Imūnās atbildes reakcija uz alogēno tīklenes cilmes šūnu secīgu binokulāru transplantāciju uz stiklveida dobumu pelēm

Anotācija:

Alogēnu cilvēka tīklenes cilmes šūnu (RPC) intravitreāla transplantācija ir daudzsološa kā tīklenes apžilbinošas deģenerācijas ārstēšana. Iepriekšējais darbs ir parādījis, ka nervu priekšteči ir labi panesami kā alotransplantāti pēc vienreizējām injekcijām; tomēr secīga alogēnu šūnu piegāde palielina saimnieka sensibilizācijas risku ar sekojošu transplantātu imūno atgrūšanu. Pašreizējais pētījums tika izstrādāts, lai novērtētu, vai imūnreakciju izraisīs atkārtotas alogēnu RPC intravitreālas transplantācijas, izmantojot peles dzīvnieku modeli. Mēs injicējām peļu tīklenes cilmes šūnas (gmRPC), kas sākotnēji iegūtas no donoriem ar C57BL/6 ģenētisko izcelsmi, BALB/c recipienta pelēm, lai sniegtu drošības datus par to, kas varētu būt gaidāms pēc atkārtotas pacientu ārstēšanas ar alogēnu cilvēka šūnu produktu. . Imūnās atbildes reakcijas uz gmRPC bija vieglas, sastāvēja no T šūnām, B šūnām, neitrofiliem un dabīgām killer šūnām, un skaidri dominēja makrofāgi. Dzīvniekiem, kas tika ārstēti ar atkārtotām gmRPC devām, netika novēroti sensibilizācijas pierādījumi, kā arī netika novērota imūnsistēmas izraisīta transplantātu iznīcināšana. Neskatoties uz to, ka netika veikta imūnsupresīva ārstēšana, alogēni gmRPC transplantāti izdzīvoja pēc atkārtotas dozēšanas, tādējādi sniedzot atbalstu sākotnējam novērojumam, ka pacientiem ar pigmentozu retinītu ir pieļaujama atkārtota alogēnu RPC injekcija stiklveida ķermeņa dobumā.

cistanche augu paaugstinošā imūnsistēma

Noklikšķiniet šeit, lai skatītu Cistanche Enhance Immunity produktus

【Jautājiet vairāk】 E-pasts:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Atslēgvārdi: cilmes šūnas; imūnā tolerance; imūnās privilēģijas; transplantāta atgrūšana; intravitreāla injekcija

1. Ievads

Retinīts pigmentosa (RP) ietver ģenētisku stieņu konusa deģenerācijas klasi un izraisa progresējošus redzes traucējumus un iespējamu aklumu. Lielākajā daļā gadījumu nav pieejami pierādīti terapeitiski pasākumi redzes saglabāšanai vai atjaunošanai; tomēr viena stratēģija šīs neapmierinātās medicīniskās vajadzības risināšanai ir cilmes šūnu transplantācija. Mūsu pētniecības grupa ir izpētījusi kultivētu cilvēka tīklenes cilmes šūnu (RPC) intravitreālu injekciju kā veidu, kā iejaukties RP ar terapeitisku mērķi stabilizēt slimības progresēšanu vai, iespējams, mainīt slimības gaitu. RPG var iegūt no nenobriedušām tīklenēm ar audu ziedošanu vai nesen no pluripotentām šūnu līnijām. Pētījumi ar dzīvnieku modeļiem ir parādījuši, ka šīs šūnas spēj glābt fotoreceptorus no deģenerācijas pēc injekcijas acī, kā arī spēj diferencēties par stieņu fotoreceptoriem saimnieka acī. Ir daži pierādījumi no pētījumiem ar dzīvniekiem, ka injicētie hRPC var kļūt par funkcionāliem, integrētiem fotoreceptoriem un tādējādi potenciāli stabilizēt tīkleni, tieši aizstājot mirstošās šūnas. Tādējādi injicētie hRPC var ārstēt RP gan neirotrofiski, gan ar šūnu aizstāšanas mehānismu. Jebkurā gadījumā šī uz šūnām balstītā pieeja piedāvā racionālu stratēģiju RP un, iespējams, citu tīklenes slimību skartu pacientu ārstēšanai.

Vēl viens labvēlīgs RPC un, iespējams, neironu priekšteču atribūts ir relatīvā tolerance, kas šīm šūnām tiek nodrošināta pēc transplantācijas kā alotransplantāti, īpaši, ja tās tiek nogādātas vietā, kurā ir imūnās privilēģijas, piemēram, tīklenē [1, 2]. Tomēr jaunākie pārskati par klīniskajiem pētījumiem, kas veikti reģeneratīvās medicīnas jomā, turpina ziņot par plaši izplatītām un nozīmīgām problēmām, kas saistītas ar iekaisumu un imūnās atgrūšanu [3, 4], tostarp attiecībā uz intervencēm, kas vērstas uz aci, piemēram, tīklenes gēnu terapiju [5], kā. kā arī dažas, bet ne visas šūnu terapijas [6]. Lai gan tīklenes pigmenta epitēlija (RPE) šūna ir lokāls šūnu tips, tā nav atbrīvota no atgrūšanas problēmām [7–9]; tādēļ recipientu imūnsupresija pašlaik ir standarta prakse [10,11]. No otras puses, cilvēka RPC, šķiet, ir ļoti labi panesami kā alotransplantāti [6, 12–16], lai gan tas neattiecas uz to izmantošanu kā ksenotransplantātus, kur nepieciešama imūnsupresija [17]. Pamats ilgstošai alogēnu RPC izdzīvošanai acī, visticamāk, ir saistīts ar vairākiem faktoriem, kas saistīti ar izmantotajām šūnām un saņēmēja vietu [1, 8, 18, 19]. Iepriekšējā darbā, izmantojot plūsmas citometriju, mēs esam parādījuši, ka cilvēka neironu priekšteči, gan no smadzenēm, gan no tīklenes, izsaka I klases, bet ne II klases galvenos histocompatibility (MHC) antigēnus [20, 21]. Klasiskais transplantāta atgrūšanas mehānisms ietver svešu MHC II klases molekulu nespecifisku atpazīšanu, ko veic CD4+ saimnieka limfocīti [20–25]. Tādā veidā II klases molekulu trūkums varētu ļaut potētajām cilmes šūnām izvairīties no imūnās atgrūšanas, ko izraisa šis mehānisms. Tomēr šķietamais "imūnās priviliģētās" statuss intravitreāli injicētiem hRPC ne vienmēr ir absolūts. Lai gan peļu centrālās nervu sistēmas (CNS) priekšteči sākotnēji neizpauž nosakāmas I vai II klases MHC molekulas un tiem piemīt acīmredzamas imūnās privilēģijas kā alotransplantāti [1, 2, 20], noteiktos apstākļos šīm šūnām var tikt veikta imūnā atgrūšana. Pētījumi liecina, ka MHC antigēnus var inducēt, stimulējot CNS priekštečus ar gamma interferonu (IFN) [1,26]. CNS priekštečus var noraidīt pēc iepriekš potēta saimniekorganisma sensibilizācijas. Tāpēc CNS cilmes šūnas (tostarp RPC) ekspresē alloantigēnus, ko nosaka saimnieka imūnsistēma. Kopā tas nozīmē, ka uzpotēto cilmes šūnu imūnās priviliģētais statuss ir provizorisks un ir pakļauts modulācijai, piemēram, citokīniem, kas atrodas vietējā mikrovidē un kas var mainīties deģenerāciju, piemēram, RP, laikā. Visu šo iemeslu dēļ imūnreakciju uz vairākām intravitreālām RPC injekcijām ir grūti paredzēt, un tā ir īpaši jāpārbauda.

