Hettich, Vestfāle, Vācija) 4 ◦C un RCF 25, 000 × g. No mēģenes paņēma centrifugētu paraugu un pārnesa uz vakuuma iztvaicētāja destilācijas kolbu (IKA RV 10 digital VC; IKA Werke, Staufen im Breisgau, Vācija), kur etanols iztvaikojās. Iztvaicēšana notika vakuumā 90 ◦C, un ekstrakts tika pārnests uz Petri trauciņiem un liofilizēts vakuumā 53°C temperatūrā (liofilizators Heto PowerDry PL 3000; Trigon-plus, Cestlice, Čehija). Pēc sagatavošanas ekstrakts tika ievadīts izmēģinājuma dzīvniekiem.
CISTANČE UZLABOS NIeru/NIeru INFEKCIJU
3.3. Antioksidantu aktivitātes un kopējā polifenolu satura noteikšana
Lai nodrošinātu rezultātu objektivitāti, antioksidanta aktivitātes noteikšanai tika izmantotas četras principiāli atšķirīgas metodes. Paraugi tika analizēti ar BS-400 automātisko spektrofotometru (Mindray, Shenzen, Ķīna). Visi paraugi tika analizēti trīs eksemplāros, un iegūtā vērtība atbilst šo mērījumu vidējam rādītājam. Šīs analīzes tika veiktas pēc Sochor et al. [35].
3.3.1. Antioksidantu aktivitātes noteikšana, izmantojot ABTS metodi
Šķīdums antioksidanta aktivitātes noteikšanai ar ABTS testu tika sagatavots, sajaucot divus šķīdumus — 1. šķīdums: 7 mM ABTS šķīdums, kas sagatavots, nosverot m=9,60 mg uz 5 ml destilēta ūdens; un 2. šķīdums: 4,95 mM kālija persulfāta šķīdums, kas sagatavots, nosverot m=1,67 mg uz 5 ml destilēta ūdens. Iegūto šķīdumu atšķaida ar destilētu ūdeni attiecībā 1:10 un atstāja tumsā un aukstumā 12 stundas. Pēc tam 150 µL reaģenta R1 (7 mM ABTS un 4,95 mM kālija persulfāta) pipeti ievietoja plastmasas kivetēs, pēc tam pievienoja 3 µL parauga un mēra spektrofotometrā (λ=660 nm) 12. min. Saskaņā ar kalibrēšanas līkni absorbcija tika pārvērsta līdzvērtīgā gallskābes saturā; antioksidanta aktivitāte tika aprēķināta no kalibrēšanas līknes, izmantojot gallskābi kā standartu (10–200 mg · L1), un rezultāti tika izteikti kā gallskābes ekvivalenti.
3.3.2. Antioksidantu aktivitātes noteikšana, izmantojot DPPH metodi
Vispirms tika nosvērts m {0}},35 mg radikālas DPPH. Šo daudzumu pārnesa uz 250 ml mērkolbu un papildināja ar metanolu. Pēc tam 150 µL reaģenta R1 (0,095 mM DPPH) tika pipeti ievietoti plastmasas kivetēs, kam sekoja 15 µL izmērāmā parauga. DPPH tests ir balstīts uz stabilā brīvā radikāļa 2,2-difenil-1-pikrilhidrazila spēju reaģēt ar ūdeņraža donoriem. DPPH uzrāda spēcīgu absorbciju ultravioletās redzamās spektroskopijas (UV-VIS) spektrā. Absorbcija tika mērīta 12 minūtes pie λ=505 nm. Saskaņā ar kalibrēšanas līkni absorbcija tika pārveidota par līdzvērtīgu gallskābes saturu.
