HLA-G plaši izpaužas tuklās šūnas orgānu fibrozes reģionos aknās, plaušās un nierēs
Feb 21, 2022
Abstract:Mēs iepriekš parādījām, ka tuklo šūnas, kas ekspresē HLA-G, ir saistītas ar C hepatīta vīrusa izraisītiem reģioniemaknasfibroze. Šeit mēs centāmies noteikt, vai HLA-G ekspresija tuklo šūnās ir specifiska vīrusu etioloģijai,aknas, vai vispārējam fibrozes procesam. Mēs uzskaitījām HLA-G plus šūnas un tuklo šūnas, izmantojot imūnhistoķīmiju (i)aknasbloķē 41 alkohola cirozes gadījumu, (ii) 10 idiopātiskas plaušu fibrozes (IPF) gadījumus un (iii) 10 gadījumus. rēnalfibroze. HLA-G plus šūnu raksturs tika precizēts ar multipleksu imunofluorescenci, izmantojot programmatūru. Vairāk nekā puse no visām HLA-G plus šūnām bija tuklo šūnas alkoholiskās cirozes un IPF fifibrotiskajos apgabalos. Iekšnieres,pakļautas fifibrozei, HLA-G plus šūnas patiešām bija tuklo šūnas, taču tās nevarēja saskaitīt. Turklāt atsevišķos gadījumosaknasun plaušu, mēs novērojām vairākus šūnu mezglus, kas bija sekundāri vai terciāri folikuli, kuros HLA-G ļoti ekspresēja B limfocīti. Visbeidzot, HLA-G plus tuklo šūnas varēja novērot visu pētīto orgānu fifibrotiskajos reģionos. Iepriekšējie pētījumi liecina par HLA-G plus tuklo šūnu aizsargājošu lomu pret iekaisumu un fibrozi. Novērotie folikuli ar B limfocītiem, kas ekspresē HLA-G, var arī pastiprināt to antifibrotisko lomu.
Atslēgvārdi:fibroze; HLA-G; tuklo šūnas; folikulas; B limfocīti; antifibrotisks līdzeklis; Nieres; Aknas
IevadsHroniskas slimības, kas izraisa orgānu fibrozi, ir saistītas ar ievērojamu mirstību un saslimstību, kas veido līdz 45 procentiem nāves gadījumu attīstītajās valstīs [1]. Fifibrotisko slimību izplatība nepārtraukti pieaug, un tā ir svarīga sabiedrības veselības problēma. Fibrotiskas slimības var ietekmēt visus orgānus, piemēram,aknas, nieres, plaušas un sirds. Patoloģisku fibrozi raksturo pārmērīga ekstracelulārās matricas (ECM) komponentu, piemēram, kolagēna, nogulsnēšanās. Šāda ECM uzkrāšanās iznīcina normālu orgāna arhitektūru un izraisa orgānu disfunkciju un mazspēju, mainot katra orgāna specializētās funkcijas, ti,aknas, detoksikācijas funkcija, plaušām, gāzu apmaiņas funkcija unnieres,fifiltrācijas funkcija. Turklāt fibroze var veicināt vēža attīstību. Transplantācija, lai aizstātu fifibrotisku orgānu, bieži vien ir labākā terapeitiskā iespēja. Fifibrozes process notiek, reaģējot uz traumu vai audu bojājumiem pēc ilgstošas vai pārāk spēcīgas iekaisuma reakcijas. Fibroze, kas sākotnēji ir atgriezeniska, var pāriet uz neatgriezenisku stāvokli [2]. Theaknasvar tikt ievainoti vīrusi (B, C, D, E hepatīts), sēnīšu toksīni, parazīti, autoantivielas, diēta ar augstu tauku saturu un pārmērīga alkohola lietošana, kas ir bieža slimības etioloģija.aknasfifibroze [3] un pat dominējošais cēlonis dažās valstīs. Kad apvainojumi tiek atkārtoti,aknasattīstās hronisks hepatīts ar fifibrozi, kam seko progresējoša fibroze vai ciroze, kas ir nosliece uz hepatocelulāro karcinomu (HCC).
Plaušās idiopātiskā plaušu fibroze (IPF) ir visizplatītākā slimību grupa, kas ietver paaugstinātas jutības fibrozi un reimatoīdo plaušu. Šī hroniskā progresējošā fibrozējošā intersticiālā plaušu slimība ar nezināmu izcelsmi ir reta un skar trīs miljonus cilvēku visā pasaulē. Tomēr IPF ir saistīts ar agrīnu nāvi. Patiešām, IPF izraisa progresējošu elpošanas mazspēju un ir arī neatkarīgs plaušu vēža riska faktors [4]. Plaušu transplantācija jāapsver kā iespēja jauniem pacientiem ar progresējošu slimību.
NieruFifibroze ir daudzu progresējošu slimību pēdējais kopīgais ceļšnieru slimības.Saslimstība ar hroniskunieru slimība, kas noved pie beigu stadijasnieru slimība, ir ievērojami palielinājies, skarot 10 procentus pasaules iedzīvotāju ar augstu mirstību [5]. Turklāt pacientiem ar hroniskunieru slimībair paaugstināts attīstības risksnieresvēzis (līdz 10 reizēm salīdzinājumā ar vispārējo populāciju), ar biežiem divpusējiem un/vai multifokāliem bojājumiem [6].
