Uzlabota objektu atpazīšanas atmiņa, izmantojot pēckodētu atkārtotu transkraniālo magnētisko stimulāciju, 1. daļa

abstrakts

Priekšvēsture: Ir zināms, ka smadzeņu stimulācija ietekmē kanoniskos ceļus un olbaltumvielas, kas ir iesaistītas atmiņā. Tomēr ir pretrunīgi rezultāti par smadzeņu stimulācijas spēju uzlabot atmiņu, ko var izraisīt stimulācijas laika atšķirības.

Pastāv cieša saikne starp smadzeņu stimulāciju un atmiņu. Smadzeņu stimulācija var veicināt smadzeņu neironu darbību, tādējādi uzlabojot atmiņu un kognitīvās spējas.

Pirmkārt, smadzeņu stimulācija var veicināt savienojumu starp neironiem. Stimulējot smadzenes, saziņa un savienojums starp neironiem kļūs biežāks un efektīvāks. Šie savienojumi kļūs stabilāki un reālāki, padarot smadzenes elastīgākas, radošākas un pārdomātākas. Šīs priekšrocības dos jums priekšrocības mācībās un dzīvē.

Otrkārt, smadzeņu stimulācija var uzlabot atmiņu. Bieža smadzeņu stimulācija var uzlabot smadzeņu vitalitāti un veselību, tādējādi uzlabojot atmiņu. Pastāv būtiska saikne starp smadzeņu veselību un atmiņu un izziņas aktivitātēm. Smadzeņu stimulācija palīdzēs smadzenēm atgūties, augt un atjaunoties. Tādā veidā mums būs vieglāk apgūt zināšanas vai iegūt jēgpilnu informāciju no dzīves, un mēs varēsim tās labāk saglabāt un atcerēties smadzenēs.

Turklāt smadzeņu stimulēšana var arī veicināt jaunas informācijas apguvi un pielietošanu. Dzīvē nemitīgi sastopamies ar dažādām problēmām, ar kurām neprotam tikt galā. Bieži stimulējot smadzenes, mēs varam ātrāk un precīzāk saprast šo sarežģīto informāciju, pakāpeniski tai pielāgoties, atrast veidus, kā to apstrādāt un labāk tikt ar to galā, padarot mūs ērtākus, risinot lietas.

Īsāk sakot, izmantojot smadzeņu stimulāciju, mēs varam būt elastīgāki, radošāki un pārdomātāki. Mēs arī ar lielāku pārliecību saskarsimies ar dzīves problēmām un izaicinājumiem. Smadzeņu stimulēšana ir labs veids, kā uzlabot mūsu kognitīvās spējas, stiprināt mācīšanos un uzlabot atmiņu. Turēsimies pie sava smadzeņu vingrojumu plāna, saglabāsim pozitīvu attieksmi, būsim pozitīvi, tiecamies pēc labākas personības attīstības un īstenosim savus ideālus. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche var ievērojami uzlabot atmiņu, jo Cistanche var arī regulēt neirotransmiteru līdzsvaru, piemēram, palielināt acetilholīna un augšanas faktoru līmeni, kas ir ļoti svarīgi atmiņai un mācībām. Turklāt Cistanche var arī uzlabot asins plūsmu un veicināt skābekļa piegādi, kas var nodrošināt, ka smadzenes saņem pietiekamu uzturu un enerģiju, tādējādi uzlabojot smadzeņu vitalitāti un izturību.

Noklikšķiniet uz Zināt, lai uzlabotu darba atmiņu

Hipotēze: mēs izvirzījām hipotēzi, ka atkārtota transkraniālā magnētiskā stimulācija (rTMS), kas veikta pēc mācību uzdevuma un laika posmā pirms izguves, varētu palīdzēt uzlabot atmiņu. Metodes: mēs implantējām B6129SF2/J peļu tēviņus (n ¼ 32) ar galvaskausa stiprinājumu, lai nostiprinātu rTMS spoles. ka pelēm varētu konsekventi stimulēt frontālo zonu, kamēr tās brīvi pārvietojas.

