Kā cilvēka defensīns izpaužas cilvēka nierēs un urīnceļos 5

Plašāka informācija:ali.ma@wecistanche.com

Džons Deivids Spensers u.c

Abstrakts

Fons:Mehānismi, kas uztur sterilitāti urīnceļos, ir nepilnīgi saprotami. Nesenie pētījumi liecina par antimikrobiālo peptīdu (AMP) nozīmi urīnceļu aizsardzībā no infekcijas. Šeit mēs raksturojam AMP cilvēka alfa-defensīna 5 (HD5) izpausmi un nozīmi cilvēka organismā.nieresun urīnceļi normāliem un inficētiem subjektiem.

Metodoloģija/Galvenie secinājumi:Izmantojot no cilvēka izolētu RNSnieres, urīnvada un urīnpūšļa audos, mēs veicām kvantitatīvu reāllaika PCR, lai parādītu, ka DEFA5, gēns, kas kodē HD5, ir konstitutīvi ekspresēts visā urīnceļā. Pielonefrīta gadījumā DEFA5 ekspresija ievērojami palielinājāsnieres. Izmantojot imūnblota analīzi, HD5 ražošana palielinājās arī ar pielonefrītu. Imunokrāsojums, kas lokalizēts HD5 urīnpūšļa un urīnvada urotēlijam. Nierēs HD5 galvenokārt tika ražots distālajā nefronā un savākšanas kanāliņos. Izmantojot imūnblota un ELISA testus, HD5 netika regulāri atklāts neinficētos cilvēka urīna paraugos, bet tas nozīmē, ka HD5 ražošana urīnā palielinājās ar E.coli urīnceļu infekciju.

Secinājumi/nozīme:DEFA5 tiek ekspresēts visā urīnceļos neinficētiem indivīdiem. Konkrēti, HD5 tiek ekspresēts visā apakšējo urīnceļu urotēlijā un urīnceļu savākšanas kanāliņos.nieres. Ar infekciju HD5 ekspresija palielināsnieres, un līmenis kļūst nosakāms urīnā. Cik mums zināms, mūsu atklājumi ir pirmie, kas kvantitatīvi nosaka HD5 ekspresiju un veidošanos cilvēka nierēs. Turklāt šis ir pirmais ziņojums, kas atklāj HD5 klātbūtni inficētos urīna paraugos. Mūsu rezultāti liecina, ka HD5 var būt svarīga loma urīnceļu sterilitātes uzturēšanā.

Cistanche UK nieru slimībai, noklikšķiniet šeit, lai iegūtu paraugu

Ievads

Urīnceļi, izņemot urīnizvadkanālu, parasti ir sterili, neskatoties uz to, ka tie ir tuvu fekāliju florai. Precīzi mehānismi, ar kuriem urīnceļi saglabā savu sterilitāti, nav labi saprotami. Piedāvātie mehānismi, kas veicina urīnceļu aizsardzību, ietver urīna plūsmu, urīna pH un osmolaritātes izmaiņas, regulāru urīnpūšļa iztukšošanu, uroepitēlija ķīmiskās aizsardzības sastāvdaļas un efektoru imūnšūnu epitēlija izdalīšanos/pieplūdumu ar baktēriju stimulāciju [1]. Turklāt nesen tika pierādīts, ka antimikrobiālajiem peptīdiem (AMP) ir svarīga loma urīnceļu sterilitātes uzturēšanā [2]. AMP, kas kalpo kā dabiskas antibiotikas, ko ražo gandrīz visi organismi, ir visuresoša iedzimtas imūnsistēmas sastāvdaļa. AMP ir katjonu molekulas, ko ekspresē fagocītiskās baltās šūnas un epitēlija šūnas. Cilvēkiem un citiem zīdītājiem defensīni ir galvenā AMP saime. Defenzīniem parasti ir plaša spektra pretmikrobu iedarbība pret grampozitīvām un gramnegatīvām baktērijām, vīrusiem, sēnītēm un vienšūņiem [2,3]. Defensīni sākotnēji tiek sintezēti kā preproteīni un tiek apstrādāti, lai kļūtu par nobriedušiem, bioloģiski aktīviem peptīdiem [4]. Cilvēkiem defensīni tiek klasificēti vienā no divām ģimenēm atkarībā no to disulfīdu savienojuma modeļa - alfa-defensīni vai beta-defensīni [5].