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

Ja RPC ārstēšana izrādīsies klīniski veiksmīga RP gadījumā, būs spēcīgi stimuli abu acu ārstēšanai šīs divpusējās aklās slimības gadījumā. Vismaz drošības apsvērumu dēļ binokulārās procedūras parasti veic secīgi ar ievērojamu nobīdi starp abām injekcijām. Jāatzīmē, ka šī secīgā alogēnu šūnu piegāde var izraisīt saimniekorganisma sensibilizāciju, reaģējot uz pirmo injekciju, potenciāli izraisot imūnās atgrūšanas reakciju, reaģējot uz otro injekciju. Tas var izraisīt transplantātu zudumu abās acīs. Iepriekšējie ziņojumi, kuros tika pētīta viena subretināla hRPC dozēšana RP [27] vai atkārtota dozēšana ar cilvēka neironu priekštečiem dzīvniekiem [28, 29], ietvēra imūnsupresiju. Tāpēc šāds pētījums tika izstrādāts kā peles RPC kā secīgu alotransplantātu translācijas izpēte imūnkompetentā peles celmā ar atšķirīgu ģenētisko fonu. Lai gan neietverot cilvēku RPC produktus, šis darbs tika veikts kā daļa no IND veicinošiem pētījumiem, lai sniegtu datus par dzīvniekiem par drošību, ti, vai imūnsupresija būtu nepieciešama pacientiem, kuri FDA reģistrētos pētījumos saņem atkārtotu RPC allotransplantāta ārstēšanu.

2. Rezultāti

Lai izpētītu divpusējas RPC injekcijas imunoloģiskās sekas alogēnām pelēm, gmRPC (C57BL/6 ģenētiskais fons) intravitreāli tika injicēts vienā BALB/c saņēmēju acī un otrā RPC deva tika injicēta otrā acī 2 nedēļas vēlāk. 2-Nedēļas laika intervāls tika izvēlēts tā, lai būtu pietiekams, lai pirmais transplantāts varētu izraisīt gan iedzimtas, gan adaptīvas imūnās atbildes. Neviens no eksperimentālajiem dzīvniekiem nesaņēma nekādas imūnsupresīvas zāles, lai varētu novērot dabiskās fizioloģiskās imūnās atbildes.

2.1.Klīniskā novērošana un oftalmoloģiskā izmeklēšana neatklāja nekādas novirzes

Eksperimentālo dzīvnieku svars tika mērīts katras gmRPC injekcijas laikā. Visi eksperimentālie dzīvnieki uzrādīja svara pieaugumu starp pirmo un otro injekciju, kas atbilst vispārējai labai veselībai. Dzīvnieki, kas tika pārtraukti 14. un 28. dienā ± 1 pēc otrās gmRPC injekcijas, tika pārbaudīti ar ķirurģisko mikroskopu. Lielākajai daļai pārbaudīto acu gan priekšējie, gan aizmugurējie segmenti tika uzskatīti par "normālās robežās" (WNL). Neārstētās, fiktīvi ārstētās un ar gmRPC ārstētās grupās nebija iekaisuma pazīmju vai citu redzamu anomāliju, kas norāda, ka gmRPC intravitreāla injekcija neizraisīja nelikumīgas iekaisuma reakcijas vai fiziskus audu bojājumus, kas bija nosakāmi, izmantojot šo metodi. Šūnu kopas, kas satur transplantātu, bija redzamas stiklveida ķermenī gan 14., gan 28. ± 1. dienā pēc otrās gmRPC injekcijas (1. attēls). Atkārtota gmRPC injekcija neizraisīja ievērojamas izmaiņas šūnu klasteru izmērā, kas atbilst ilgstošai donoru šūnu izdzīvošanai. Galējā beigu punktā tika novērtēta arī rupja patoloģija, un netika konstatēti palielināti acs āboli (kas liecina par audzēja veidošanos) vai citas novirzes.

1. attēls. Pārstādītie gmRPC, kas vizualizēti in vivo, fotografējot acu dibenu, izmantojot ķirurģisko mikroskopu (visas=kreisā acs, OS). (A, B), fiktīvi ārstēti dzīvnieki (fiktīvi apstrādāti/fiktīvi, S/S); (C, D), kontroles dzīvnieki ar viltus labo aci, kam sekoja gmRPC apstrādāta kreisā acs (fiktīvais/šūna, S/C), un dzīvnieki ar abām acīm, kas secīgi apstrādāti ar gmRPC (šūna/šūna, C/C). novērots un attēlots caur ķirurģisko mikroskopu. Augšējā panelī (A, C, E) ir redzami OS attēli, kas uzņemti 14. dienā pēc sekundes injekcijas; apakšējā panelī (B, D, F) ir redzami OS attēli, kas uzņemti 28. dienā pēc sekundes injekcijas. Allotransplantāti tika novēroti kā gaišas krāsas šūnu kopas (bultiņas), kas bija redzamas ar šūnām ievadītās kreisās acs stiklveida ķermenī (S/C, C/C) abos laika punktos (14. diena: (C, D); un 28. diena: () E, F)). Izņemot transplantātus, priekšējā un aizmugurējā segmentā nebija acīmredzama iekaisuma vai papildu anomālijas, skatoties šādā veidā aksiāli.

2.2. Imunofluorescējošais marķējums parādīja imūnās šūnas stiklveida ķermenī

Imunofluorescējoša marķēšana pieciem galvenajiem imūno šūnu tipiem (makrofāgiem, neitrofiliem, dabiskām slepkavām šūnām, T šūnām un B šūnām) tika veikta acs krio sekcijās un atklāja pozitīvu imūno šūnu infiltrāciju acī pēc gmRPC injekcijas (2.A–F attēls). T šūnu (CD3), B šūnu (CD45R), neitrofilu (Ly-6G) un dabisko slepkavu šūnu (CD49b) klātbūtne acīs, kas injicēta ar gmRPC, bija ierobežota, turpretim aktivētie makrofāgi (Iba-1 ) bija galvenās imūnās šūnas, kas reaģēja uz intravitreālajiem transplantātiem. Salīdzināmi audi no neapstrādātiem un fiktīvi ārstētiem dzīvniekiem neuzrādīja imūnās šūnas acu kriozēšanā, kas liecina, ka novērotā imūnšūnu infiltrācija bija reakcija uz gmRPC transplantātiem. Saskaņā ar šo novērojumu imūnās šūnas atradās apgabalā, kas ieskauj gmRPC transplantātus, vai pašās gmRPC klasteros.