3.3.3. Antioksidantu aktivitātes noteikšana, izmantojot dzelzs reducējošo antioksidantu jaudas metodi
Tika izmantoti trīs šķīdumi, lai noteiktu antioksidanta aktivitāti, izmantojot dzelzs reducējošo antioksidantu jaudas (FRAP) metodi — (1) TPTZ šķīdums: 10 mM TPTZ (m=78,02 mg), kas izšķīdināts 25 ml 40 mM HCl; (2) FeCl3 šķīdums: 20 mM FeCl3 (m=135,13 mg) izšķīdināts 25 ml destilēta ūdens; un (3) acetāta buferšķīdums: 0,02 M acetāta buferšķīdums, pH 3,6 (m=775 mg nātrija acetāta izšķīdināts 250 ml destilēta ūdens, pH noregulēts ar etiķskābi). Trīs šķīdumi tika sajaukti attiecībā 1:1:10 (TPTZ: FeCl3: acetāta buferis). Pēc tam 150 µL reaģenta tika pipeti plastmasas kivetēs un pievienoja 3 µL parauga. Absorbcija tika mērīta 12 minūtes pie λ=605 nm. Antioksidantu aktivitāte tika aprēķināta no kalibrēšanas līknes, izmantojot gallusskābi kā standartu (10–200 mg·L1). Rezultāti tika izteikti kā gallskābes ekvivalents.
3.3.4. Antioksidantu aktivitātes noteikšana, izmantojot hlorofilīna brīvo radikāļu metodi
Kopā 200 µL reaģenta R1 (0,1 M HCl, hlorofila ekstrakts, reakcijas buferis, katalizators) tika pipeti ievietoti plastmasas kivetēs un pēc tam pievienoti 8 µL parauga. Šī metode izmanto hlorofilīna (hlorofila nātrija-vara sāls) spēju pieņemt un ziedot elektronus, vienlaikus stabili mainot absorbcijas maksimumu. Šo procesu nosaka sārmaina vide un katalizatora pievienošana. Absorbcija tika mērīta 12 minūtes pie λ=450 nm. Aprēķiniem tika izmantotas pēdējās mērījumu vērtības. Rezultāti tika izteikti kā gallskābes ekvivalents.
3.3.5. Kopējās polifenola koncentrācijas noteikšana
Kopējo polifenolu savienojumu noteikšanai tika izmantota Folina-Čokaltē metode. Visi paraugi tika analizēti trīs eksemplāros, un iegūtā vērtība tika iegūta kā šo mērījumu vidējā vērtība. 40 µL paraugs tika pipetēts kivetē (3 ml) un atšķaidīts ar 1960 µL destilēta ūdens. Pēc tam kivetei pievienoja 50 µL Folin-Ciocalteu reaģenta. Maisījumu rūpīgi sakrata un pēc 3 minūtēm pievienoja 300 µL 20 procentu Na2CO3 dekahidrāta šķīduma. Reakcijas maisījumu sakrata un inkubēja 22 °C temperatūrā 120 minūtes. Pēc šī laika absorbcija (SPECORD 210; Carl-Zeiss, Jena, Vācija) tika mērīta pie λ=750 nm pret tukšo paraugu. Rezultāti tika izteikti kā gallskābes ekvivalents.
3.4. Antioksidantu noteikšana ar HPLC
Atsevišķu antioksidantu komponentu noteikšana, izmantojot augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfiju ar masas spektrometru. Flavonoīdu un proantocianīnu novērtēšanai izmantoto paraugu analīzes tika veiktas Agilent Technologies 12{{10}0 (Jet Stream Technologies, Santa Clara, CA, ASV) hromatogrāfijas sistēmā, kas sastāv no šādas ierīces: mobilās fāzes rezervuāri, degazētājs, binārais sūknis, paraugu rezervuārs ar automātisko paraugu ņemšanas ierīci un masas detektors ar Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS (Jet Stream Technologies, Santa Clara, CA, ASV). Paraugu atdalīšana tika veikta Zorbax SB C18 hromatogrāfijas kolonnās ar izmēriem 50 × 2,1 mm un daļiņu izmēru 2,7 µm. Analīzes periods vienmēr bija 6 minūtes. Nesējgāzes kopējais ātrums bija 0,6 ml·min1. Mobilās fāzes organiskā sastāvdaļa bija metanola gradienta pakāpe (šķīdinātājs B), un ūdens sastāvdaļa saturēja 0,05 M amonija formiāta (šķīdinātājs A). Kustīgās fāzes gradients bija šāds: laiks 0 min: 50 procenti šķīdinātāja A un 50 procenti šķīdinātāja B; laiks 2,5 min: 100 procenti šķīdinātāja A un 0 procenti šķīdinātāja B; laiks 5 min: 50 procenti šķīdinātāja A un 50 procenti šķīdinātāja B. Kolonnas termostata temperatūra tika noregulēta uz 45 ◦C.