Neatkarīgi no orgāna, kurā attīstās fibroze, ir svarīgi izprast tās rašanās mehānismus, lai izstrādātu terapiju tās novēršanai. Jo īpaši hronisks iekaisums noved pieaknasvainierufifibroze, un tās kontrole var ļaut ierobežot tās progresēšanu un orgānu mazspējas vai vēža rašanos. Citokīniem un kemokīniem ir galvenā loma gan imūnās atbildes orientācijā, gan iekaisuma uzturēšanā [7,8]. Papildus šīm imūnmolekulām ir pētītas arī citas olbaltumvielas, piemēram, HLA-G, Ib klases HLA molekula, kas labi pazīstama ar savām imūnmodulējošajām īpašībām [9]. Mēs iepriekš parādījām, ka HLA-G ekspresē tuklās šūnas, kas ir saistītas ar C hepatīta vīrusa izraisīto zonu.aknasfibroze [10,11]. Šajā pētījumā mēs pētījām, vai HLA-G ekspresija tuklo šūnās ir specifiska vīrusu etioloģijai,aknas, vai fibrozes process neatkarīgi no orgāna. Mēs raksturojām HLA-G ekspresiju tuklās šūnās un imūnās šūnās uz parafiīna blokiem grupās, kurās bija 41 pacients ar alkohola izraisītu cirozi, 10 pacienti ar IPF un 10 pacienti ar alkohola izraisītu cirozi.nierufibroze. Precīza HLA-G ekspresējošo šūnu identifikācija tika veikta, izmantojot četrkāršu imunofluorescenci parafīna sekcijām un programmatūru, kas atsevišķi analizē fluorescenci un apvieno to trīs gadījumos.aknasalkohola izraisīta fibroze un divas IPF.
Rezultāti
Kvantitatīvā ekspresija un HLA-G plus šūnu būtība alkohola izraisītā fibrozēSākotnējais imūnhistoķīmiskais pētījums tika veikts ar virkni alkohola izraisītu fibrozes paraugu (n=41), ļaujot saskaitīt HLA-G plus un CD117 plus šūnas visos priekšmetstikliņos, izmantojot pusautomātisku uzskaiti, izmantojot HALO programmatūru. Rezultāti ir apkopoti 1. tabulā.
HLA-G plus un CD117 plus šūnas tika skaitītas pa visu 41 alkohola cirozes gadījuma sērijveida priekšmetstikliņu virsmu, izmantojot HALO programmatūru ar atbilstošu algoritmu pēc imūnhistoķīmijas ar 4H84, kas atpazīst HLA-G, un anti-CD117/c-kit. HLA-G plus un CD117 plus šūnām ir norādīta vidējā, standarta novirze un diapazons: 555 ± 699 HLA-G plus /(41–2686) un 200 ± 271 CD 117 plus šūnas (12–1113).
HLA-G plus šūnu morfoloģiskās pazīmes alkohola izraisītas cirozes topogrāfijā atbilst tuklo šūnām (1.A attēls). Dažos gadījumos tika veikta dubultā CD117 un cilvēka tuklo šūnu marķēšana, kas parādīja, ka aknu CD117 plus šūnas ir tuklo šūnas fifibrotiskajā zonā (1.A attēls). Trīs reprezentatīvi alkohola izraisītas cirozes gadījumi tika pētīti ar četrkāršu imunofluorescenci un Sirius Red krāsošanu, izmantojot HALO programmatūru, lai precīzi identificētu HLA-G plus šūnas. Vidējais fibrozes laukums atbilda 19,4 procentiem noaknasaudi. HLA-G šūnu plus identifikācija parādīja, ka 51 procents ir tuklo šūnas (2. tabula; attēls 1A, 1B1), ko nosaka cilvēka tuklo šūnu triptāzes plus CD1177 fenotips vai cilvēka tuklo šūnu triptāze un CD117 kopkrāsošana. Tuklo šūnas, kas ekspresē HLA-G, atradās fifibrotiskajos apgabalos (1.B1. attēls). Un otrādi, 49 procenti HLA-G plus šūnu nebija tuklo šūnas vai CD117 plus šūnas (3. tabula), un kopumā šķita, ka tās ir sagrupētas kā mezgli (1.B2. attēls). Tādējādi, lai identificētu šīs šūnas, dažādās zonās tika veikta cita marķēšana (4. Dažādu HLA-G plus šūnu tipu sadalījums atšķīrās atkarībā no apgabalaaknasaudi (3. un 4. tabula). Kopumā 63 procenti HLA-G plus šūnu fifibrotiskajā zonā bija tuklo šūnas, salīdzinot ar tikai 3 procentiem mezglos. Turklāt 68 procenti HLA-G plus šūnu mezglos vienlaikus ekspresēja CD20, B limfocītu marķieri (1.C1. attēls) un 3 procentus CD3 (1.C2. attēls). HLA-G plus CD117 tuklo šūnu triptāze HLA-G plus CD117 HLA-G plus CD117 tuklo šūnu triptāze plus un HLA-G plus CD117 plus tuklo šūnu triptāze plus šūnas tika saskaitītas trīs reprezentatīvos gadījumosaknasfifibroze, izmantojot HALO programmatūru ar atbilstošu algoritmu. Šūnas tika skaitītas divās dažādās alkoholiskās cirozes parauga zonās, ti, fifibrotiskajā zonā un šūnu mezglā, reprezentatīvā gadījumāaknasfifibroze, izmantojot HALO programmatūru ar atbilstošu algoritmu. Neviena HLA-G plus šūna neizpauž CD31, endotēlija šūnu marķieri vai CD1a, dendritisko šūnu marķieri.
