Nieru OCT2 un MATE1 sekrēcijas inhibīcija in vitro ar pretvemšanas līdzekļiem
Mar 18, 2022
Svētīgais Džordžs1, Sja Veņa1, Edgars A. Džeimss2, Melānija S. Džoja3,4,5,†un Lauren M. Aleksunes
Abstract:Organiskais katjonu transportētājs 2 (OCT2) un vairāku zāļu un toksīnu ekstrūzijas proteīns 1 (MATE1) mediē zāļu nieru sekrēciju. Nesenie pētījumi liecina, ka ondansetrons, 5-HT3 antagonistu zāles, ko lieto, lai novērstu sliktu dūšu un vemšanu, var kavētOCT2- un MATE{1}}starpnieks transports. Šī pētījuma mērķis bija pārbaudīt piecu 5-HT3 antagonistu zāļu spēju inhibētOCT2un MATE1 transportieri. OCT2/MATE1 zondes substrāta ASP plus transportēšana tika novērtēta, izmantojot divus modeļus: (1) HEK293nieresšūnas, kas pārmērīgi ekspresē cilvēkuOCT2vai MATE1, un (2) MDCK šūnas, kas transficētas ar cilvēkuOCT2and MATE1. In HEK293 cells, the inhibition ofASP+ uptake by OCT2 listed in order of potency was palonosetron (IC50: 2.6 µM) > ondansetron >granisetron > tropisetron > dolasetron (IC50: 85.4 µM) and the inhibition of ASP+ uptake by MATE1in order of potency was ondansetron (IC50: 0.1 µM) > palonosetron = tropisetron > granisetron >dolasetronu (IC50: 27,4 µM). Ondansetrons (0,5–20 µM) inhibēja ASP transcelulāro transportu no bazolaterālās uz apikālo un līdz pat 64 procentiem. Augstākas palonosetrona, tropisetrona un dolasetrona koncentrācijas (10 un 20 µM) līdzīgi samazināja ASP plus transcelulāro transportēšanu. Dubulti transfektētās OCT2-MATE1 MDCK šūnās ondansetrons 0,5 un 2,5 µM koncentrācijās izraisīja ievērojamu ASP plus intracelulāro uzkrāšanos. Kopumā šie dati liecina, ka 5-HT3 antagonistu zāles var kavēt katjonu zāļu sekrēciju nierēs, traucējot OCT2 un/vai MATE1 funkciju.
Atslēgvārdi:OCT2; MATE1; katjonu; 5-HT3 antagonists;nieres; sekrēcija; transports
Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com
Cistanche tubulosa novēršnieresslimība, noklikšķiniet šeit, lai iegūtu paraugu
1. Ievads
Nieru sekrēcija tiek panākta ar saskaņotu zāļu uzņemšanu un izplūdi caur kanāliņu epitēliju. Medikamentiem un toksiskām vielām, kas ir organiskie katjoni, to transepitēlija transportēšana filtrātā vispirms tiek panākta ar organisko katjonu transportētāju 2 (OCT2) uz bazolaterālās virsmas un pēc tam ar multizāļu un toksīnu ekstrūzijas 1 (MATE1) transporteri uz otas robežas. membrāna. Pirms OCT2/SLC22A1 un MATE1/SLC47A1 gēnu atklāšanas bija labi saprotams, ka organisko katjonu sekrēciju var kavēt farmakoloģiski [1]. Izmantojot dažādas eksperimentālas pieejas dažādām preklīniskajām sugām, tika pierādīts, ka organiskie katjoni pakļaujas aktīvai transportēšanai un nieru sekrēcijai [2–4]. Kopš šiem agrīnajiem novērojumiem pētījumi ir attīstījušies, lai izprastu ne tikai organisko katjonu sekrēcijas molekulāros mehānismus, bet arī klīniski nozīmīgas zāļu mijiedarbības potenciālu pēc OCT2 un MATE1 pārtraukšanas (apskatīts [5]).
Serotonīna 5-HT3 receptoru antagonisti ir kļuvuši par kritiskām zālēm sliktas dūšas un vemšanas ārstēšanai. Serotonīnu izdala tievās zarnas enterohromafīna šūnas. 5-HT3 antagonisti inhibē jonotropo ligandu saistītu jonu kanālu uz vagusa aferenajiem nerviem un novērš vemšanas refleksu [6]. Ondansetrons bija pirmais 5-HT3 antagonists, kas apstiprināts, lai novērstu ķīmijterapijas izraisītu sliktu dūšu un vemšanu [7,8]. Kopš tā laika ir izstrādātas papildu zāles šajā klasē (tostarp tropisetrons, granisetrons, dolasetrons un palonosetrons) [9]. Lai gan 5-HT3 antagonistu primārā terapeitiskā indikācija ir bijusi ķīmijterapijas un starojuma izraisītas vemšanas novēršana, tie ir apstiprināti arī pēcoperācijas sliktas dūšas un vemšanas ārstēšanai un tiek lietoti ārpus marķējuma, lai ārstētu rīta slimības, hyperemesis gravidarum. , pēcoperācijas delīrijs un nieze [10–14].