CISTANČE UZLABOS NIERU/NIERES SĀPES
3.5. Izvēlēto bioķīmisko marķieru noteikšana
Bioķīmiskie marķieri asinīs, plazmā, aknās unnieresno dzīvniekiem tika uzraudzīti, lai noteiktu GSE aizsargājošo iedarbību pret kadmija negatīvo ietekmi. Tika veiktas šādas analīzes: (1) Plazmas analīzes: kopējā plazmas antioksidantu aktivitāte, kreatinīns, urīnviela, ALAT, ASAT. (2) Asins analīzes: MT. (3) Aknu analīzes: SOD, CAT, MT. (4)Nieresanalīzes: MT.
3.5.1. Kopējās plazmas antioksidantu aktivitātes noteikšana,Kreatinīna, urīnvielas, ALT un AST A BS{{0}} automātiskais bioķīmiskais analizators (Mindray, Shenzen, Ķīna) tika izmantots, lai analizētu kopējo plazmas, kreatinīna, urīnvielas, ALT un AST antioksidantu aktivitāti. Plazmas kopējās antioksidanta aktivitātes noteikšana Lai noteiktu plazmas antioksidantu aktivitāti, tika izmantota brīvo radikāļu metode [35]. Šī metode izmanto hlorofilīna (hlorofila nātrija-vara sāls) spēju pieņemt un ziedot elektronus, vienlaikus stabili mainot absorbcijas maksimumu. Šo procesu nosaka sārmaina vide un katalizatora pievienošana. Kopā 200 µL reaģenta R1 (0,1 M HCl, hlorofilīna ekstrakts, reakcijas buferis un katalizators) tika pipetēti plastmasas kivetēs, pēc tam pievienojot 8 µL parauga. Absorbcija tika mērīta 12 minūtes pie λ=450 nm, un aprēķinam tika izmantota pēdējā mērījuma vērtība. Antioksidantu aktivitāte tika aprēķināta no kalibrēšanas līknes, izmantojot gallskābi kā standartu, un rezultāti tika izteikti kā gallskābes ekvivalents.
Kreatinīna satura noteikšanaMetodes princips ir kreatinīna krāsu kompleksa fotometriskā noteikšana ar sārmainu pikrātu, kura veidošanās ātrums ir proporcionāls kreatinīna koncentrācijai paraugā. Kreatinīna noteikšanai tika izmantots diagnostikas komplekts no Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, Vācija). Kopā ar pipeti kivetē tika ievadīti 180 µL reaģenta R1 (0,16 mM nātrija hidroksīda), kam sekoja 10 µL parauga un 30 µL reaģenta R2 (4 mM pikrīnskābes). Absorbcija tika mērīta sešas minūtes pie λ=505 nm. Aprēķiniem tika izmantota tikai reaģenta R1 absorbcijas vērtība ar paraugu un absorbcijas vērtība pēc 6 minūšu inkubācijas ar reaģentu R2.