2. attēls. Infiltrēto imūnšūnu imūnmarķēšana pa apstrādes grupām. Imunofluorescējoši attēli (A) kontroles sekcijām (tikai sekundārā antiviela), (B) anti-Iba-1 (aktivēts makrofāgu un mikroglia marķieris), (C) anti-Ly-6G (neitrofilu marķieris), (D) anti-CD49b (dabisks killer šūnu marķieris), (E) antivielas pret CD3 (T šūnu marķieris) un (F) anti-CD45R (B šūnu marķieris) ir parādītas attēlā. Ierobežotie sarkanie signāli norāda uz pozitīvu antivielu marķējumu leikocītu marķieriem, zaļie signāli norāda uz gmRPC transplantātiem un zilie signāli norāda uz DAPI kodola marķējumu. Dzeltenā krāsa ir nespecifiska signālu pārklāšanās, kas ir visredzamākā fotoreceptoru ārējos segmentos, kuriem ir autofluorescence. Ārstēšanas grupas: neārstētas (UT), abas acis neārstētas; S/S, abas acis fiktīvi apstrādātas (secīgi) ar nesēju; S/C, labajā acī injicēts nesējs, kam seko kreisā acs ar 50,000 gmRPC un; C/C, abās acīs injicēts 50,{16}} gmRPC (secīgi) saskaņā ar grafiku 4. sadaļā

Katras imūnās šūnas maksimālais skaits acī mainījās atkarībā no šūnu veida (3.A–E attēls). Turpretim divvirzienu ANOVA neatklāja nekādas atšķirības imūno šūnu infiltrācijā, salīdzinot dzīvniekus, kuri saņēma vienas gmRPC injekcijas (fiktīvas/šūnas) ar tiem, kas saņēma divpusējas injekcijas (šūnas/šūnas). Tas attiecās uz makrofāgu infiltrāciju (anti-Iba-1 krāsojums) (3.A attēls), neitrofilu (anti-Ly-6G krāsojums) (3.B attēls), dabisko killer šūnu (CD49b krāsojums) ( 3.C attēls), T šūnas (krāsošana ar CD3) (3.D attēls) un B šūnas (krāsošana ar CD45R) (3.E attēls).

2.3. ELISPOT neuzrādīja antigēnu atsaukšanas atbildes

ELISPOT ir veids, kā pārbaudīt antigēnam specifisku IFN, kas ražo T šūnu aktivāciju. Ārstēšana ar forbola 12-miristāta 13-acetātu (PMA) bija pozitīva kontrole, kas atdarina otro vēstnesi DAG, lai aktivizētu T šūnu receptoru ceļu un, savukārt, izraisītu T šūnu aktivāciju. 4.A–D attēlā ar PMA ārstētajām grupām bija daudz lielāks IFN plankumu skaits, salīdzinot ar kontroles grupām, kurās bija tikai reaģējošās šūnas (ti, limfocīti no CLN, splenocīti no liesām). Kad reaģējošās šūnas tika kultivētas kopā ar C57BL/6 splenocītiem (B6 SPL), 14. dienas paraugi bija salīdzināmi ar tikai reaģējošo šūnu grupām, tikai ar nedaudz lielāku IFN plankumu skaitu, kas liecina par T šūnu aktivācijas trūkumu (4.A attēls, B).

3. attēls. Imūnās šūnu infiltrācijas kvantitatīvā noteikšana pēc gmRPC transplantācijas. Infiltrētās imūnās šūnas tika vizualizētas kā sarkani fluorescējoši signāli attēlveidošanas laukā pēc gmRPC injekcijas katram eksperimentālajam stāvoklim, skaitītas, izmantojot ImageJ, un attēlotas joslu diagrammās. Dati no Iba-1 (aktivētais makrofāgu un mikrogliju marķieris) (A), anti-Ly-6G (neitrofilu marķieris) (B), anti-CD49b (dabisko killer šūnu marķieris) (C), antivielām anti-CD3 (T šūnu marķieris) (D) un anti-CD45R (B šūnu marķieris) (E) tika parādīti attēlā. Divvirzienu ANOVA testi tika izmantoti, lai pārbaudītu nozīmību starp viltus/šūnu un šūnu/šūnu grupām; p vērtības bija: (A) p < {{10}}.4492, (B) p < 0.9376, (C) p < 0.119{{18 }}, (D) p < 0,6411 un (E) p < 0,7201 (neviens nebija nozīmīgs).

Pārbaudot alogēnu donoru šūnas, izmantojot šo testu, reaģējošām šūnām no dzīvniekiem, kuriem intraperitoneāli injicēti gmRPC (IP grupa), nebija antigēna atsaukšanas atbildes reakcijas, jo paraugos neuzrādīja lielāku T šūnu aktivāciju ar IFN plankumu skaitu, salīdzinot ar viltus dzīvniekiem, kuri nekad netika pakļauti iedarbībai. uz gmRPC (viltus/viltus). Arī dzīvnieki, kuriem gmRPC tika injicēti intravitreāli, ne vienreiz (viltīgi/šūna), ne atkārtoti (šūna/šūna), neuzrādīja nekādas antigēna atsaukšanas reakcijas. Vienā gadījumā atbildes reakcija uz atkārtotu gmRPC dozēšanu šķita klusāka (4.B attēls). Kopā šie rezultāti liecināja, ka gmRPC ir ļoti zema antigenitāte. Ņemiet vērā, ka C57BL / 6 splenocīti tika saskaņoti ar gmRPC ģenētisko fonu. Negaidīti alternatīvās stimulatora šūnas, gmRPC, palielināja IFN plankumu skaitu visās eksperimentālajās grupās, salīdzinot ar negatīvās kontroles grupām (4.A–D attēls). Iespējamais izskaidrojums varētu būt gmRPC, kas šajā testā rada augstu fonu. Svarīgi, ka nebija atšķirības starp neapstrādātām, fiktīvi apstrādātām, vienu gmRPC injekciju un atkārtotām gmRPC injekciju grupām, kas atkal norādīja uz antigēna atsaukšanas reakciju neesamību.

4. attēls. ELISPOT kvantitatīvā noteikšana pēc gmRPC transplantācijas. ELISPOT testi tika iestatīti šādās grupās: kontroles, atbildes šūnas atsevišķi (limfocīti vai splenocīti, kas satur T šūnas, kas izolētas no eksperimentālo dzīvnieku dzemdes kakla limfmezgliem (CLN) vai liesas (SPL); PMA, reaģējošās šūnas, kas apstrādātas ar forbolu {{1} }miristāta 13-acetāts (PMA) un Ca jonofors; B6 SPL, reaģējošās šūnas, kas sajauktas ar splenocītiem, kas izolēti no C57BL/6 dzīvniekiem; gmRPC, tās pašas reaģējošās šūnas, kas sajauktas ar gmRPC. (A), reaģējošās šūnas bija splenocīti no eksperimentālajiem dzīvniekiem, kas tika nonāvēti 14. dienā pēc otrās gmRPC injekcijas. (B) Reaģējošās šūnas bija limfocīti no eksperimentālo dzīvnieku CLN, kas tika nogalināti 14. dienā pēc otrās gmRPC injekcijas. (C) Reaģējošās šūnas bija splenocīti no eksperimentālajiem dzīvniekiem, kas tika nogalināti 29. dienā pēc otrās gmRPC injekcijas. (D) Reaģējošās šūnas bija limfocīti no eksperimentālo dzīvnieku CLN, kas tika nogalināti 29. dienā pēc otrās gmRPC injekcijas. Divvirzienu ANOVA testi tika izmantoti, lai pārbaudītu nozīmīgumu (*) starp viltus/šūnu un šūnu/šūnu grupām; p vērtības bija: (A) p < 0.5332, (B) p < 0.0001 (nozīmīgs), (C) p < 0,0207 ( nozīmīgs), un (D) p < 0,3355.

3. Diskusija 

Ir bijusi liela interese par cilmes šūnu tehnoloģiju kā līdzekli tīklenes deģeneratīvu slimību ārstēšanai, un mūsu grupa ir pētījusi alogēnu hRPC izmantošanu RP. Lai apkopotu datus par iespējamām imūnsistēmas sekām, ja vairāk nekā viena alogēna cilvēka RPC produkta deva tiek ievadīta ar intravitreālu injekciju, mēs veicām šo pētījumu ar dzīvniekiem, izmantojot gmRPC no C57BL/6 fona kā transplantātus un BALB/c peles kā saimniekus. Šīs atšķirīgās ģenētiskās izcelsmes tika izmantotas, lai modelētu secīgu ārstēšanu ar alogēniem hRPC un sniegtu provizoriskus drošības datus pirms testēšanas ar cilvēkiem.