1. attēls. HLA-G šūnu raksturs reprezentatīvā gadījumāaknasfibroze. (A) Pirmajā rindkopā divi fotoattēli kreisajā pusē parāda HLA-G un CD117 izpausmi reprezentatīvā gadījumāaknasfifibroze no 41 gadījuma, izmantojot imūnhistoķīmiju, 4H84 atpazīstot HLA-G un CD117 antivielas, kas atpazīst c-kit šūnas. Priekšmetstikliņus pretkrāsoja ar Mayer hematoksilīnu. Fibrozes posmus ieskauj sarkana līnija. Apļi apļos topogrāfiski atbilst HLA-G un CD117 krāsotiem priekšmetstikliņiem. Taisnstūris parāda spēcīgu šo apgabalu palielinājumu, kas norāda, ka abas HLA-G šūnas sakrīt ar divām CD117 šūnām. Turklāt to morfoloģija ir saderīga ar tuklo šūnu. Fotoattēls dubultā fluorescencē (CD117/Tuklo šūnu triptāze) ar trim fotoattēliem labajā pusē, kas atbilst vienkāršajai fluorescencei (DAPI krāso kodolus zilā krāsā, CD117 zaļā krāsā, tuklo šūnu triptāze sarkanā krāsā) parāda lielāko daļu šūnu, kas ir kopīgi marķētas. dzeltenā krāsā. CD117 šūnas lielākoties ir tuklo šūnas. (B) Četrkārša imunofluorescence reprezentatīvā gadījumāaknasfifibroze (no trim), izmantojot DAPI ar ziliem kodoliem, HLA-G (ar 4H84 antivielu) ar zaļu pseidokrāsu, CD117 ciāna pseido krāsā, tuklo šūnu triptāzi sarkanā pseido krāsā un salikto attēlu vai sapludināšanu. Labajā pusē ir attēlots Sirius Red krāsojums. 1 un 2 atbilst diviem dažādiem apgabaliemaknas,attiecīgi fibrozes span un šūnu mezgls. Fifibrozes gadījumā lielākā daļa HLA-G šūnu ekspresē CD117 un tuklo šūnu triptāzi (1). Turpretim lielākā daļa HLA-G šūnu nav koekspresē tuklo šūnas, izņemot noteiktas HLA-G šūnas šūnu mezgla perifērijā (2), fifibrozes tuvumā. (C) Četrkārša imunofluorescence uz mezgla šūnāmaknasfifibroze, kas parādīta B2, ar DAPI, HLA-G ar zaļu pseido krāsu, CD20 ar fuksijas rozā vai CD3 ar ciāna pseido krāsu, attiecīgi, 1. un 2. Sirius Red krāsas atbilstība ir labajā pusē. Kvadrāts parāda ierobežotu topogrāfisku apgabalu, kurā ir HLA-G pozitīvās šūnas un atbilstošās šūnas šajā zonā. Saliktais attēls parāda HLA-G un CD20 rozā kopmarķējumu. Starp HLA-G ar zaļu pseidokrāsu un CD3 ar ciāna pseido krāsu nav novērota līdzkrāsošanās.
HLA-G plus , CD3 plus (T limfocīti), CD20 plus (B limfocīti) un tuklo šūnu triptāzes plus (tuklās šūnas) šūnu absolūtais skaits tika noteikts, izmantojot HALO programmatūru ar atbilstošu algoritmu vienā reprezentatīvajā gadījumā un tiek izteikts. uz mm2.
HLA-G plus šūnu analīze IPFPirmajā pētījumā, kas tika veikts ar virkni IPF (n=10), izmantojot imūnhistoķīmiju, kā aprakstīts iepriekš, mēs aprēķinājām, ka HLA-G plus šūnu skaits ir 135 ± 62/mm2 un CD117 plus šūnu skaits 227 ± 134/mm2 (5. tabula). HLA-G plus šūnas nesakrita ar CD117 plus šūnām plaušu fibrozes gadījumā (2.A attēls). Četrkāršās imunofluorescences un Sirius Red krāsošanas HALO analīze parādīja, ka HLA-G šūnu raksturs ir atšķirīgs atkarībā no plaušu histoloģiskā laukuma (6. tabula). Patiešām, 63 procenti HLA-G plus šūnu fifibrotiskajos apgabalos bija tuklo šūnas (B1, C1), turpretim tās veidoja tikai 7 procentus no HLA-G plus šūnām mezglos (B2, C2). Lielākā daļa HLA-G plus šūnu mezglos līdzās ekspresēja CD20 (2.B attēls).