Alanīna aminotransferāzes noteikšanaLai noteiktu ALT, tika izmantots Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheima, Vācija) diagnostikas komplekts. Pirmkārt, 150 µL reaģenta R1 (100 mM Tris buferšķīduma pH 7,5; 500 mM L-alanīna, 1200 U/L laktāta dehidrogenāzes) un 15 µL plazmas parauga tika automātiski pipeti kivetēs. Pēc tam 30 µL reaģenta R2 (15 mM 2-oksoglutarāts, 0,18 mM NADH) tika automātiski pipeti un maisījumu inkubēja 5 minūtes. Absorbcija tika mērīta pie λ=340 nm. Aprēķiniem tika izmantotas tikai reaģenta R1 absorbcijas vērtības ar paraugu un absorbcijas vērtības pēc 5 minūšu inkubācijas ar paraugu. Rezultāts tika pārveidots saskaņā ar kalibrēšanas līkni enzīma aktivitātē µkat/L.
Aspartāta aminotransferāzes noteikšanaAST noteikšanai tika izmantots diagnostikas komplekts no Greiner (Greiner GmbH, Pleidelsheim, Vācija). Pirmkārt, 150 µL reaģenta R1 (80 mM Tris buferšķīduma pH 7,8, 240 mM L-aspartāta, 1200 U/L malāta dehidrogenāzes) un 15 µL eksperimentālo dzīvnieku plazmas parauga tika automātiski pipeti kivetēs. Pēc tam sajaukšana un inkubācija tika veikta 37 ◦ C temperatūrā 270 sekundes. Pēc tam 30 µL R2 reaģenta (15 mM 2-oksoglutarāts, 0,18 mM NADH) tika automātiski pipeti un maisījumu inkubēja 5 minūtes. Absorbcija tika mērīta pie λ=340 nm. Aprēķiniem tika izmantotas tikai reaģenta R1 absorbcijas vērtības ar paraugu un absorbcijas vērtības pēc 5 minūšu inkubācijas ar paraugu. Rezultāts tika pārveidots saskaņā ar kalibrēšanas līkni enzīma aktivitātē µkat/L.
Urīnvielas noteikšanaLai noteiktu urīnvielu, tika izmantota šāda procedūra: 200 µL reaģenta R1 (Tris buferis pH 7,8, ADP, ureāze un GLDH) un 200 µL reaģenta R2 (2-oksoglutarāts, NADH) tika automātiski pipeti iepildīti kivetēs. kam sekoja paraugs ar tilpumu 4 µL, pēc tam maisījums tika sajaukts un inkubēts 37 ◦ C temperatūrā 30 sekundes. Pēc tam tika mērīta absorbcija pie λ=340 nm, un pēc vēl 60 sekundēm absorbcija tika mērīta vēlreiz. Aprēķiniem tika izmantotas absorbcijas vērtības pēc 30 sekundēm un vēl pēc 60 sekundēm. Vērtības tika atņemtas viena no otras, un rezultāts tika pārveidots saskaņā ar kalibrēšanas līkni urīnvielas saturā.
Kopējo proteīnu noteikšana ar biureta metodiKopējo proteīnu noteikšana ar Biuret metodi ir detalizēti aprakstīta citā publikācijā [9]. Kopā ar pipeti kivetē tika ievadīti 180 µL Biuret reaģenta (15 mM nātrija kālija tartrāts, 100 mM NaI, 5 mM KI un 5 mM CuSO4), kam sekoja 45 µL parauga. Pēc desmit minūšu ilgas inkubācijas 37 ◦C temperatūrā tika izmērīta absorbcija pie viļņa garuma λ=546 nm. Princips šeit ir peptīdu saites reakcija ar Cu (II) sārmainā vidē, veidojot zili violetu krāsu. Aprēķiniem tika izmantota tikai reaģenta absorbcijas vērtība un absorbcijas vērtība pēc desmit minūšu inkubācijas ar paraugu.