Lai pilnībā novērtētu atbildes, saimniekdzīvnieki nesaņēma nekādu imūnsupresīvu ārstēšanu. Mēs salīdzinājām imūnās atbildes, ko radīja viena gmRPC injekcija, ar secīgu divpusēju devu saskaņā ar aprakstīto injekciju grafiku. Oftalmoloģiskie izmeklējumi neatklāja iekaisumu vai citas ievērojamas atšķirības starp dzīvnieku grupām, kas saņēma 1 gmRPC devu vai 2 gmRPC devas, kas liecina, ka vai nu saņēmēji nebija jutīgi pret sākotnējo gmRPC ārstēšanu, vai arī sensibilizācija bija smalka. Imunomarķēšanas rezultāti atklāja, ka visi pieci pārbaudītie imūno šūnu veidi, proti, T šūnas (CD3), B šūnas (CD45R), makrofāgi (Iba-1), neitrofīli (Ly-6G) un dabiskās slepkavas šūnas ( CD49b), bija iefiltrējies acī un bija mērķēts uz RPC transplantātiem pēc transplantācijas. Tomēr šī infiltrācija bija salīdzinoši mērena, un, lai gan bija nosakāmi citi šūnu veidi, tā galvenokārt sastāvēja no Iba-1 pozitīviem makrofāgiem. Bija ļoti ierobežots skaits T šūnu, B šūnu, neitrofilu un dabisko killer šūnu. Interesanti, ka izdzīvošana, ko uzrādīja atsevišķi un atkārtoti RPC potzari, bija līdzvērtīga, abos gadījumos nezaudējot transplantātus, neskatoties uz makrofāgu klātbūtni. Kopumā tas liecina, ka gan iedzimtas, gan adaptīvās imūnās atbildes reakcijas uz ģenētiski atšķirīgiem RPC bija mērenas, lai gan imūnsupresija netika izmantota. Turklāt ELISPOT testa rezultāti neuzrādīja antigēnu atsaukšanas atbildes reakcijas ar gmRPC ārstētām grupām, kas atbilst apgalvojumam, ka T šūnām nav svarīgas lomas gmRPC transplantātu noraidīšanā no C57BL/6 pelēm. Atkal tika novērota makrofāgu infiltrācija gmRPC transplantātos, lai gan tas nebija saistīts ar nozīmīgu transplantāta iznīcināšanu, kas saistīts ar klasisko imūno atgrūšanu [22–24].

cistanche priekšrocības vīriešiem - stiprina imūnsistēmu

Kopā šie novērojumi atklāj situāciju, kas skaidri atšķiras no plaši atzītajiem T un B šūnu mediētajiem alogēnās transplantāta atgrūšanas mehānismiem, kas novēroti citos audos. Šo situāciju var veicināt vairāki faktori. No vienas puses, pastāv jēdziens par aci kā "imūnu priviliģētu" vietu, lai gan tas, cik lielā mērā stiklveida ķermenim ir līdzīgas īpašības ar radzeni un tīkleni, ir mazāk pētīts un, iespējams, vairāk strīdīgs. No otras puses, šķiet, ka pašiem RPC ir samazināta imunogenitāte kā alotransplantāti, salīdzinot ar biežāk pētītajiem šūnu tipiem. Kā mēs esam parādījuši iepriekš, peļu RPC trūkst MHC I un II klases antigēnu sākotnējās ekspresijas, lai gan tie ir inducējami ar citokīnu stimulāciju. Šis MHC ekspresijas trūkums var veicināt šo šūnu izdzīvošanu pēc transplantācijas. Tomēr imūnšūnu klātbūtne transplantātos atbalsta koncepciju, ka transplantāta tolerance šajā vidē nav pasīva un izriet no aktīvas imūnregulācijas parādības. Šeit jāuzsver, ka tāda paša veida imūnšūnu infiltrācija jau bija pēc vienreizējām injekcijām un to nepastiprināja atkārtota dozēšana, tādējādi pasvītrojot mūsu secinājumu, ka transplantātu imūnšūnu infiltrācija, jo īpaši ar makrofāgiem, nebija iepriekšējas iedarbības rezultāts. saimnieka sensibilizācija. Saskaņā ar šī eksperimenta parametriem atkārtota dozēšana nemazināja transplantāta kopējo dzīvotspēju, kas atbilda ilgstošas ​​​​efektivitātes iespējai terapeitiskā kontekstā. Alternatīvi parametri, piemēram, dažādi starpinjekciju intervāli, var palielināt vai samazināt imūno šūnu aktivitāti tādā mērā, kas būtu nozīmīgs klīniskai lietošanai. Nav skaidrs, vai infiltrātu šūnu sastāvdaļas, tostarp makrofāgu pārsvars, attiektos arī uz cilvēkiem. Turklāt šo alotransplantātu izdzīvošana var nebūt atkarīga no normālas tīklenes ar veselīgu asins-tīklenes barjeru. Šeit izmantotie BALB/c saņēmēji ir albīni un ir jutīgi pret gaismas bojājumiem [30]. Turklāt ilgstoša izdzīvošana ir vairākkārt novērota iepriekšējā darbā ar dažādiem tīklenes deģenerācijas modeļiem (piemēram, [31]).

Salīdzinot ar transplantāta izdzīvošanu, šūnu dzīvotspēja transplantātos rada sarežģītāku situāciju. Ir zināms CNS cilmes šūnu zudums, kas notiek ātri pēc transplantācijas, iespējams, vairāku faktoru dēļ, tostarp pēkšņa augšanas faktora izņemšana. Kad nogulsnējas acī, disociētās šūnas saplūst sfēriski līdzīgos agregātos, kuru centri, šķiet, nodrošina augšanai neoptimālu mikrovidi, iespējams, vaskularizācijas trūkuma un barības vielu difūzijas problēmu dēļ. Acīmredzamais makrofāgu tropisms RPC potzariem varētu būt nespecifiska reakcija uz šo dzīvotnespējīgo šūnu klātbūtni transplantātu iekšpusē, makrofāgiem darbojoties kā šūnu atlieku savācējiem. Alternatīvi, pilnībā dzīvotspējīgi RPC var aktīvi piesaistīt makrofāgus, piemēram, ar ķīmiski pievilcīgu citokīnu ekspresiju, kā rezultātā saimniekšūnas sekundāri saskartos ar nedzīvām donoru šūnām. Svarīgi ir tas, ka makrofāgu infiltrācijas pakāpei, kas novērota šajos konkrētajos apstākļos, nav negatīvas ietekmes uz transplantātu vai saimnieka tīkleni, atšķirībā no reakcijām uz šūnu allotransplantātiem priviliģētās vietās, kas nav imūnas [4]. Visbeidzot, ir vērts pieminēt, ka šeit sniegtie rezultāti, lai gan tie attiecas tikai uz peles modeli, var ietekmēt darbu ar cilvēkiem. Atšķirībā no peles, mēs zinām, ka kultivētas cilvēka RPC sākotnēji izsaka spēcīgu MHC I klases antigēnu līmeni; tāpēc salīdzinājums, protams, ir provizorisks. Tomēr ir interesanti atzīmēt, ka subretinālo hRPC transplantātu klīniskā pārbaude, ko veica grupa Ķīnā [13], kā arī mūsu grupas veikta intravitreāla hRPC transplantācija, pēc tam parādīja ilgstošu alotransplantātu izdzīvošanu pacientiem ar imūnsupresiju (JC). -01, [32], nepublicēti dati). Tas notika arī pēc secīgas injekcijas abās acīs (JC-01 paplašinājums, nepublicēti dati), līdzīgi kā šeit aprakstīts. Turklāt transplantāta izdzīvošana tika novērota pēcpārbaudes pētījumā par JC-02 [33], kurā vienai un tai pašai acij tika ievadītas secīgas atkārtotas devas [34]. Kopumā šie atklājumi norāda, ka imūnsistēmas nomākšana ne vienmēr ir nepieciešama neironu priekšteču transplantācijas gadījumā, jo īpaši acī, lai gan šīs parādības robežas un pamatā esošie regulējošie mehānismi vēl nav noskaidroti.