Urīnceļos beta-defensīni plaši izpaužas visā uroepitēlijā. Epitēlija šūnas, kas pārklājnieresHenles cilpa, distālais kanāliņš un savācējvads konstitutīvi ekspresē cilvēka beta-defensīnu 1 (hBD1). Lai gan hBD1 līmenis urīnā nav pietiekams, lai iznīcinātu iebrūkošās baktērijas, hBD1 nodrošina ātras darbības pretmikrobu pārklājumu cauruļveida lūmeniem un novērš infekciju, kavējot baktēriju piesaisti urotēlijam [6]. Jaunākie pētījumi liecina, ka hBD1 redoksstāvoklis būtiski ietekmē pretmikrobu iedarbību tā, ka reducētais peptīds ir daudz spēcīgāks nekā ar disulfīdu saistītā oksidētā forma [7]. Tā nozīme urotēlija virsmā nav noteikta. Vēl viens defensīns, cilvēka beta-defensīns 2 (hBD2) nav konstitutīvi ekspresēts veselos nieru audos; tomēr hBD2 ekspresiju izraisa infekcija [8].

Atšķirībā no beta-defensīniem, no epitēlija atvasināto alfa-defensīnu loma urīnceļos nav labi aprakstīta. Par alfa-defensīnu HD5 un HD6 ekspresiju un darbību galvenokārt ziņots tievajās zarnās, kur Panethcells tos izdala zarnu kriptos un veicina zarnu mikrobiotas līdzsvaru [9]. HD5 ir lokalizēts arī vīriešu un sieviešu dzimumorgānos, un pierādījumi liecina, ka tas ir inducējams un svarīgs infekcijas izskaušanā [10, 11, 12]. Urīna HD5 ir konstatēts pacientiem, kuriem ir veikta ileālā neobuļa rekonstrukcija un ileālā vadu urīna novirzīšana, kā rezultātā HD5 ražošanas avots galvenokārt tika ieskaitīts ileālās Paneth šūnās [13, 14]. HD5 piemīt antibakteriāla iedarbība pret parastajām uropatogēnajām grampozitīvām baktērijām un gramnegatīvām baktērijām [15]. HD5 ir arī pretmikrobu iedarbība pret uropatogēniem vīrusiem, piemēram, adenovīrusu un BK vīrusu [16, 17, 18]. Šajā pētījumā mēs sniedzam sākotnējo HD5 ekspresijas aprakstu un kvantitatīvo noteikšanu cilvēkānieresun tālāk definē tā izpausmi apakšējos urīnceļos sterilitātes un infekcijas laikā.

Rezultāti

DEFA5 mRNS tiek konstitutīvi ekspresēta cilvēka urīnpūslī, urīnvadā un nierēs

Kvantitatīvā reāllaika PCR parāda, ka visi pārbaudītie urīnpūšļa, urīnvada un nieru paraugi bez infekcijas konstitutīvi izteica DEFA5. DEFA5 ekspresija bija ievērojami lielāka apakšējos urīnceļos nekā augšējos urīnceļos (p= 0.014). Urīnpūslī (n=4) vidējā DEFA5 ekspresija bija 4656637 transkripti uz 10 ng RNS un urīnvadā (n=4) vidējā DEFA5 ekspresija bija 41126170 transkripti uz 10 ncRNS (1.A attēls). . Nierēs (n=6) vidējā DEFA5 ekspresija bija 2 9376274 transkripti uz 10 ng RNS. DEFA5 ekspresija tika analizēta atsevišķi nieru garozā, smadzenēs un iegurnī. DEFA5 ekspresija būtiski neatšķīrās atkarībā no nieru reģiona (p= 0,45).