Pēc tam pelēm tika veikta objektu atpazīšanas testa paraugu ņemšanas fāze, un tām tika veikta ārstēšana þ3, þ24, þ48 h pēc testa. Ārstēšana sastāvēja no 10 min 10 Hz rTMS stimulācijas (TMS, n ¼ 10), fiktīvas ārstēšanas (SHAM, n ¼ 11) vai kontroles grupas, kas neveica uzvedības testu un nesaņēma rTMS (KONTROLE n ¼ 11).

Pie þ72 h peles tika pārbaudītas, lai tās izpētītu jauno objektu salīdzinājumā ar pazīstamo objektu. Rezultāti: 72- stundā tikai pelēm, kuras saņēma rTMS, jaunā objekta izpēte bija lielāka nekā pazīstamajam objektam.

Mēs arī parādām, ka šim efektam ir svarīga sinaptiskā GluR2 veicināšana un sinaptisko savienojumu uzturēšana peririnālajā garozā un hipokampu CA1.

Turklāt mēs atradām pierādījumus, ka šīs izmaiņas bija saistītas ar CAMKII un CREB ceļiem hipokampu neironos.

Secinājums: Sasaistot zināmos rTMS bioloģiskos efektus ar atmiņas ceļiem, mēs sniedzam pierādījumus tam, ka rTMS efektīvi uzlabo atmiņu, ja to lieto konsolidācijas un uzturēšanas fāzes laikā.

1. Ievads

Ir zināms, ka neinvazīvā smadzeņu stimulācija ietekmē kanoniskos ceļus un proteīnus, kas iesaistīti atmiņā. Tomēr pašreizējie pētījumi, kuros pētīta smadzeņu stimulācijas, īpaši atkārtotas transkraniālās magnētiskās stimulācijas (rTMS) ietekme uz atmiņu, ir devuši pretrunīgus rezultātus [1].

Iemesls tam varētu būt stimulācijas mērķēšana dažādos laikos atmiņas veidošanās un izguves laikā [1]. Pierādījumi liecina, ka rTMS mērķauditorijas atlase pēckodēšanas vai konsolidācijas fāzē varētu izrādīties noderīga stabilu ilgtermiņa atmiņu veidošanai [2]e4].

Konsolidācija ir fāze, kurā īstermiņa atmiņa tiek pārveidota par ilgtermiņa atmiņu (LTM). Process ir atkarīgs no laika specifiskās proteīnu sintēzes, kas jauno informāciju pārveido stabilās sinaptiskās modifikācijās ar palielinātu postsinaptisko receptoru blīvumu [5,6].

Šīs laika un reģionam specifiskās proteīnu sintēzes nozīme ir pierādīta pētījumos, kas bloķē denovo proteīnu sintēzi. Piemēram, viens pētījums, kas bloķēja proteīnu sintēzi hipokampā 3-h, bet ne 6-h pēc mācīšanās notikuma, žurkām traucēja LTM, bet ne īstermiņa atmiņu[7].

No šiem proteīniem ir identificēti vairāki svarīgi signalizācijas ceļi, kas ir pārregulēti un svarīgi šajā procesā.

Sinapsē pastāv vairāki signalizācijas ceļi, kas signalizē par LTM nepieciešamo receptoru inervāciju un mugurkaula stabilitāti. Tie tiek aktivizēti, izmantojot ilgtermiņa potenciācijas (LTP) stimulēšanas notikumu, un bieži tiek pastiprināti ar neirotrofiskiem faktoriem, piemēram, no smadzenēm iegūto neirotrofisko faktoru (BDNF) [8].

BDNF ir īpaši svarīgs ilgtermiņa atmiņu veidošanā, jo BDNF sintēzes bloķēšana noteiktos laika punktos bloķē tā konsolidāciju [5].