4. Materiāli un metodes

4.1. Šūnu kultūra

Iepriekš raksturotie gmRPC [31] tika izvēlēti kā donoru šūnas šim alogēnajam pētījumam. Sākotnēji gmRPC tika izolēti no GFP transgēnām C57BL/6 pelēm, kas ģenētiski modificētas, lai izteiktu pastiprinātu zaļo fluorescējošo proteīnu (GFP). GFP proteīna ekspresija gmRPC bija interesanta, jo tā ļauj vizualizēt transplantātus pēc injekcijas bez papildu marķēšanas. Pašreizējā pētījumā gmRPC tika kultivēti Advanced DMEM/F12, kas papildināts ar N-2 papildinājumu (1:100, Life Technology, Carlsbad, CA, ASV), Glutamax-1 (1:100, Life Technology). , Karlsbāda, Kalifornija, ASV) un EGF (20 ng/ml, rekombinants, Human, Life Technologies, Karlsbāda, Kalifornija, ASV) un inkubēja 37 ◦C un 5% CO2. Šūnas tika turētas jauktā suspensijā / brīvi pievienotās kolonijās nepārklātās audu kultūras kolbās. Šūnas tika pasētas, izmantojot tripsīnu ar TrypLE Select CTS (Life Technologies, Carlsbad, CA, ASV), kas vienu minūti atšķaidīta 1:5 PBS un neitralizēta ar 10 reizēm lielāku pievienotā tripsīna tilpumu. Šūnu-tripsīna maisījumu centrifugēja ar ātrumu 140 g 2 minūtes istabas temperatūrā, noņem supernatantu un šūnu granulu atkārtoti suspendēja svaigā barotnē pirms iesēšanas audu kultūras kolbās vēlamajā koncentrācijā. Šūnu koncentrācija un dzīvotspēja tika noteikta ar tripānzilo krāsošanu; skaitīšanu veica Countess (Life Technologies, Carlsbad, CA, ASV) un hemocitometru.

Intravitreālām injekcijām šūnu granulas tika atkārtoti suspendētas BSS PLUS® ar ātrumu 50K šūnas/µL. Šūnu koncentrācija un dzīvotspēja tika novērtēta pirms un pēc injekcijām. Injicētā deva bija 50,000 šūnas vienā acī vienā injekcijā. Deva un nesējs tika izvēlēti, pamatojoties uz mūsu iepriekšējiem pētījumiem.

4.2. Eksperimentālie dzīvnieki

Pašreizējā pētījuma mērķis bija izpētīt iespējamās alogēnās imūnās atbildes, ko izraisa atkārtota alogēnu RPC intravitreāla injekcija. Saņēmēji dzīvnieki bija BALB/c peles, kas ģenētiski atšķiras no C57BL/6 pelēm, no kurām tika izolēti gmRPC. Tika uzskatīts, ka katrā apstrādātajā eksperimentālajā grupā katrā laika posmā ir jāizmanto vismaz trīs dzīvnieki, lai varētu novērtēt statistisko nozīmīgumu starp grupām attiecībā uz iznākuma mainīgajiem lielumiem un iespējamiem dzīvnieku zaudējumiem eksperimenta periodā. Turklāt, ņemot vērā daudzos papildu faktorus, kas potenciāli ietekmē eksperimenta iznākumu, piemēram, neveiksmīgu šūnu injekcijas procedūru vai iespējamu nodilumu dzīvnieku cīņas rezultātā, injekcijas procedūras tika veiktas pieciem dzīvniekiem katrā grupā, lai vēl vairāk nodrošinātu statistiskai analīzei nepieciešamo minimālo skaitu.

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

1. tabulā parādītas četras dzīvnieku grupas, kas sagatavotas katram no četriem laika punktiem (4, 7, 14 un 28 dienas), kuros jāveic histopatoloģijas novērtējumi, tostarp imunofluorescence. Divas papildu dzīvnieku grupas, kurām intraperitoneāli injicēja 10ˆ6 gmRPC, tika sagatavotas kā pozitīvas kontroles katram no diviem ELISPOT novērtēšanas laika punktiem (14 un 28 dienas). 2. tabulā ir apkopoti katrai grupai paredzētie novērtējumi.

1. tabula. Eksperimentālās grupas.

2. tabula. Novērtēšanas laika punkti.

4.3. Intravitreāla injekcija

GmRPC tika ievadīti, izmantojot intravitreālu injekciju. Pēc anestēzijas abām injicējamā dzīvnieka acīm tika uzklāts Mydriacyl (1% tropikamīda oftalmoloģiskais šķīdums) un fenilefrīns (2,5% oftalmoloģiskais šķīdums). Kad tika sasniegta atbilstoša midriāze, dzīvnieks tika manuāli savaldīts un dzīvnieka galva pagriezta, lai saskaņotu injicējamās acs acu asi ar ķirurģiskā mikroskopa optiku, lai vizualizētu acs aizmugurējo segmentu (ti, stiklveida ķermeni un tīkleni). . Acs tika viegli ievilkta manuāli, nospiežot uz plakstiņiem, un tika izmantota insulīna šļirces 31G adata, lai viegli caurdurtu sklēru, kas atrodas blakus limbusam apakšējā deguna kvadrantā. Pulēta stikla mikropipetes uzgalis, kas satur donora šūnas (vai transportlīdzekļa kontroli), tika virzīts caur iegriezumu stiklveida ķermeņa dobumā tiešā vizualizācijā. Tika piesardzīgs, lai netiktu traucēta lēcas vai aizmugurējā segmenta struktūru integritāte. Tikai šūnas vai nesēji tika injicēti 1 mikrolitra tilpumā. Pēc vairākiem pauzes mirkļiem, lai ļautu līdzsvarot intraokulāro spiedienu, pipetes gals pakāpeniski tika noņemts no acs, un tas viss tika tieši vizualizēts. Tika atzīmēta jebkura intraokulāra asiņošana, kā arī atrašanās vieta. Pēc injekcijas dzīvnieks tika ievietots tīrā būrī, kas izklāts ar svaigu vienreiz lietojamu paliktni, kas orientēts ar absorbējošo pusi uz augšu/plastmasas pusi uz leju, lai atgūtu. Atveseļošanos atviegloja, izmantojot sildīšanas paliktni, un to apstiprināja dzīvnieka spēja staigāt. Pēc pamošanās dzīvnieks tika pārvietots uz pēcoperācijas būru ar ad libitum piekļuvi ūdenim. Dzīvnieki tika vizuāli uzraudzīti katru dienu pēc operācijas. Tika novērotas minimālas pazīmes, kas saistītas ar intraokulāru injekciju, vai tās nav vispār.

Pēc procedūras dzīvniekiem tika novērota operētās acs berzēšana, saburzīta kažokāda vai ilgstoša letarģija, un tas viss bija pamats tūlītējai eitanāzijai. Divi dzīvnieki tika pārtraukti kaujās gūto brūču dēļ. Visi pārējie dzīvnieki tika pārtraukti plānotajos galapunktos. Eitanāzija tika veikta, ieelpojot CO2.