2. attēls. HLA-G šūnu raksturs reprezentatīvā IPF gadījumā. (A) Pirmajā rindkopā fotoattēlā pa kreisi redzams Sirius Red krāsojums vienam reprezentatīvam gadījumam no desmit IPF, vidējā fotoattēlā parādīts Mayer hematoksilīna prettraips, izmantojot imūnhistoķīmiju. Apļi apļos topogrāfiski atbilst HLA-G un CD117 krāsotiem priekšmetstikliņiem ar 4H84, kas atpazīst HLA-G, un CD117 antivielas, kas atpazīst c-kit šūnas. Taisnstūri parāda spēcīgu šo apgabalu palielinājumu, norādot, ka HLA-G šūnas neatbilst CD117 šūnām. (B) Četrkārša imunofluorescence reprezentatīvā gadījumāaknasfifibroze no divām, izmantojot DAPI ar ziliem kodoliem, HLA-G (ar 4H84 antivielu) ar zaļu pseidokrāsu, CD117 ciāna pseido krāsā, tuklo šūnu triptāzi sarkanā pseido krāsā un salikto attēlu vai sapludināšanu. Labajā pusē ir attēlots Sirius Red; 1 un 2 atbilst divām dažādām plaušu zonām, attiecīgi fibrozes diapazonam un šūnu mezglam. (C) Pieckārša imunofluorescence ar DAPI, HLA-G ar zaļu pseidokrāsu, triptāze ar sarkanu pseidokrāsu, CD3 ar ciāna pseidokrāsu, CD20 ar fuksijas rozā pseidokrāsu, tajā pašā IPF gadījumā, kas parādīts (B) . (C1) atbilst (B1) apgabalam. (C1) lielākā daļa HLA-G šūnu atbilst tuklo šūnām fifibrozes apgabalā, savukārt ļoti retas tuklo šūnas ir HLA-G mezglā, kas parādīts (C2). Lielākā daļa mezgla šūnu ir CD20. HALO analīze parādīja, ka lielākā daļa HLA-G plus šūnu ir B limfocīti.
HLA-G plus un CD117 plus šūnas tika skaitītas 10 gadījumos, izmantojot HALO programmatūru ar atbilstošu algoritmu, pēc imūnhistoķīmijas. Ir norādīta vidējā vērtība, standarta novirze un diapazons.
HLA-G plus šūnu analīze nieru fibrozes gadījumāPētījumā par 10 gadījumu sērijunierufifibroze ar imūnķīmisko metodi, mēs atradām 133 ± 102 HLA-G plus šūnas/mm2 un 426 ± 207 CD117 plus šūnas/mm2 (7. tabula). Nebija sakritības starp HLA-G plus un CD117 plus šūnām (3.A attēls).
3. attēls. HLA-G šūnu raksturs reprezentatīvā gadījumānierufibroze. (A) Pirmajā rindkopā fotoattēlā pa kreisi ir redzams Sirius Red krāsojums, vidējā fotoattēlā ir Mayer hematoksilīna prettraips, izmantojot imūnhistoķīmiju. Apļi apļos topogrāfiski atbilst HLA-G un CD117 krāsotiem priekšmetstikliņiem, kur 4H84 atpazīst HLA-G un CD117 atpazīst c-kit šūnas. Sarkanās bultiņas ir pozitīvas šūnas. Taisnstūri parāda spēcīgu šo apgabalu palielinājumu, kas norāda, ka HLA-G šūnas neatbilst CD117 šūnām. (B) Četrkārša imunofluorescence reprezentatīvā gadījumāaknasfibroze, izmantojot DAPI ar ziliem kodoliem, HLA-G (ar 4H84 antivielu) ar zaļu pseidokrāsu, CD117 ciāna pseido krāsā, tuklo šūnu triptāzi sarkanā pseido krāsā un salikto attēlu vai sapludināšanu. Labajā pusē ir attēlots Sirius Red. Šūnas, kas nokrāsotas dzeltenā krāsā uz saplūšanas, atbilst HLA-G plus tuklo šūnām. (C) Ciānas iekrāsotās zonas atbilst daudzām kanāliņām, kas izsaka tikai CD117. Šūnas, kas nokrāsotas dzeltenā krāsā uz saplūšanas, atbilst HLA-G plus tuklo šūnām.
HLA-G plus un CD117 plus šūnas tika skaitītas 10 gadījumosnierufifibroze, izmantojot HALO programmatūru ar atbilstošu algoritmu, pēc imūnhistoķīmijas. HLA-G plus un CD117 plus šūnām ir norādīta vidējā, standarta novirze un diapazons. Četrkāršā marķēšana ar HALO programmatūru, kas savienota ar Sirius Red, un morfoloģiskā analīze uzrādīja būtisku marķējuma neviendabīgumu.nieresatbilstoši ne tikai anatomiskajam reģionam, bet arī tajā pašā anatomiskajā nodalījumā (3.B, C attēls). Tādējādi HLA-G plus šūnu procentuālā daudzuma uzskaitīšana un aprēķināšana šajā orgānā nebija nozīmīga. Patiešām, mikroskopiskā izmeklēšana uzrādīja spēcīgu kanāliņu apkārtmēra iekrāsošanos ar CD117, kas nebija līdzās marķējumam ar tuklo šūnām (3.C attēls). HLA-G plus šūnas ir tuklo šūnas un atrodas iekaisuma interstitijā (3.B, C attēls).