3.5.2. Superoksīda dismutāzes (SOD) un katalāzes (CAT) noteikšana SOD aktivitātes noteikšana, SOD aktivitātes noteikšanai tika izmantots komerciāls komplekts (19160 SOD, Merck KGaA, Darmštate, Vācija) (SOD, EC 1.15.1.1). Mērījums tika veikts plastmasas kivetē ar automātisko analizatoru BS 400 (Mindray, Shenzen, Ķīna). Pirmkārt, 200 µL reaģenta R1 (20x buferšķīdums atšķaidīts WST šķīdums) tika ievadīts kivetē un reaģents tika inkubēts 37 ◦ C temperatūrā 108 sekundes (1 min, 48 s). Pēc tam ar pipeti tika ievadīti 20 µL parauga un pēc 378 s (6 min, 18 s) reakcija tika sākta, pievienojot 20 µL reaģenta R2 (167 x buferšķīduma atšķaidīts enzīma šķīdums). Maisījumu inkubēja 72 s (1 min, 12 s), un pēc tam tika mērīta absorbcija pie λ=450 nm. Reakcijas kinētika tika mērīta 180 s (3 minūtes), un absorbcija tika nolasīta ik pēc deviņām sekundēm. Instruments aprēķināja vidējo absorbcijas pieaugumu minūtē (∆A) un izmērīto paraugu SOD aktivitāti saskaņā ar kalibrēšanas vienādojumu. Rezultāti tika izteikti U / ml un pēc tam pārveidoti par mg proteīna.
3.5.3. Metallotioneīna satura noteikšanaMetallotioneīna koncentrācijas noteikšana asinīs, aknās unnieresno brūnajām žurkām tika veikta, izmantojot adsorbcijas pārneses noņemšanas metodi (AdTS) ar diferenciālo impulsa voltammetriju (DPV). Analīzei tika ņemti 200 µL analizētā supernatanta un sajaukti ar 1 800 µL Brdiˇcka reaģenta mērtraukā, pēc tam tika veikta pati elektroķīmiskā noteikšana. Pārbaude tika veikta saskaņā ar iepriekš aprakstīto protokolu [37]. Tika izmantots klasisks trīs elektrodu savienojums. Darba elektrods bija piekārts dzīvsudraba elektrods (HMDE) ar kritiena laukumu 0,4 mm2, savukārt atsauces elektrods bija Ag/AgCl/3 M KCl un palīgelektrods bija platīna elektrods. Bāzes elektrolīts (1 mmol·L1 [CO(NH3)6] Cl3 un 1 mol·L1 amonija buferšķīduma; NH3(aq) plus NH4Cl, pH 9,6) tika mainīts katram izmērītajam paraugam. DPV parametri bija šādi: sākotnējais potenciāls 0,7 V, gala potenciāls 1,75 V, burbuļošana 5 s, nogulsnēšanās laiks 240 s, modulācijas laiks 0.0 5 s, intervāla laiks 0,25 s, potenciālais solis 0,00105 V, skenēšanas ātrums 0,0042 V/s un modulācijas amplitūda 0,02505 V. MT noteikšana tika veikta ar mērierīci, kas sastāv no 695 Autosampler, kas savienots ar VA Stand 693 mērvienību un kontrolētu mērierīci. ar 693 VA TraceAnalyser vadības bloku (visi Metrohm, Herisau, Šveice). Visa mērīšanas sistēma tika atdzesēta līdz 4 ◦C, izmantojot Julabo F25 (Julabo, Seelbach, Vācija). Iegūtās voltammogrammas tika eksportētas uz VA Database 2.2 programmu (Metrohm, Herisau, Šveice), un analizētie paraugi tika dezoksigenēti, aktīvi burbuļojot argonu ar tīrību 99,999 procenti.