DEFA5 ekspresija un HD5 peptīdu ekspresija palielinās ar pielonefrītu

Kvantitatīvā reāllaika PCR analīze, kas veikta nieru audiem ar pielonefrītu, parādīja ievērojamu DEFA5 ekspresijas pieaugumu, salīdzinot ar neinficētiem nieru audiem. Ar pielonefrītu (n= 6) vidējā DEFA5 ekspresija palielinājās līdz 7 82961 052 transkriptiem uz 10 ng RNS (p= 0.019) (2.A attēls).

Lai tālāk novērtētu šo ekspresijas palielināšanos ar pielonefrītu, mēs veicām imūnblota analīzi tiem pašiem nieru audiem, ko izmantoja reāllaika PCR analīzei, lai novērtētu vienlaicīgu HD5 peptīdu ražošanas pieaugumu (2.B attēls, vidējais panelis). Imunoblota analīze, izmantojot poliklonālos HD5 antiserumus, parādīja ievērojami lielāku HD5 peptīdu veidošanos nieru audos ar pielonefrītu (n=6), salīdzinot ar neinficētiem nieru audiem (n=6). Neinficēti nieres audi izteica 300625 ng HD5/g mitro audu svara, savukārt nieru audi ar pielonefrītu izteica 600621 ng HD5/gram mitro audu svara (p,0,0001). Bloti tika atkārtoti pārbaudīti ar GAPDH, lai kalpotu kā iekraušanas kontrole (2.B attēls, vidējais panelis), un tika veikts arī sudraba traips, lai apstiprinātu vienādu olbaltumvielu slodzi (2.B attēls, augšējais panelis).

HD5 peptīds tiek ražots visā cilvēka nierēs un urīnceļos

Tika veikta imūnkrāsošana, lai lokalizētu HD5 veidošanos urīnceļos. Imūnhistoķīmija (IHC) parādīja, ka HD5 imūnreaktivitāte bija visā urīnvada un urīnpūšļa urotēlijā visos pētītajos paraugos (n=4, 3. attēls). IHC arī parādīja, ka HD5 veidojas visu nieru garozas kanāliņos un medullas. paraugi (n= 6, 4. attēls). Imunofluorescence (IF) parādīja, ka HD5 ekspresija bija vislielākā distālajā nefronā un savākšanas kanāliņos (5. attēls). Interstitijs un glomerulos neuzrādīja HD5 imūnreaktivitāti. 3., 4. un 5. attēlā parādītā imūnkrāsošana tika veikta, izmantojot peles monoklonālo anti-HD5 antivielu (8C8), kas atpazīst HD5 propeptīdu (Abcam, Kembridža, MA). Rezultāti bija līdzīgi, lietojot trušu poliklonālo anti-HD5 antivielu, kas atpazīst HD5 propeptīdu un nobriedušu peptīdu (dati nav parādīti), kas liecina, ka HD5 tiek uzglabāts kā propeptīds.

Pielonefrīta gadījumā HD5 imūnreaktivitāte ievērojami palielinājās. HD5 imūnreaktivitāte palielinājās visā proksimālajā nefronā, distālajā nefronā un savākšanas kanāliņos (4. un 5. attēls). Tāpat kā neinficētos paraugos, glomerulos un interstitijā ar infekciju nebija HD5 ekspresijas. Negatīvās kontroles neuzrādīja HD5 imūnreaktivitāti.