4.4. Oftalmoloģiskā izmeklēšana

A Leica Ultimate Red Reflex Surgical Microscope was used for ophthalmic examination and photography of experimental mice. Sedation was performed with a Ketamine Hydrochloride/Xylazine Hydrochloride mixture (50–100 mg/mL Ketamine, 5–10 mg/mL Xylazine) administered by intraperitoneal injection. After sedation, topical mydriatics (Tropicamide, Phenylephrine) were applied to the eye(s) to be imaged in 5 min intervals until adequate mydriasis was achieved, as determined via pupil diameter (>2,5 mm) un reakcija uz gaismas stimulāciju. Lai kompensētu mirkšķināšanas zudumu, abām acīm pēc vajadzības lokāli uzklāja hipromelozes (Gonak) šķīdumu, lai novērstu radzenes izžūšanu. Attēlveidošanas procedūrai anestēzētie dzīvnieki tika novietoti uz sildīšanas paliktņa un novietoti krūšu kurvja guļus stāvoklī. Procedūras beigās tika panākta daļēja anestēzijas maiņa, ievadot atipamezolu (0,1–1 mg/kg) intraperitoneālas injekcijas veidā.

4.5. Histopatoloģija

Imūnās atbildes reakcijas dzīvniekiem, kas saņēma divus secīgus transplantātus (vienu katrā acī), tika novērtētas, izmantojot abu acu histopatoloģiju 4. dienā, 7. dienā, 14. dienā un 28. ± 1. dienā pēc otrās acs injekcijas. Peles, kas tika ārstētas saskaņā ar 1. tabulu, tika pārtrauktas, pamatojoties uz 2. tabulā norādīto grafiku. Dzīvnieki tika eitanāzēti, izmantojot oglekļa dioksīda inhalāciju. Sirds perfūzijas tika veiktas eksperimentālajiem dzīvniekiem ar 2% paraformaldehīdu (PFA) fosfātu buferšķīdumā (PBS). Pēc tam visi acs āboli tika savākti un ļāva mērcēt 2% PFA / PBS 48 stundas 4 ◦ C temperatūrā. Fiksētie acs āboli tika apstrādāti ar saharozes gradientu (10% saharozes PBS 1 stundu istabas temperatūrā, 20% saharozes PBS 1 stundu istabas temperatūrā un 30% saharozes PBS 4 ◦ C uz nakti) pirms iegulšanas AZT barotne kriosekcijas veikšanai. Acu kriosekcijas (10 µm) tika iekrāsotas ar Harisona hematoksilīnu un eozīnu (H&E), lai vizualizētu tīklenes mikroanatomiju un atrastu injicētās donoru šūnas.

Grupām, kas apstrādātas ar gmRPC, kriosekcijas tika novērtētas, izmantojot imunofluorescenci GFP+ (donoru) šūnām. Specifisko imūno šūnu tipu identificēšana acīs tika veikta, marķējot ar specifiskām primārajām antivielām: CD3 (T limfocītu marķieris) [35], CD45R (B limfocītu marķieris) [36], Iba-1 (aktivizēts makrofāgu un mikroglia marķieris) [37], Ly-6G (neitrofilu marķieris) [38] un CD49b (dabisks killer šūnu marķieris) [39]. Kriosekcijas trīs reizes mazgāja PBS istabas temperatūrā un bloķēja ar 0,03% Triton X-100 un 10% normālu kazas serumu PBS (NGS; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, ASV). 1 h istabas temperatūrā. Žurku pretpeļu CD3 (1:100 atšķaidījums, BD Biosciences, Sanhosē, CA, ASV), žurku pretpeles CD45R (1:100, BD Biosciences, Sanhosē, CA, ASV), trušu pretpeles Iba{{ 26}} (atšķaidījums 1:400, Wako Chemicals, Ričmonda, VA, ASV), žurku pretpelēm Ly-6G (1:100 atšķaidījums, BD Biosciences, Sanhosē, Kalifornija, ASV) un žurku anti -peles CD49b (1:100 atšķaidījums, BD Biosciences, Sanhosē, Kalifornija, ASV) tika uzklāts uz paraugiem un inkubēts nakti 4 grādos. Paraugus atkal mazgāja PBS 3 reizes istabas temperatūrā. Ar Alexa-Fluor konjugētas sekundārās antivielas (kazas anti-žurka Alexa-Flour-568 un kazas anti-trušu Alexa-Flour-568, Life Technologies, Karlsbāda, Kalifornija, ASV) tika uzklātas paraugiem 1 stundu. istabas temperatūrā. Pēc tam visi paraugi tika mazgāti PBS vēl trīs reizes istabas temperatūrā. Pārsegumi tika uzstādīti, izmantojot DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingema, AL, ASV), un priekšmetstikliņus atstāja nožūt nakti istabas temperatūrā.

4.6. ELISPOT un MLR testi

RPC specifiskās atmiņas T šūnas tika uzraudzītas 2 un 4 nedēļas pēc pirmās transplantāta ievietošanas, izmantojot ar enzīmu saistītās imūnsorbcijas vietas (ELISPOT) testu. Eksperimentālās grupas tika izveidotas, kā parādīts 1. un 2. tabulā katram laika punktam. ELISPOT tests uztver izdalītos proteīnus uz specifiskas ar antivielām pārklātas mikroplates, un to var izmantot, lai noteiktu atmiņas T šūnu aktivāciju, nosakot T šūnu IFN sekrēciju. Eksperimentālais rādījums ir IFN plankumu skaits uz mikroplates. Esošo IFN plankumu skaits norāda uz aktivizēto T šūnu skaitu. Alloreaktīvo T šūnu biežums tika novērtēts, veicot 48 h jauktu leikocītu reakciju (MLR) uz 96-iedobes Multiscreen-IP plāksnēm (Millipore, Burlington, MA, ASV). Reaģētājšūnas bija limfocīti/splenocīti, kas satur T šūnas, kas attīrītas no dzemdes kakla limfmezgliem (CLN) un eksperimentālo dzīvnieku liesām, un stimulatora šūnas bija gmRPC, kas sākotnēji iegūtas no C57BL/6 pelēm. ELISPOT testi tika veikti, pamatojoties uz standarta protokolu. 96-iedobes Multiscreen-IP plāksnes tika iepriekš samitrinātas ar 15 µL 35% etanola katrā iedobē sterilos apstākļos. Plāksnes trīs reizes mazgāja ar sterilu PBS, pirms uz plāksnēm uzklāja 100 µL IFN uztveršanas antivielas (klons AN-18, eBioscience, Sandjego, CA, ASV), kas atšķaidīta ar PBS (2 µg/ml). Plāksnes inkubēja nakti 4 grādos, pirms MLR testi tika veikti uz plāksnēm. Ar uztveršanas antivielām pārklātās plāksnes trīs reizes mazgāja ar PBS un pēc tam 2 stundas bloķēja ar RPMI1640 37 ◦C temperatūrā.