BDNF saistās ar tirozīna kināzes receptoriem (TrkB) un var ierosināt vairākus signalizācijas ceļus, piemēram, mitogēnu aktivētu proteīnkināzes / ārpusšūnu signālu regulētas kināzes (ERK) vai fosfolipāzes Cg ceļus. Šie signalizācijas ceļi saplūst, aktivizējot transkripcijas regulēšanas faktoru cyclicAMP-responsive element-binding protein (CREB).

Kalcija aktivētie proteīni, piemēram, kalcija/kalmodulīna atkarīgā proteīnkināze II (CAMKII), arī spēlē lomu CREB aktivētā gēnu regulēšanā[9e11], un tie var arī tieši mediēt glutamaterģisko AMPA receptoru sinaptisko ekspresiju un stabilizēt sinaptiskās sastatnes [12e15] .

Kopā šie signalizācijas ceļi rada Shiftin receptoru ekspresiju un translokāciju, kas veicina pastiprinātu aktivāciju sinapsē, tādējādi palīdzot stabilizēt sinapses un veicināt ilgstošas ​​LTP uzturēšanu [16]. Svarīgi, ka iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka ir iespējams uzlabot atmiņas konsolidāciju. periodiski atkārtoti aktivizējot šos konsolidācijas ceļus eksperimentālos apstākļos [17].

Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši rTMS spēju tieši ietekmēt šos specifiskos ceļus smadzenēs. In vivo pētījumi ir parādījuši, ka rTMS palielina BDNF līmeni smadzenēs [18e20]. Tiešāk runājot, in vitro rTMS izraisa palielinātu Ca2þ neironos, kas ir dominējošā signalizācijas molekula CAMKII ceļā [18]. Paaugstināta CAMKII un CREB fosforilācija tika parādīta arī in vitro pēc rTMS [20,21].

rTMS arī tieši ietekmē sinaptisko receptoru ekspresiju, palielinot AMPA receptoru blīvumu [22e24] un regulējot AMPA receptoru apakšvienības glutamāta receptoru 1 (GluR1) un glutamāta receptoru 2 (GluR2) [25, 26].

Tāpēc asrTMS aktivizē šos ceļus, un tas būtu visefektīvākais atmiņas uzlabošanas konsolidācijas fāzē. Šajā pētījumā tika pētīta rTMS izmantošana atmiņas uzlabošanai, mērķējot uz atmiņas konsolidācijas un uzturēšanas fāzes stimulāciju.

Mēs izvirzījām hipotēzi, ka rTMS, kas tiek ievadīts pēc mācību uzdevuma un laika posmā pirms izguves, varētu uzlabot atmiņas veiktspēju. Tas būtu rezultāts periodiskai to ceļu atkārtotai aktivizēšanai, kas ir saistīti ar atmiņu, ko arī ietekmē rTMS.

Izmantojot konkrētas epizodiskas LTM dzīvnieku modeli, mēs parādījām, ka rTMS uzlabo objekta atmiņu, ja tā tika ievadīta 72- h laikā starp kodēšanu un izguvi, turpretim pelēm, kurām tika veikta SHAM ārstēšana, atmiņa netika saglabāta.

Šo efektu atbalstīja izmaiņas tosinaptiskajos savienojumos peririnālajā garozā un CA1, paaugstināta CREB un CAMKII aktivācija un dinamiska AMPA receptoru apakšvienību maiņa sinapsē.

2. Materiāls un metodes

2.1. Dzīvnieki

Šajā pētījumā mēs izmantojām n ¼ 33 vīriešu dzimuma B6129SF2/J peles vecumā no 2 līdz 4 mēnešiem. Visas peles dzīvoja 12-h gaismas/12-h tumšā ciklā ar brīvu piekļuvi sausai barībai un ūdenim. Visas dzīvnieku kopšanas un procedūras atbilda Dzīvnieku labturības likumam, un tās bija saskaņā ar institucionālajām vadlīnijām, un tās apstiprināja VA Palo Alto Dzīvnieku pētniecības komiteja.