3.5.4. Kadmija satura noteikšana paraugu sadalīšanās asinīs, aknās un nierēs Ethos One mikroviļņu ekstraktors (Milestone, Sorisole, Itālija) tika izmantots aknu un aknu sadalīšanai.nieresparaugus, un asins paraugu sadalīšanai tika izmantots Multiwave 3{6}}00 Microwave Extractor (Anton Paar Graz, Austrija). Mineralizācija notika mitrā veidā, izmantojot 65 procentus slāpekļskābes (HNO3 supra tīrs) (Merck KGaA, Darmštate, Vācija) un 30 procentus ūdeņraža peroksīda (H2O2 supra tīrs) (Merck KGaA, Darmštate, Vācija) Kopā 0,4 g aknas vainieresparaugs tika nosvērts vairākos teflona traukos un paraugam tika pievienoti 5 ml 65 procentu HNO3, 3 ml 30 procentu H2O2 un 2 ml Milli Q H2O. Tvertnes tika aizvērtas un instruments iedarbināts saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Mikroviļņu sadalīšanās ilga 40 minūtes 210 ◦C temperatūrā. Pēc tam paraugus atdzesēja 45 minūtes un uzglabāja 4 ◦ C temperatūrā PE traukos. Kopā 0,01 g asins parauga tika nosvērts vairākos stikla traukos, un paraugam pievienoja 300 µL 65 procentu HNO3 un 200 µL 30 procentu H2O2. Tvertnes tika aizvērtas un instruments iedarbināts saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Mikroviļņu sadalīšanās ilga 40 minūtes 140 ◦C temperatūrā. Pēc tam paraugus atdzesēja 45 minūtes un uzglabāja 4 ◦C temperatūrā līdz noteikšanai ar AAS.
Kadmija noteikšana ar atomu absorbcijas spektrometrijuKadmijs tika noteikts ar Agilent 280/240 Series AA Systems ierīci (Agilent Technologies). Aknas unnieresparaugi tika analizēti acetilēna-gaisa liesmā (Fa AAS), bet asins paraugi ar elektrotermisko izsmidzināšanu (ETA AAS) pie viļņa garuma 228, 8 nm. No kadmija standarta šķīduma (Analytika Praha, Analytika Praha, Prāga, Čehija), ar koncentrāciju 1.000 ± 0,002 g·L1. Tam sekoja kalibrēšanas sērijas šķīdumu mērīšana un kalibrēšanas līkņu izveidošana, pēc tam tika veikta asins, aknu unnierestika izmērīti paraugi.
3.6. Statistiskā analīzeVisi mērījumi tika veikti trīs eksemplāros. Ārējās vērtības tika identificētas ar Grubbs testu un izslēgtas (kopā tika konstatētas divas novirzes). Pirms statistiskās analīzes dati tika pārveidoti ar logaritmisko transformāciju un analizēti ar vienvirziena ANOVA (katrs laika punkts atsevišķi) ar Tukey HSD post-hoc testu. Statistiskā nozīmīguma slieksnis tika iestatīts kā p <>
4. Secinājumi
Nesen ir bijusi farmācijas un ekonomikas tendence meklēt jaunas zāles starp augu sekundārajiem metabolītiem, kas ir vielas, kas var palīdzēt aizsargāt pret dažādām slimībām. Pateicoties svarīgajām bioloģiski aktīvajām sastāvdaļām, ko vīnogu sēklas satur savā matricā, tās var (un jau tiek) izmantotas medicīniskiem nolūkiem. Ir zināms, ka vīnogu sēklu ekstrakti aizsargā audus pret oksidatīvā stresa izraisītiem bojājumiem, ko izraisa toksiskais smagais metāls kadmijs. Šo aizsardzību, iespējams, ietekmē izmantoto vīnogu sēklu fenola sastāvs. Šajā pētījumā tika pārbaudīts vīnogu sēklu ekstrakts, kas sagatavots no daļēji izturīgas šķirnes Cerason ar diezgan augstu fenola saturu, lai aizsargātu pret kadmija izraisītām izmaiņām. Pētītais GSE spēja palielināt plazmas antioksidantu aktivitāti, ja to lieto atsevišķi, un samazināt kadmija saturu aknās unnieresžurkām, lietojot vienlaikus. Attiecīgi palielinās aknu marķiera enzīma ALT unniereskadmija izraisīto marķiera kreatinīna līmeni palēnināja GSE. Turklāt GSE vienlaicīga lietošana palēnināja kadmija izraisīto antioksidantu enzīmu SOD un CAT aktivitātes samazināšanos. Šie rezultāti liecina, ka GSE ir spēcīgs aizsarglīdzeklis pret smago metālu iedarbību.