Katrā no testa plāksnēm bija šādas kontroles: iedobes, kurās nebija šūnu, iedobes, kurās bija šūnas bez stimulācijas, un iedobes, kurās bija šūnas ar forbola {{0}}miristāta 13-acetātu (PMA). un Ca jonofors kā pozitīvās kontroles. Ārstēšana ar PMA kalpo kā pozitīva kontrole, atdarinot otro vēstnesi DAG, lai aktivizētu T šūnu receptoru ceļu un savukārt izraisītu T šūnu aktivāciju, Ca jonoforam atvieglojot kalcija jonu iekļūšanu šūnās. Pirms krāsas reakcijas plāksnes inkubēja 36 stundas 37 ◦ C temperatūrā. Plāksnes tika mazgātas ar PBS, kas satur {{10}}.01% Tween 20 sešas reizes un pēc tam 100 µL noteikšanas antivielu (klons R64A2, eBioscience, Sandjego, CA, ASV), atšķaidīts. PBS (0,5 µg/ml) tika uzklāts uz katru iedobi. Plāksnes inkubēja 37 ◦C temperatūrā vēl 2 stundas. Plāksnes vēlreiz nomazgāja ar 0,01% Tween 20 PBS. Katrai iedobei tika uzklāts 100 µl Streptavidin-AP (atšķaidījums 1:1000, Invitrogen), un plāksnes inkubēja 45 minūtes istabas temperatūrā. Visas plāksnes vēlreiz trīs reizes mazgāja ar 0, 01% Tween 20 PBS un tikai PBS vēl trīs reizes. Visbeidzot, katrai iedobei krāsošanai pievienoja 100 µL BCIP/NBT (Sigma Aldrich, Minhene, Vācija). Pirms datu analīzes visas plāksnes tika plaši mazgātas ar krāna ūdeni un žāvētas.

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

5. Secinājumi

Šis pētījums parāda, ka secīgi alogēnu RPC binokulāri transplantāti uz stiklveida ķermeņa dobumu neizraisa klasisko imūnās noraidīšanu pelei. Lai gan ir atzīts, ka šos alogēnus histoloģiskos pētījumus nevar veikt ar cilvēka RPC klīnisko produktu, dati šķiet saskanīgi ar klīniskā drošības pētījuma rezultātiem (jCyte, JC-01E, nepublicēti dati), kurā pacienti ar retinītu pigmentosa saņēma vienlaicīgas divpusējas injekcijas bez imūnsupresīvas ārstēšanas. Lai gan ir grūti tieši salīdzināt abus pētījumus, ir vērts atzīmēt, ka abu kopējie rezultāti uzrādīja līdzību allografta izdzīvošanas ziņā.

Atsauces

1. Hori, J.; Ng, TF; Šatoss, M.; Klāsens, H.; Streileins, JW; Jaunām, MJ neironu cilmes šūnām trūkst imunogenitātes un tās pretojas iznīcināšanai kā alotransplantāti. Cilmes šūnas 2003, 21, 405–416. [CrossRef] [PubMed]

2. Klāsens, H.; Švarcs, PH; Ziaeian, B.; Nethercott, H.; Young, MJ; Bragadotira, R.; Tullis, GE; Warfvinge, K.; Narfstrom, K. Neironu prekursori, kas izolēti no jaunattīstības kaķa smadzenēm, parāda tīklenes integrāciju pēc transplantācijas distrofiskā kaķa tīklenē. Veterinārs. Oftalmols. 2007, 10, 245–253. [CrossRef] [PubMed]

3. Salado-Manzano, C.; Perpina, U.; Straccia, M.; Molina-Ruisa, FJ; Koci, E.; Rosers, AE; Canals, JM Vai imunoloģiskā reakcija ir šķērslis šūnu terapijai neirodeģeneratīvo slimību gadījumā? Priekšpuse. Šūnu neiroķi. 2020, 14, 250. [CrossRef]

4. Petrus-Reurers, S.; Romāno, M.; Houleta, S.; Džounss, JL; Lombardi, G.; Saeb-Parsy, K. Imunoloģiskie apsvērumi un izaicinājumi atjaunojošai šūnu terapijai. Commun. Biol. 2021, 4, 798. [CrossRef]

5. Buhers, K.; Rodrigess-Bokanegra, E.; Dauļetbekovs, D.; Fišers, MD Imūnās atbildes reakcijas uz tīklenes gēnu terapiju, neizmantojot saistītus vīrusu vektorus - ietekme uz ārstēšanas panākumiem un drošību. Prog. Retin. Eye Res. 2021, 83, 100915. [CrossRef]

6. Singh, MS; Parks, SS; Albīni, TA; Canto-Soler, MV; Klāsens, H.; MacLaren, RE; Takahaši, M.; Nagiels, A.; Švarcs, SD; Bharti, K. Tīklenes cilmes šūnu transplantācija: drošības un potenciāla līdzsvarošana. Prog. Retin. Eye Res. 2020, 75, 100779. [CrossRef]

7. Kamao, H.; Mandai, M.; Okamoto, S.; Sakai, N.; Suga, A.; Sugita, S.; Kirju, Dž.; Takahashi, M. Cilvēka izraisītu pluripotentu cilmes šūnu tīklenes pigmenta epitēlija šūnu lokšņu raksturojums, kuru mērķis ir klīnisks pielietojums. Stem Cell Rep. 2014, 2, 205–218. [CrossRef]

8. Sugita, S.; Kamao, H.; Iwasaki, Y.; Okamoto, S.; Hašiguči, T.; Iseki, K.; Hajaši, N.; Mandai, M.; Takahashi, M. T-šūnu aktivācijas inhibīcija ar tīklenes pigmenta epitēlija šūnām, kas iegūtas no inducētām pluripotentām cilmes šūnām. Izpētīt. Oftalmols. Vis. Sci. 2015, 56, 1051–1062. [CrossRef]

9. Makgils, TJ; Stoddard, J.; Renner, LM; Messaoudi, I.; Bharti, K.; Mitalipovs, S.; Lauers, A.; Vilsons, dīdžejs; Neuringer, M. Allogeneic iPSC atvasināta RPE šūnu transplantāta neveiksme pēc transplantācijas subretinālajā telpā primātiem, kas nav cilvēkveidīgie primāti. Izpētīt. Oftalmols. Vis. Sci. 2018, 59, 1374–1383. [CrossRef]

10. Sugita, S.; Mandai, M.; Kamao, H.; Takahashi, M. RPE šūnu transplantācijas imunoloģiskie aspekti. Prog. Retin. Eye Res. 2021, 84, 100950. [CrossRef]

11. Nair, DSR; Thomas, BB uz cilmes šūnām balstītas ārstēšanas stratēģijas tīklenes deģeneratīvām slimībām. Curr. Stem Cell Res. Tur. 2022, 17, 214–225. [CrossRef] [PubMed]

12. Martiness Velaskess, LA; Ballios, BG. Nākamās paaudzes molekulārā un šūnu terapija iedzimtām tīklenes slimībām. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11542. [CrossRef]

13. Liu, Y.; Čens, SJ; Li, SY; Qu, LH; Meng, XH; Van, Y.; Xu, HW; Liang, ZQ; Yin, ZQ Cilvēka tīklenes cilmes šūnu transplantācijas ilgtermiņa drošība pigmentozes retinīta pacientiem. Stem Cell Res. Tur. 2017, 8., 209. [CrossRef] [PubMed]

14. Van, Y.; Tangs, Z.; Gu, P. Stem / cilmes šūnu balstīta transplantācija tīklenes deģenerācijai: klīnisko pētījumu pārskats. Šūnu nāve Dis. 2020, 11, 793. [CrossRef] [PubMed]

15. Vācu valoda, OL; Vallese-Maurizi, H.; Soto, TB; Rotšteins, NP; Politi, LE Retina cilmes šūnas, cerības un šķēršļi. World J. Stem Cells 2021, 13, 1446–1479. [CrossRef]

16. Karamali, F.; Behtajs, S.; Babei-Abraki, S.; Hadady, H.; Atefi, A.; Savojs, S.; Sorušzadehs, S.; Najafians, S.; Nasr Esfahani, MH; Klassen, H. Potenciālās terapeitiskās stratēģijas fotoreceptoru deģenerācijai: ceļš uz redzes atjaunošanu. J. Tulk. Med. 2022, 20, 572. [CrossRef]