Inficētā cilvēka urīns satur izmērāmu

HD5 peptīda koncentrācija

Imunoblota analīze, izmantojot trušu poliklonālo antiserumu, kas nosaka prekursoru proHD5, un tālāk apstrādātas formas, identificēja izmērāmus HD5 līmeņus 13 no 15 pārbaudītajiem urīna paraugiem, kas bija inficēti ar uropatogēno E.coli (6.A un B attēls). Ja tas bija, HD5 līmenis, normalizēts līdz urīna kreatinīnam, svārstījās no 299,8–669,7630 ng HD5/mg urīna Cr (110,67 ng/mL–276,67 ng/mL), kas atbilst 11,10–27,67 nmol/l. Inficēti urīna paraugi (n=15), HD5 bija tuvu noteikšanas robežai (,50 ng) vai zem tās. Ar enzīmu saistīts imūnsorbcijas tests (ELISA) tiem pašiem urīna paraugiem, izmantojot peles monoklonālo antivielu (8C8), kas nosaka tikai prekursoru proHD5, konstatēja izmērāmu proHD5 līmeni 13 no 15 pārbaudītajiem inficētajiem paraugiem. ProHD5 koncentrācija urīnā svārstījās no 122,78 līdz 490,060,03 ng HD5/mg urīna Cr (30,02 ng/mL – 200,5 ng/mL), ja tāda bija (7. attēls).

Diskusija

Šajā pētījumā mēs sniedzam sākotnējo HD5 raksturojumu cilvēka nierēs, urīnvadā un urīnpūslī. Ir pierādīts, ka HD5 ir svarīgs AMP, kas novērš invazīvu infekciju zarnās un tiek pastiprināti regulēts dzimumorgānos infekcijas laikā [11,18,19,20,21]. Ir pierādīts, ka no epitēlija iegūti AMP, piemēram, HD5, ir svarīgi urīnceļu sterilitātes uzturēšanā [8, 22, 23, 24]. Šo iedzimto gļotādas aizsargspēju trūkumi var izraisīt akūtu un/vai hronisku infekciju [25,26].

Mūsu kvantitatīvie reāllaika PCR rezultāti parāda, ka DEFA5 ir konstitutīvi ekspresēts cilvēka nierēs, urīnvados un urīnpūslī. DEFA5 ekspresija palielinās no augšējiem urīnceļiem uz apakšējiem urīnceļiem, sekojot urīna plūsmas plūsmai un pieaugošajam tuvumam mikrobiotas invāzijas punktam. Cik mums zināms, šis ir pirmais pētījums, lai kvantitatīvi noteiktu DEFA5 ekspresiju cilvēka nierēs un urīnpūslī. Nesen Townes et al parādīja, ka normāls distālais urīnvads var izteikt DEFA5 [14]. Mūsu rezultāti arī liecina, ka DEFA5 konstitutīvi ekspresē distālais urīnvads. Lai gan DEFA5 ekspresija urīnceļos ir gandrīz 100-reizi zemāka nekā kuņģa-zarnu trakta audos, DEFA5 bazālā uroepitēlija ekspresija ir salīdzināma ar iepriekš aprakstīto urīnceļu pastiprinātāju, piemēram, katelicidīna, hBD-1, hBD ekspresiju. -2 un ribonukleāze 7[6,8,22,24,27]. Pretstatā nobriedušam kuņģa-zarnu traktam, kur DEFA5 tiek izteikts augstā līmenī gan veselības stāvokļa, gan infekcijas/iekaisuma gadījumā, mūsu kvantitatīvā reāllaika PCR dati liecina, ka DEFA5 ekspresija nierēs ir ievērojami paaugstināta ar infekciju [27, 28, 29]. Šis inducējamais ekspresijas modelis ir analogs DEFA5 ekspresijai sieviešu reproduktīvajā traktā, kur DEFA5 ekspresija palielinās ar salpingītu [30]. Urīnceļos Taunss un citi ir parādījuši tendenci uz lielāku DEFA5 ekspresiju urīnizvadkanālā pacientiem ar UTI, kuriem veikta ileālā urīna novirzīšanās [14].