DiskusijaHLA-G proteīnu ekspresija pirmo reizi tika pierādīta citotrofoblastos augļa un mātes saskarnē [12]. Bāzes apstākļos tā ekspresija lielā mērā ir ierobežota ar konkrētiem audiem, piemēram, radzeni [13], aizkrūts dziedzeri [14] un aizkuņģa dziedzera saliņām [15]. Tomēr arī daži šūnu veidi, piemēram, bronhu epitēlija šūnas [16], mezenhimālās šūnas [17], monocītu cilmes šūnas [18–20], kā arī eritroīdie un endotēlija prekursori [21], spēj to ekspresēt īpašos apstākļos. . Mēs iepriekš parādījām, ka tuklo šūnas var ekspresēt HLA-G bazālajā stāvoklī, palielinot ekspresiju noteiktās citokīniem bagātās vidēs, jo īpaši fifibrotiskā vidē.aknu audi.Mēs pētījām, vai HLA-G var ekspresēt tuklās šūnas, kas saistītas araknasFibroze no citas etioloģijas vai fibroze citā orgānā, pētot 41 alkohola izraisītas saslimšanas gadījumuaknasciroze, 10 no IPF un 10 nonierufibroze.
Infekcijas, toksiskas un vielmaiņas traumas un idiopātiskas iekaisuma slimības var veicināt fifibrozes attīstību, jo hronisks ievainojums izraisa parenhīmas šūnu apoptozi, kas atbrīvo profibrogēnus un iekaisīgus citokīnus, piemēram, TGF-. Kolagēnu ražojošās šūnas atšķiras no pastāvīgajām mezenhimālajām šūnām, reaģējot uz traumu. Epitēlija pāreja uz mezenhimālu ir šūnu transdifferences parādība, kas tiek novērota holangiocītiemaknas, pneimocīti plaušās un cauruļveida epitēlija šūnasnieres[22]. Apoptotiskās šūnas izraisa TGF- koncentrācijas palielināšanos visos orgānos. Tomēr dažādos orgānos var atšķirt specifiskas fifibroģenēzes pazīmes. Iekšaknas,apoptoze attiecas uz hepatocītiem, bet tā ietekmē epitēlija šūnas plaušās unnieres[22]. Tādējādi rezidenti fibroblasti iekšānieresun plaušas aktivizējas par miofibroblastu, kas ekspresē a-SMA, kolagēnu1, savukārtaknasmiofibroblasti saglabā savus neironu specifiskos marķierus [23].
Iekšaknas,Aknu zvaigžņu šūnas veido vairāk nekā 80 procentus no visām kolagēnu ražojošajām šūnām. Plaušās pneimocītu bojājumi ir saistīti ar endotēlija šūnu apoptozi. Iekaisuma loma IPF ir pretrunīga. Tipisks IPF neuzrāda iekaisuma šūnu pieplūdumu, taču daži autori norāda uz iekaisuma lomu plaušu fifibroblastu diferencēšanā par ECM ražojošiem miofifibroblastiem [24]. IPF ir iesaistīti atkārtoti nezināmas etioloģijas alveolu epitēlija bojājumi un alveolārā epitēlija apoptoze [25]. Iekšnieresunaknas,mielomonocītu šūnas tiek pieņemtas darbā no kaulu smadzenēm, un tās veido attiecīgi 14 līdz 15 procentus un 8 līdz 12 procentus no miofibroblastiem. Atšķirībā no plaušās fifibrozes atgriezeniskums netiek novērotsaknasunnieresja nav savainojuma un nav sasniegts neatgriešanās punkts. Patiešām, IPF iekaisuma procesi ir ierobežoti, jo īpaši slimības agrīnā fāzē, turpretim atkārtoti nezināmas etioloģijas alveolu epitēlija bojājumi un alveolārā epitēlija apoptoze var veicināt plaušu fifibroblastu vai miofibroblastu proliferāciju un aktivāciju [25].
Kas attiecas uzaknasfifibroze, neveiksmīgs brūču dzīšanas processnieresaudi pēc hroniska, ilgstoša ievainojuma izraisa proinflammatorisku citokīnu veidošanos un sekrēciju, kā arī TGF-, kam ir galvenā loma fifibrotiskajā procesā. Piemēram, iekšāaknasFifibroze, TGF-, kas izteikta kā neliels daudzums mierīgā HSC, tiek ātri ražots šāda veida šūnās pēcaknu bojājums.Papildus HSC, citi TGF-avoti ir aprakstīti kā trombocīti, makrofāgi, hepatocīti un arī tuklo šūnas [26]. TGF- 1 tiek glabāts matricā tā latentā formā, un pēc aktivizēšanas tas veicina pāreju no fifibroblasta uz miofifibroblastu, kas ir būtisks fifibrozes procesam. Turklāt tas kavē ECM degradāciju, nomācot metaloproteāzes un veicinot dabisko inhibitoru TIMP. Tādējādi tas izraisa ECM veidošanos, izmantojot SMAD3-atkarīgus vai ar SMAD nesaistītus mehānismus [27]. Patiešām, starp tuklo šūnām un TGF- pastāv savstarpēja mijiedarbība. TGF- ir spēcīgs tuklo šūnu atraktants; patiešām, patoloģiskie procesi, ko mediē TGF-, bieži ir saistīti ar tuklo šūnu uzkrāšanos [28]. Turklāt tuklās šūnas ir viens no primārajiem IL{10}} avotiem, kas izraisa TGF- -atkarīgu fibrozi [29]. Ir ziņots, ka TGF- veicina vai nomāc tuklo šūnu funkcijas. Patiešām, TGF- inhibē augstas afinitātes IgE receptora Fc1RI ekspresiju, kas aktivizē tuklo šūnas [30]. No otras puses, tas kavē tuklo šūnu proliferāciju, degranulāciju un vairāku efektormolekulu, piemēram, histamīna un TNF-, ražošanu [31]. Ņemot vērā MC palielināšanos fifibrozes gadījumā, TGF- ietekme uz MC funkcijām var būt svarīga, lai regulētu iekaisuma reakcijas, kas uztur fifibrozes procesu.