2.2. Spoles atbalsta operācija

Katrai pelei tika veikta operācija, lai piestiprinātu spoles balstu, kas ļāva konsekventi rTMS stimulēt nomodā esošos dzīvniekus. Sīkāka informācija par ķirurģisko procedūru ir atrodama Poh et al., 2018[27].

Īsāk sakot, dzīvnieki tika anestēzēti ar 3% izoflurānu un saglabāti 2e3% ar deguna konusu. Pēc skūšanās un vietas tīrīšanas, lai nodrošinātu sterilitāti, ar skalpeļa asmeni tika veikts sagitāls griezums aptuveni 10 mm garumā.

Periosts tika viegli nokasīts, un pie bregmas tika piestiprināts iepriekš sagatavots spoles balsts ar ciānakrilātu un pastiprināts ar zobu cementu. Pēc tam brūce tika sašūta ap spoles balstu.

2.3. Uzvedības un stimulēšanas procedūras

Pārskatu par uzvedību un stimulācijas procedūrām sk. 1a. Pēc piecu dienu atveseļošanās no spoles atbalsta operācijas, trīs dienas tika pieradinātas pie atsevišķa stimulācijas būra un spoles procedūrām.

Pēdējā spoles pieradināšanas dienā pelēm tika veikts atvērtā lauka tests (OFT) 10-minūtes, kas arī kalpoja par pieradināšanu objekta atpazīšanas testam (ORT). Nākamajā dienā peles 10 minūtes tika pakļautas ORT paraugu ņemšanas fāzei ar diviem vieniem un tiem pašiem objektiem. Objekti bija līdzīga izmēra, bet ar dažādām krāsām un formām. Šie objekti tika novietoti pretējos kvadrātveida testēšanas arēnas stūros.

Trīs stundas vēlāk sēnes tika nejauši sadalītas divās ārstēšanas grupās: TMS, kas saņēma aktīvu stimulāciju 10-min 10 Hz rTMS, un SHAM, kuras tika apstrādātas vienādi, izņemot to, ka stimulācijas laikā tika izslēgta spole.

Gan TMS, gan SHAM peles tika ārstētas vēlreiz24- un 48-h pēc iepazīšanās. Pēdējā dienā (72-h pēc iepazīšanās) pelēm tika pakļauta ORT testa fāze 10-minūtes ar vienu pazīstamu objektu un vienu jaunu objektu.

Lai noteiktu, vai jaunā objekta izpēte bija lielāka nekā pazīstamā objekta izpēte, mēs aprēķinājām diskriminācijas indeksu (((jauna objekta izpēte)-(pazīstama objekta izpēte))/((jauna objekta izpēte)þ(pazīstama objekta izpēte))). Mēs izvēlējāmies 72-h, jo gan iepriekšējie pētījumi [28], gan izmēģinājuma dati (nav parādīti) parādīja, ka normālos apstākļos peles šajā brīdī nesaglabā ORT atmiņu.

Gan objektu veidi, gan jaunā objekta atrašanās vieta bija līdzsvarota starp grupām. Pieradināšanai, paraugu ņemšanai un zondes sesijai pelēm pirms izmēģinājumiem vienmēr tika dotas 30 minūtes, lai aklimatizētos eksperimenta telpā, un pēc katras peles objekti un arena tika notīrīti ar 70% etanolu.

Lai izpētītu tikai uzvedības uzdevuma ietekmi, mēs iekļāvām arī grupu, kas tika ārstēta tāpat kā SHAM peles, izņemot gadījumus, kad tās neveica ORT.

Tā vietā viņi tika pakļauti paraugu ņemšanas un zondes sesijai, bet bez objektiem. Viena pele TMS grupā nesasniedza nepieciešamo abu objektu kopējās 20-s izpētes slieksni izlases sesijā, un tāpēc tika izslēgta no pētījuma. Šī pele tika izslēgta no turpmākās bioķīmiskās analīzes.