17. Semo, M.; Haamedi, N.; Stevanato, L.; Kārters, D.; Brūka, G.; Jangs, M.; Coffey, P.; Sinden, J.; Patels, S.; Vugler, A. Cilvēka tīklenes cilmes šūnu efektivitāte un drošība. Tulk. Vis. Sci. Tehn. 2016, 5., 6. [CrossRef]

18. Močizuki, M.; Sugita, S.; Kamoi, K. Acs imunoloģiskā homeostāze. Prog. Retin. Eye Res. 2013, 33, 10.–27. [CrossRef]

19. Jamasaki, S.; Sugita, S.; Horiuči, M.; Masuda, T.; Fudži, S.; Makabe, K.; Kavasaki, A.; Hajaši, T.; Kuvahara, A.; Kišino, A.; un citi. No cilvēka ESC un iPSC iegūto tīklenes zema imunogenitāte un imūnsupresīvās īpašības. Stem Cell Rep. 2021, 16, 851–867. [CrossRef]

20. Klāsens, H.; Švarcs, MR; Beilija, AH; Jauni, MJ virsmas marķieri, ko ekspresē multipotentas cilvēka un peles neironu cilmes šūnas, ietver tetraspanīnus un ne-proteīnu epitopus. Neirosci. Lett. 2001, 312, 180–182. [CrossRef]

21. Klāsens, H.; Ziaeian, B.; Kirovs, II; Young, MJ; Schwartz, PH Tīklenes cilmes šūnu izolēšana no pēcnāves cilvēka audiem un salīdzinājums ar autologiem smadzeņu priekštečiem. J. Neurosci. Res. 2004, 77, 334–343. [CrossRef]

22. Ingulli, E. Šūnu atgrūšanas mehānisms transplantācijā. Pediatr. Nefrols. 2010, 25, 61–74. [CrossRef]

23. Isa, F.; Šopu, A.; Wood, KJ T šūnu loma transplantāta atgrūšanā un transplantācijas tolerancē. Eksperts Rev. Clin. Immunol. 2010, 6, 155–169. [CrossRef] [PubMed]

24. Nasrs, M.; Zigdels, T.; Sarwal, M. Sasniegumi transplantāta atgrūšanas diagnostikā. Eksperts pr. Mol. Diagnoze. 2016, 16, 1121–1132. [CrossRef] [PubMed]

25. Klāsens, H.; Imfelds, KL; Rejs, Dž.; Young, MJ; Geidžs, FH; Berman, MA Pieaugušo hipokampu cilmes šūnu imunoloģiskās īpašības. Vis. Res. 2003, 43, 947–956. [CrossRef] [PubMed]

26. Veingers, Dž. G.; Veists, BM; Pīts, WC; Klauss, SM; Volšs, CM; Lane, TE MHC neatbilstība izraisa neironu cilmes šūnu atgrūšanu pēc muguras smadzeņu transplantācijas vīrusu izraisītas demielinizācijas modelī. Cilmes šūnas 2012, 30, 2584–2595. [CrossRef] [PubMed]

27. ReNeuron, L. First-in-human Phase I/IIa, Open-label, perspektīvais pētījums par subretināli transplantētu cilvēka tīklenes cilmes šūnu (hRPC) drošību un panesamību pacientiem ar pigmentēto retinītu (RP). Klīniskais izmēģinājums Nr. NCT02464436. Pieejams tiešsaistē: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02464436 (aplūkots 2023. gada 27. februārī).

28. Lū, B.; Lin, Y.; Tsai, Y.; Ģirmanis, S.; Adamus, G.; Džounss, MK; Šellija, B.; Svendsens, CN; Vangs, S. Sekojoša cilvēka neironu priekšteču transplantācija deģenerētā tīklenē neapdraud sākotnējo transplantāta izdzīvošanu vai terapeitisko efektivitāti. Tulk. Vis. Sci. Tehn. 2015, 4, 7. [CrossRef] [PubMed]

29. Džounss, MK; Lu, B.; Ģirmanis, S.; Wang, S. Uz šūnām balstītas terapeitiskās stratēģijas aizstāšanai un saglabāšanai tīklenes deģeneratīvās slimībās. Prog. Retin. Eye Res. 2017, 58, 1.–27. [CrossRef] [PubMed]

30. Bell, BA; Kauls, C.; Bonilha, VL; Rayborn, ME; Šadrahs, K.; Hollyfield, JG BALB/c pele: standarta vivārija apgaismojuma ietekme uz tīklenes patoloģiju novecošanas laikā. Exp. Eye Res. 2015, 135., 192.–205. [CrossRef]

31. Klāsens, HJ; Ng, TF; Kurimoto, Y.; Kirovs, I.; Šatoss, M.; Coffey, P.; Young, MJ Multipotent tīklenes priekšteči izsaka attīstības marķierus, diferencējas tīklenes neironos un saglabā gaismas izraisītu uzvedību. Izpētīt. Oftalmols. Vis. Sci. 2004, 45, 4167–4173. [CrossRef]

32. jCyte, Inc. Cilvēka tīklenes cilmes šūnu (jCell) atsevišķas intravitreālas injekcijas drošība pigmenta retinīta gadījumā. Klīniskais izmēģinājums Nr. NCT02320812. Pieejams tiešsaistē: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02320812 (aplūkots 2023. gada 24. februārī).

33. jCyte, Inc. Cilvēka tīklenes cilmes šūnu intravitreālas injekcijas drošība un efektivitāte pieaugušajiem ar pigmentozo retinītu. Klīniskais izmēģinājums Nr. NCT03073733. Pieejams tiešsaistē: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03073733 (aplūkots 2023. gada 24. februārī).

34. jCyte, Inc. Cilvēka tīklenes cilmes šūnu (šūnu) atkārtotas intravitreālas injekcijas drošība pieaugušiem cilvēkiem ar pigmenta retinītu. Klīniskais izmēģinājums Nr. NCT04604899. Pieejams tiešsaistē: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04604899 (aplūkots 2023. gada 24. februārī).

36. Oudejans, Dž. van der Valk, P. T šūnu un NK šūnu jaunveidojumu imūnhistoķīmiskā klasifikācija. Dž.Klins. Pathol. 2002, 55, 892. [CrossRef] [PubMed]

36. Tostanoskis, LH; Čiu, YC; Gammons, Dž. M.; Saimons, T.; Andorko, JI; Brombergs, JS; Jewell, CM Vietējo limfmezglu mikrovides pārprogrammēšana veicina sistēmisku un antigēnu specifisku toleranci. Cell Rep. 2016, 16, 2940–2952. [CrossRef] [PubMed]

38. Jurga, AM; Paleczna, M.; Kuter, KZ Pārskats par diferenciālo mikroglia fenotipu vispārīgajiem un diskriminējošajiem marķieriem. Priekšpuse. Šūnu neiroķi. 2020, 14, 198. [CrossRef] [PubMed]

38. Li, JC; Zou, XM; Janga, SF; Jin, JQ; Žu, L.; Li, CJ; Jans, H.; Džan, AG; Zhao, TQ; Chen, CY Neitrofilu ekstracelulārie slazdi piedalās ar vēzi saistītas trombozes attīstībā pacientiem ar kuņģa vēzi. Pasaule J. Gastroenterols. 2022, 28, 3132–3149. [CrossRef]

39. Kee, BL Development of Natural Killer Cells and ILC1. Encikls. Imūnobiols. 2016, 1, 140–148.