Tāpat kā C hepatīta vīrusa izraisītā gadījumāaknasfifibroze, mēs atklājām, ka puse no HLA-G plus šūnām alkohola izraisītā ciroze ir tuklo šūnas (2. tabula) un tikai 34 procenti tuklo šūnu ekspresēja HLA-G, ar augstu individuālo mainīgumu, ko parāda standarta novirze (1. . Turklāt mēs novērojām atšķirīgu sadalījumu atbilstoši reģionamaknas,kurā 63–92 procenti HLA-G plus šūnu fifibrotiskajos reģionos bija tuklo šūnas, bet tikai 3–23 procenti bija tuklo šūnas šūnu mezglos (3. tabula). Līdzīgi, tuklo šūnām tiek novērots atšķirīgs modelis, jo 92 procenti tuklo šūnu fifibrotiskajos reģionos ekspresēja HLA-G, bet tikai 23 procenti izteica HLA-G šūnu mezglos (dati nav parādīti). Tādējādi HLA-G ekspresija nav ierobežota ar vīrusu etioloģijuaknasciroze. Patiešām, mēs saņēmām līdzīgu rezultātu plaušām. IPF gadījumā 63 procenti HLA-G plus šūnu fifibrotiskajos reģionos bija tuklo šūnas, savukārt tikai 7 procenti no mezgliem bija tuklo šūnas (6. tabula). Gadījumi,nieruFifibroze bija īpaša. Lielā kanāliņu skaita dēļ nebija iespējams pareizi saskaitīt šūnas fifibrotiskajos reģionos, jo tubulās bija iefiltrējušās tubulās. Var veikt tikai kvalitatīvu mikroskopisku novērojumu, parādot, ka vairākas HLA-G plus šūnas ir tuklo šūnas, nespējot atšķirt kanāliņus no fifibrotiskajiem reģioniem (3. attēls). Tādējādi, šķiet, ka tuklo šūnas HLA-G ekspresē fifibrotiskas slimības gadījumā caur šūnu virsmu un intracitoplazmas molekulām neatkarīgi no orgāna. Mēs jau iepriekš esam pierādījuši, ka cilvēka tuklo šūnas kultūrā spēj ražot šķīstošas HLA-G formas kondicionētā barotnē bazālajā stāvoklī un ka sekrēcija palielinājās pēc stimulācijas ar citokīniem, tostarp IL-10 [10].
Lielāks tuklo šūnu procentuālais daudzums (vairāk nekā puse), kas ekspresē HLA-Gaknasun plaušu bojājumus var izskaidrot ar fifibrozes iekaisuma komponentiem. Patiešām, kā iedzimtas imūnās šūnas, tuklo šūnu skaits palielinās iekaisuma apstākļos, un tās var arī atbrīvot proinflammatory mediatorus [32]. Fifibrotisku slimību gadījumā tuklo šūnu skaits ir paaugstināts. Patiešām, tuklo šūnu blīvums ir lielāks plaušās pacientiem ar IPF nekā tiem, kuriem ir citas plaušu patoloģijas [33] un normālas plaušas. Tāpat arī cilvēksnieru slimībaspavada tuklo šūnu skaita palielināšanāsnierugarozā, īpaši fifibrozes reģionā [34], jo veseliem cilvēkiem tuklo šūnas tiek reti novērotasnieres.
Iepriekšējās publikācijās bija teikts, ka tuklo šūnu nav normālos cilvēka aknās, plaušās un plaušās vai tās ir reti sastopamas.nieres[35]. Zināšanu attīstība par tuklo šūnām ir parādījusi, ka tuklās šūnas kā iedzimtas imūnās šūnas var novērot visos audos, bet tās ir vairāk sastopamas vietās, kas pakļautas videi. Turklāt tiem ir liels receptoru repertuārs, kas ļauj tiem reaģēt uz stimuliem un mijiedarboties ar citām šūnām [36].Nierutuklās šūnas funkcionāli atgādina plaušu šūnas. Ir ziņots par pretrunīgiem datiem par tuklo šūnu lomu fifibrozē. Vairāki autori ir ierosinājuši, ka tuklo šūnas ir iesaistītas fifibrozē, jo tām ir nozīme akūtā un hroniskā iekaisumā, kas to izraisa. Turklāt tuklo šūnas spēj izdalīt histamīnu, heparīnu un IL-4, kas uzlabo fifibroblastu proliferāciju. Tomēr citi [37, 38], tostarp mēs [39], ir parādījuši, ka tuklo šūnām ir antifibrotiska loma: piemēram, dzīvnieku modeļos, piemēram, tuklo šūnu deficīta Ws / Ws pelēm un žurkām. Okazaki et al. parādīja, ka inducētā fibroze bija smagāka žurkām ar tuklo šūnu deficītu nekā savvaļas tipa žurkām [38].