Visas pārējās peles sasniedza kritērijus gan paraugu ņemšanas, gan zondes sesijā. Izņemot vienu peli, galīgie skaitļi eksperimentālajās grupās bija TMS n ¼ 10, SHAM n ¼ 11 un CONTROLn ¼ 11.

2.4. Rietumu blot

Trīs stundas pēc zondes sesijas peles tika nogalinātas ar ketamīna pārdozēšanu, un hipokampu un frontālās garozas audi tika ātri sadalīti uz sausa ledus un uzglabāti 80 C temperatūrā.

Šie paraugi tika homogenizēti ar 300 ml ledusaukstu Syn-Per Synaptic proteīna ekstrakcijas reaģentu (Thermo Scientific) ar 1x proteāzes inhibitoru kokteili (Roche) un 1x fosfatāzes inhibitoru kokteiļa (Roche) tabletēm (uz 10 ml) 5 s.

Homogenāti tika centrifugēti pie 1200 g 10 minūtes, lai noņemtu šūnu atliekas. Tika paņemts supernatants, un daļa no supernatanta tika sadalīta pilna homogenāta analīzei. Atlikušo daļu centrifugēja pie 15,000 g 20-min 4 C temperatūrā.

Granulas, kas satur sinaptosomas, tika viegli atkārtoti suspendētas Syn-Per ar 1,5 ml/g audu, lai izveidotu Synaptic Homogenate. Lai kvantitatīvi noteiktu proteīna koncentrāciju paraugā, tika izmantots nanopiliens.

Pilnais homogenāts un sinaptiskais homogenāts tika uzglabāts 80 C temperatūrā līdz analīzei. Gan Full, gan Synaptic homogenāti tika atšķaidīti līdz 4 mg/ml ledusaukstā PBS un sajaukti ar 1:4 proteīna iekraušanas buferi (LiCor) un 1:4000 merkaptoetanolu. Pēc tam tos uzsildīja 95 C temperatūrā un ievietoja Mini PROTEAN TGX gēlos (Bio-Rad).

Pēc atdalīšanas, izmantojot elektroforēzi pie 100 V, proteīni tika pārnesti uz nitrocelulozes blotēšanas membrānu (GE Healthcare Lifesciences). Membrānas tika mazgātas SuperSignal WesternBlot Enhancer Antigen Pretreatment Solution (Thermo Scientific) un pēc tam bloķētas ar bloķējošo buferi (Rockland) un 1% kazas serumu 1-h.

Pēc bloķēšanas membrānu nakti istabas temperatūrā inkubēja ar primārajām antivielām, kas atšķaidītas SuperSignal Western BlotEnhancer primārajā antivielu atšķaidītājā (Thermo Scientific).

Primārās izmantotās antivielas bija peles monoklonālais ERK 1/2 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology), trušu monoklonālais fosfo-p44/42 MAPK (pERK 1:1000, Cell SignalingTechnologies), peles monoklonālais CREB (1:500), trušu monoklonālais signāls. fosfo-CREB (S133) (pCREB1:500, šūnu signalizācijas tehnoloģijas), trušu monoklonālais CAMKIIalpha (1:1000, šūnu signalizācijas tehnoloģijas), peles monoklonālais fosfo-CAMKII (Thr286) (pCAMKII 1:100al10, Gluuse (Invioctrogenal10), Gluuse 750, Santa Cruz Biotechnology), trušu monoklonālais fosfo-GluA1 (S845) (pGluR1(845) 1:750, CellSignaling Technologies), trušu monoklonālais fosfo-GluA1 (S831) (pGluR1: 7-831, Technologies0). monoklonālais GluR2 (1:750, Invitrogen), trušu poliklonālais fosfo-GluR2(S880) (pGluR2 1:500, Invitrogen), peles monoklonālais TrkB (1:500, BD Transduction Laboratories) vai trušu poliklonālais T phos. Tyr816) (pTrkB 1:500, EMD Millipore).