Mūsu imūnblota analīze papildina reāllaika PCR datus, parādot, ka HD5 peptīdu ražošana palielinās ar pielonefrītu. Šis inducējamais HD5 veidošanās modelis ir līdzīgs tam, kas novērots dažiem beta-defensīnu saimes locekļiem. hBD2 uzrāda inducējamu ražošanas modeli ar urīnceļu infekciju un/vai hronisku pielonefrītu [8,31,32]. Ir pierādīts, ka HD5peptīda ražošana palielinās sieviešu dzimumorgānu augšdaļā un vīriešu urīnizvadkanālā ar iekaisumu [11,30].

Izmantojot imūnkrāsošanu, mēs parādām, ka HD5 vienmērīgi tiek ražots visā urīnvada un urīnpūšļa urotēlijā. Tā kā lielākā daļa UTI rodas no fekālo floras, kas paceļas urīnpūslī, šie rezultāti liecina, ka HD5 ekspresija ir sastopama vietās, kur mikrobu iedarbība notiek visbiežāk [33]. Tāpēc HD5 ir ideāli novietots, lai novērstu augošu mikrobu infekciju. Nierēs HD5 galvenokārt tiek ražots distālajā nefronā un savākšanas kanāliņos. Šie atklājumi liecina, ka HD5 tiek ražots vietās, kur tas tiks novietots tā, lai tam būtu optimāla pretmikrobu aktivitāte. Iepriekšējie pētījumi liecina, ka defensīnu pretmikrobu īpašības ir atkarīgas no sāls koncentrācijas – augstāka sāls koncentrācija samazina pretmikrobu aktivitāti [23,34,35]. Mēs domājam, ka zemā sāls koncentrācija distālajā nefronā un savākšanas kanāliņos nodrošina labvēlīgu vidi HD5 pretmikrobu aktivitātei.

Imunoblota un ELISA analīze arī parāda, ka HD5 tiek izdalīts urīnā zemā līmenī. Ņemot vērā proHD5 un pilnībā apstrādātā HD5 izmēru (8, 1 kDa un 3, 7 kDa) un pozitīvo lādiņu, iespējams, ka daži urīna HD5 peptīdi vismaz daļēji rodas no plazmas filtrāta. Tomēr ir maz pierādījumu, kas liecinātu, ka HD5 saglabājas plazmā [27]. Turklāt, lai HD5 parādītos urīnā, būtu jāizvairās no efektīvajiem peptīdu absorbcijas mehānismiem proksimālajā kanāliņā [6, 36]. Visbeidzot, pirms testu veikšanas izmantotie urīna paraugi tika centrifugēti, noņemot HD5 šūnu avotus. Noteiktajās koncentrācijās urīna HD5, visticamāk, nebūs tieši pretmikrobu iedarbība pret uropatogēniem mikroorganismiem, jo ​​pilnībā apstrādātam HD5 ir minimālā inhibējošā koncentrācija (MIC) no 6 līdz 10 mg/ml pret parastajām gramnegatīvajām uropatogēnajām baktērijām [15]. Tomēr gļotādas virsmas koncentrācija, visticamāk, būs augstāka. Turklāt imunoblota analīze parāda, ka HD5 koncentrācija nierēs ir ievērojami lielāka. Šie rezultāti liecina, ka HD5 ir iesaistīts urīnceļu gļotādas aizsardzībā. Analogs modelis ir redzams ar hBD1, kur hBD1 koncentrācija urīnā nav pietiekama, lai parādītu pretmikrobu aktivitāti, bet augstākas peptīdu koncentrācijas tiek konstatētas nieru kanāliņu tuvumā [6, 31].