Turklāt ir pierādīts, ka tuklo šūnas ir polarizētas vēža gadījumā, līdzīgi kā makrofāgi [40]. Pretiekaisuma tuklo šūnas ekspresē citokīnus, piemēram, IL-10, un to skaits ir apgriezti saistīts ar iekaisuma smagumu, turpretim proinflammatīvās tuklo šūnas atbilst proinflammatoriem apstākļiem. Iespējams, ka pretiekaisuma tuklo šūnas ekspresē HLA-G, jo īpaši tāpēc, ka (i) vairākos modeļos ir parādīta saistība starp IL-10 līmeni un HLA-G ekspresiju un (ii) HLA-G. ir pretiekaisuma iedarbība. HLA-G ekspresējošās tuklo šūnas var būt slimības agrīnā stadijā, iekaisuma fāzē, lai neitralizētu iekaisumu, kas ir pirmā reakcija uz bojājumu. Literatūrā ir ziņots, ka Il-10, samazinot iekaisuma reakciju, var kavēt miofibroblastu proliferāciju un kolagēna sintēzi [41]. Patiešām, IL-10 var būt aizsargājoša loma alkoholiķiemaknu slimība[42]. Turpretim pacientiem ar IPF tika konstatēts augstāks IL-10 līmenis serumā nekā normāliem cilvēkiem, un augstākais IL-10 līmenis bronhoalveolārajā skalā tika pierādīts pacientiem ar IPF, salīdzinot ar sarkoidozi vai paaugstinātas jutības pneimonītu. [43]. To varētu izskaidrot ar mazāk svarīgo iekaisuma komponentu. Innierufifibroze, peles modelī tika pierādīts, ka IL-10 trūkums pasliktinājanieresiekaisums un fibroze [44]. Cilvēkiem ārstēšana ar lokālu IL-10 imūnterapiju, kas saistīta ar TGF antagonistu, uzlabo hroniskunieru slimība [45].
Vēl viens būtisks rezultāts ir HLA-G plus šūnu novērošana šūnu mezglos, netālu no fifibrotiskajiem reģioniem retos alkohola cirozes gadījumos. Šīs šūnas ir morfoloģiski raksturotas ar viegli atpazīstamu mazu vai vidēju šūnu kopu, kas liecina par limfoīdo agregātu. To morfoloģiskās īpašības liecina par folikuliem, kas ir struktūras, ko veido galvenokārt B limfocīti. Četrkāršā imunofluorescence mezglos apstiprināja šo hipotēzi, jo 68 procenti HLA-G plus šūnu līdzekspresēja CD20, kas ir specifisks B limfocītu marķieris (3. tabula). Līdzīgas struktūras tika novērotas arī IPF ar līdzīgu rezultātu, kas liecina, ka 76 procenti HLA-G plus šūnu mezglos ir B limfocīti (6. tabula). Ir ziņots par limfoīdo neoģenēzi fibrozes gadījumā. Tādējādi noteiktos patoloģiskos apstākļos, piemēram, pastāvīgs iekaisums, šūnu agregāti var attīstīties ļoti organizētā struktūrā, kas atgādina sekundāros limfoīdos audus, ti, terciāros limfoīdos orgānus vai ārpusdzemdes limfoīdos folikulus [46]. Šādi limfoīdie folikuli satur ar T-šūnām bagātas zonas un atšķirīgus B-šūnu folikulus ar germinālajiem centriem [47]. Mehānismu, ar kuru infifiltrējošās B šūnas organizē ārpusdzemdes folikulu un germinālo centru, kontrolē limfotoksīns- 1 2 un limfoīdie ķīmokīni, piemēram, CC-chemokine ligand 19 (CCL19), CCL21, CXC-chemokine ligand 12 (CXCL12) un CXCL13, kas regulē limfocītu pārvietošanu. Papildus laima fotoksīnam un kemokīniem ir nepieciešama arī antigēna stimulācija, lai izraisītu un uzturētu folikulu veidošanos. Šādi folikuli netika novēroti mūsu izraisītajā C hepatīta vīrusa grupāaknasfifibroze un tika konstatēti tikai vienā no trim alkohola izraisītiem gadījumiemaknasfifibroze, kas liecina par noteiktu slimības stadiju. Patiešām, ārpusdzemdes limfoīdo orgānu funkcija un to korelācija ar iekaisumu un fibrozi vēl nav skaidra. Vairāki pētījumi ir parādījuši jaunu un pārsteidzošu B šūnu lomu fifibroblastu regulēšanā fifibrozes gadījumā, kur to profifibrotiskais efekts ir analoģisks TGF- un arī pastiprina B-šūnu aktivējošais faktors (BAFF) [48].
HLA-G šūnu avota nozīme fifibrozes gadījumā ir ne tikai aprakstoša, bet arī funkcionāla. HLA-G ir inhibējoša iedarbība uz visu veidu limfocītu [49] un dendritisko šūnu [20,50] darbību, izmantojot specifiskos receptorus, piemēram, ILT2 un ILT4. HLA-G klātbūtne šajās imūnās šūnās ir ne tikai iekaisuma marķieris, bet arī atbilstošas imūnreakcijas pazīme, mazinot arī iekaisumu. Patiešām, ir zināms, ka HLA-G spēlē aizsargājošu lomu pret pārspīlētām iekaisuma reakcijām, kā iepriekš tika parādīts septiskā šoka gadījumā [51]. Turklāt mēs iepriekš pētījām abpusējo mijiedarbību starp tuklo šūnām un aknu zvaigžņu šūnām un parādījām, ka tas izraisa tuklo šūnu pievilcību un ievērojamu kolagēna ražošanas samazināšanos HSC šūnās, izmantojot HLA-G ražošanu [39]. Turklāt HLA-G ekspresija ar B šūnām ārpusdzemdes folikulos var arī palīdzēt neitralizēt B limfocītu profifibrotisko ietekmi uz miofifibroblastiem, inhibējot B šūnas ar autokrīna mehānisma palīdzību.