Standarta slodzes kontrolei tika izmantots trušu poliklonālais Cofilin (1:2000, Sigma). Pēc skalošanas TBS-Tween, membrāna tika inkubēta 1 stundu istabas temperatūrā kazu anti-trušu 800 un kazu anti-peles 680 (1: 3000, LiCor).

Imunoblots tika attēlots, izmantojot Odyssey Clx infrasarkano attēlveidošanas sistēmu (LiCor), un joslas intensitātes datu analīze tika veikta, izmantojot Image Studio (LiCor).

2.5. Imūnhistoķīmija

Trīs stundas pēc zondes sesijas peles, kas tika nogalinātas ar ketamīna pārdozēšanu, tika transkardiāli perfūzētas ar 50 ml auksta 1 M PBS.
Smadzenes nekavējoties tika fiksētas 4% paraformaldehīda šķīdumā 4 ° C temperatūrā un vismaz 48- h tika pārnestas uz 30% saharozi PBS, pirms tika veikta kriosekcionēšana 30 mm sekcijās. Brīvi peldošās sekcijas tika bloķētas un permeabilizētas ar 10% kazas ēzeļa serumu 0,1% Triton 1 M PBS, pēc tam inkubēja 48-h ar trušu poliklonālo PSD95 (1:300, Thermo Scientific) un peles monoklonālo SV2A (1:300, Santakrusas biotehnoloģija).

Pēc tam šīs sekcijas tika inkubētas 1-h ar sekundārajām antivielām Alexa Fluor goat anti-rabbit 568 (1:500, Invitrogen) un Alexa Fluorgoat anti-mouse 488 (1:500, Invitrogen). Pēc tam šķēles nomazgāja ar kodolkrāsu DAPI. (1:1000, Sigma), uzstādīts uz slaidiem un pārklāts ar Fluoromount (Thermo Scientific).

Krāsošana tika kvantitatīvi noteikta frontālajā garozā (FC), muguras CA1 hipokampā, entorinālajā garozā (EC) un perirhinālajā garozā (PC).

Salikti attēli tika uzņemti ar BZ-X700 fluorescējošo mikroskopu (Keyence) ar 40x palielinājumu, lai identificētu sinaptisko punktu visā griezumā. Kopējais PDS95 puncta, SV2A puncta un kolokalizētais (definēts kā divi punkti viens otram blakus vai pārklājas) tika skaitīti no vismaz četriem attēliem katrā apgabalā un katrai pelei iegūto rezultātu vidējais rādītājs. Kolokalizētā daudzuma kvantitatīva noteikšana tika pabeigta, saskaitot punktus (pārklājas SV2A un PSD95)/(kopējais SV2A un PSD95).

2.6. Statistika

Visi dati atbilda normāluma pieņēmumiem, kas novērtēti, pārbaudot aprēķināto atlieku šķībumu, izliekumu un Šapiro Vilka vērtību, un nebija nekādu dispersijas viendabīguma pārkāpumu, kas novērtēts, izmantojot Levēna statistiku.

Uzvedības testiem tika izmantoti studentu t-testi, lai salīdzinātu SHAM ar TMS, un jaunu un pazīstamu objektu izpētei grupās tika izmantota atkārtotu pasākumu divvirzienu ANOVA.

Imūnhistoķīmijas un Western blot datu nozīmīgums tika pārbaudīts, izmantojot One-WayANOVA. Visiem post-hoc pāru salīdzinājumiem tika izmantota Tukey korekcija ar nozīmīgumu pie p < 0.05.

Ja dispersijas viendabīgums tika pārkāpts, nozīmīgums tika noteikts ar WelchTest un pēc tam tika koriģēts ar Games-Howell, šie gadījumi tiek atzīmēti rezultātos. Visa statistika tika veikta, izmantojot SPSS (versija 22, IBM), un grafiki tika izveidoti, izmantojot GraphPad (versija 7, Prism).

For more information:1950477648nn@gmail.com