Tā kā IHC pierāda, ka proHD5 ir galvenā HD5 forma nierēs, un tāpēc, ka urīnā tiek konstatēts gan nobriedis, gan proHD5, mēs domājam, ka HD5 galvenokārt izdalās kā prekursoru molekula un pēc tam tiek pakļauta proteolītiskajai apstrādei, lai radītu nobriedušas formas – līdzīgi kā kuņģa-zarnu traktā. un uroģenitālās sistēmas [11,30,37]. Tievajā zarnā Paneth šūnas ražo tripsīnu, kas šķeļ HD5 propeptīdu tā, ka pilnībā apstrādātais peptīds ir dominējošā forma zarnu lūmenā [37]. Vīriešu urīnizvadkanālā galvenie HD5 apstrādes un aktivizējošie enzīmi ir neitrofilu proteāzes, ko veicina

neitrofīli, kas tika piesaistīti infekcijas vietai [11]. Joprojām ir jānosaka epitēlija tripsinogēna, urīna tripsīna un/vai neitrofilu proteāžu ietekme uz HD5 apstrādi urīnceļos infekcijas laikā. Turklāt vēl ir jānosaka urīna vides izmaiņu ietekme uz HD5 funkciju (izmaiņas osmolaritātē, pH un katjonu koncentrācijās).

Noslēgumā jāsaka, ka šis ir pirmais pētījums, lai identificētu un kvantitatīvi noteiktu HD5 ekspresiju un veidošanos urīnceļos. Mūsu rezultāti liecina, ka HD5 ir no epitēlija iegūts AMP, kam var būt svarīga loma cilvēka uroepitēlija iedzimtajā imunitātē, novēršot invazīvu patogēnu pārvietošanos cirkulācijā. HD5 ražošanu regulējošo faktoru noskaidrošana var sniegt jaunu ieskatu UTI patoģenēzē pacientiem, kuriem ir UTI risks, un pacientiem ar hroniskām infekcijām.

Metodes

Studiju apstiprināšana

No visiem pacientiem, kas piedalījās šajā pētījumā, tika iegūta informēta rakstiska piekrišana. Subjektiem, kas jaunāki par 18 gadiem, tika saņemta rakstiska vecāku/aizbildņu piekrišana. NationwideChildren's Hospital (NCH) Institucionālā pārskata padome apstiprināja šo pētījumu kopā ar piekrišanas procesu un dokumentiem (IRB07-00383).

Cilvēka audu un urīna paraugi

Neinficēti distālā urīnvada un urīnpūšļa audi (n= 4) tika iegūti no bērniem, kuriem tika veikta urīnvada atkārtota implantācija citu iemeslu dēļ, nevis atkārtotas infekcijas dēļ. Neinficēti nieru paraugi (n=6) tika iegūti no pacientiem, kuriem tika veikta nefrektomija nieru audzēju dēļ. Audu paraugos nebija makroskopisku slimības vai iekaisuma pazīmju. Nieru audus pacientiem ar hronisku pielonefrītu nodrošināja Cooperative HumanTissue Network (n=6) [38]. Divi neatkarīgi patologi apstiprināja pielonefrīta histopatoloģisko diagnozi. Audu paraugi tika ātri sasaldēti vai konservēti kā neitrālas formalīna fiksētas parafīnā iestrādātas sekcijas. Neinficētu nieru audu sekcijas pirms uzglabāšanas tika sadalītas garozā, medulā vai nieru iegurnī (n=4).

Neinficēti un inficēti urīna paraugi tika iegūti no bērniem, kuri ieradās NCH neatliekamās palīdzības nodaļā vai nefroloģijas klīnikā. UTI diagnoze tika noteikta pēc pozitīvas urīna kultūras saskaņā ar Amerikas Pediatrijas akadēmijas vadlīnijām [39]. Visos inficētajos urīna paraugos bija.106 KVV/mL E.coli. Urīna pH vērtības svārstījās no 5,5 līdz 8,5 (vidējais urīns 6,9). Urīna jonu sastāvs netika izmērīts. Urīna paraugus centrifugēja, lai noņemtu urīna nogulsnes, un tika pievienots proteāzes inhibitoru kokteilis (Thermo Scientific, Rockford, IL, ASV).