Pacienti un metodes
Pacienti41 cilvēku grupaaknastika pētīti transplantācijas pacienti ar alkohola izraisītu cirozi. Pacienti tika informēti par protokolu un tika saņemts iebildumu neesamība (Slimnīcas ētikas komiteja, paziņojums Nr. 16.47). Desmit parafīna bloku parauginierufifibroze un 10 IPF (Slimnīcas ētikas komiteja, paziņojums Nr. 16.123), pilnībā un neatgriezeniski anonimizēti, tika pētīti saskaņā ar Helsinku deklarācijas principiem. Trīs kohortu klīniskās un bioloģiskās īpašības ir apkopotas attiecīgi 8.–10. tabulā.
Metodoloģija
Imūnhistoķīmija un imunofluorescenceAudi tika iegūti no eksplantācijasaknasunnieruvai plaušu biopsija. Tika sagatavotas parafīnā iestrādātas sērijas sekcijas (4 µm biezas) un veikta standarta histoloģiskā krāsošana, ti, HES krāsojums un kolagēna Sirius Red marķēšana. Paralēli imūnhistoķīmija un imunofluorescence tika veikta parafīnā iestrādāto sekciju sērijveida sekcijām no tā paša bloka pēc deparaffinizācijas un antigēna izguves protokola. Primārās antivielas (mAb) bija šādas: monoklonāls peles anti-cilvēka HLA-G (Exbio, 4H84 2 µg/mL vai 1:100, Vestec, Čehija), poliklonāls truša anti-cilvēka CD117/c-komplekts. , kas atpazīst mieloīdo un tuklo šūnu (Dako, 1:200, Kopenhāgena, Dānija), peles monoklonālo anti-cilvēka (hum) tuklo šūnu triptāzi (klons AA1, Dako, 1:1000), kas ir raksturīgs tuklo šūnām, monoklonāls anti-cilvēka CD3 (Thermo Scientififics, SP7, 1:500, Waltham, MA, ASV), raksturīgs T limfocītiem, un monoklonāls pret cilvēka CD20 (Dako, M0755, 1:600), raksturīgs B limfocītiem.
Īsumā, priekšmetstikliņi imūnhistoķīmijai tika inkubēti ar primāro antivielu Discovery Ultra (Roche, Meylan, Francija) automatizētajā sistēmā. Saistītā primārā antiviela tika atklāta, izmantojot biotinilētu kazu anti-peles vai anti-trušu IgG sekundāro antivielu (Vector, ABCYS, les Ulis, Francija, 1:700) un diaminobenzidīnu (DAB MAP noteikšanas komplekts, Roche). , Meylan, Francija), kam seko Mayer hematoksilīna krāsojums. Lai precīzi noteiktu HLA-G plus šūnu raksturu, trīskāršu (DAPI, CD117, tuklo šūnu triptāze), četrkāršu (DAPI, HLA-G, CD117, tuklo šūnu triptāze) un pieckāršu (DAPI, HLA-G, CD3, CD20, tuklo šūnu triptāzes) imūnfluorescences krāsošana pēc tam tika veikta trīs reprezentatīviem alkohola izraisītas cirozes gadījumiem un diviem reprezentatīviem IPF gadījumiem. Atklāsme tika veikta, izmantojot Discovery FAM, rodamīna, DCC un Cy5 komplektus (Ventana Medical Systems, Illkirch, Francija). Pēc krāsošanas visas sekcijas virsmas attēls tika digitalizēts ar 20 × vai 40 × palielinājumu, izmantojot konfokālo skeneri (Panoramic Scanner, 3DHistech, Budapešta, Ungārija). Imūnhistoķīmija un daudzkārtēja imunofluorescences krāsošana tika analizēta, izmantojot HALO digitālās analīzes programmatūru (V3.0.311). Programmatūra tika apmācīta atpazīt fifibrozi (Sirius Red), izmantojot moduli Area Quantifification (V2.1.3), savukārt Fish-IF modulis (v1.2.2) tika apmācīts paraugiem, kas marķēti ar krāsvielām. Katra parauga veselas sadaļas tika atlasītas analīzei ar atbilstošo algoritmu. Dati tika iegūti izklājlapu programmatūrā analīzei.
SecinājumsŠis darbs, kas saistīts ar mūsu iepriekšējiem datu eksperimentiem par tuklo šūnu pretaizsardzības lomu, izmantojot HLA-G ekspresiju [39], liecina, ka tuklo šūnām ir antifibrotiska un aizsargājoša loma, izmantojot HLA-G ekspresiju fifibrotiskās situācijās. Šo lomu pastiprina B limfocīti, kas ekspresē HLA-G ārpusdzemdes folikulos. Kopumā šie atklājumi liecina par aizsargājošu lomu HLA-G, ko ekspresē tuklās šūnas fifibrotiskajos orgānos.