Ņemot vērā 5-HT3 antagonistu katjonu raksturu (1. attēls), tie ir parādījušies kā OCT un MATE transportētāju substrāti un inhibitori. In vitro pētījumi atklāja, ka ondansetrons un tropisetrons ir OCT1 un OCT2 substrāti un inhibitori [15–20]. Turklāt ir pierādīts, ka indivīdiem ar funkciju zuduma variantiem OCT1/SLC22A1 gēnā ir mainījusies tropisetrona farmakokinētika un uzlabota klīniskā efektivitāte [16]. Tāpat ondansetrons var inhibēt MATE transportētājus, izraisot pretdiabēta līdzekļa metformīna uzkrāšanos nierēs, kā arī palielināt pretvēža zāļu cisplatīna nefrotoksicitāti [19]. Cilvēkiem ondansetrons samazina metformīna nieru klīrensu, iespējams, inhibējot MATE1 izvadīšanu [21]. Šie dati kopā norāda uz 5-HT3 antagonistu potenciālu inhibēt zāļu transepitēlija sekrēciju, izmantojot OCT2 un MATE1. Tāpēc mēs centāmies sistemātiski salīdzināt piecus 5-HT3 antagonistus, lai noteiktu to spēju inhibēt cilvēka OCT2 un MATE{23}}mediētu zondes katjonu substrāta transportēšanu, izmantojot vienreizēju un dubultu transfekciju.nieresšūnas. Jāatzīmē, ka pašreizējā pētījumā galvenā uzmanība tika pievērsta MATE1 kā MATE2-K proteīna līmenim cilvēka organismā.nieresIepriekš tika pierādīts, ka garoza ir zem kvantitatīvās noteikšanas apakšējās robežas, izmantojot masas spektrometriju [22].
2. Rezultāti
2.1. ASP plus kā fluorescējoša substrāta raksturojums HEK293 šūnās, kas pārmērīgi ekspresē OCT2 un MATE1
Sākotnējie pētījumi raksturoja ASP plus uzņemšanu šūnās, kas pārmērīgi ekspresē tukšu vektoru (EV), OCT2 vai MATE1 (2. attēls). ASP plus uzrādīja no laika atkarīgu (2.A attēls) un no koncentrācijas atkarīgu (2.B attēls) uzņemšanu gan OCT2-, gan MATE1-ekspresējošās šūnās un uzrādīja piesātināmu kinētiku (OCT2: Vmax 8,1 nmol/mg/min , Km 2,9 uM, R2 0,95; MATE1: Vmax 3,4 nmol/mg/min, Km 8,2 uM, R2 0,96). EV šūnās bija minimāla ASP plus uzkrāšanās (Vmax 1,9 nmol/mg/min, Km 37,3 uM, R2 0,92). Pamatojoties uz šiem atklājumiem, ASP plus uzņemšana tika kvantitatīvi noteikta pēc 1 minūtes (lineārais diapazons OCT2 un MATE1 transportēšanai) 10 uM koncentrācijā, kas nodrošināja pietiekamu jutību fluorescences noteikšanai un 5-HT3 antagonistu kā inhibitoru skrīningam.
Lai nodrošinātu, ka šie apstākļi atspoguļo katra transportētāja aktīvo transportēšanu, tika noteiktas cimetidīna, vispāratzīta OCT2 un MATE1 inhibitora, IC5{{10}} vērtības (3. attēls un 1. tabula). Cimetidīna IC50 bija 24,5 土 4,0 uM OCT2-ekspresējošās šūnās un 0,23 土 0,2 uM MATE1- ekspresējošās šūnās, saskaņā ar publicētajiem datiem, kas liecina par MATE1 inhibīciju zemākās koncentrācijās. [18,20]. Cimetidīnam nebija ietekmes uz ASP plus uzņemšanu EV šūnās.
2.2. OCT2- un MATE1-transporta inhibīcija ar pretvemšanas zālēm HEK293 šūnās
Tika novērtēti pieci dažādi 5-HT3 antagonisti (ondansetrons, palonosetrons, granisetrons, tropisetrons un dolasetrons) OCT2 un MATE1 transporta kavēšanai HEK293 šūnās, izmantojot ASP plus kā substrātu (3. attēls). No koncentrācijas atkarīga ASP plus uzņemšanas samazināšanās tika novērota OCT2- un MATE1- ekspresējošās šūnās visu piecu 5-HT3 antagonistu klātbūtnē, kas tika pārbaudīti dažādās koncentrācijās. IC50 vērtības ASP un 5-HT3 antagonistu uzkrāšanās kavēšanai, izmantojot pārbaudītos koncentrācijas diapazonus, ir parādītas 1. tabulā. Izņemot granisetronu, pārējie 5-HT3 antagonisti MATE1 inhibēja spēcīgāk nekā tie. OCT2. OCT2-mediētais transports tika inhibēts līdz ~90 procentiem, savukārt MATE{21}}mediētais transports tika inhibēts līdz ~70 procentiem pārbaudītajās koncentrācijās.
Kopumā 5-HT3 antagonisti lielā mērā nemainīja EV šūnu ASP plus uzņemšanu. Tomēr tika atzīmēts, ka palonosetrons un tropisetrons stimulēja papildu ASP plus uzņemšanu EV šūnās, un augstākā granisetrona koncentrācija izraisīja nelielu ASP plus uzkrāšanās samazināšanos.
2.3. ASP plus transcelulārā transporta un intracelulārās uzkrāšanās raksturojums OCT2/MATE{3}}MDCK šūnu ekspresēšanā
Lai izpētītu OCT2 un MATE1 kopējo ieguldījumu transepitēlija sekrēcijā, turpmākie eksperimenti tika veikti ar MDCK šūnām, kas polarizējas ar bazolaterālajām (OCT2) un apikālajām (MATE1) virsmām. OCT2 un MATE1 proteīna ekspresija tika apstiprināta divreiz transfektētās MDCK šūnās, izmantojot Western blotēšanu (4A attēls). Šajās šūnās tika pārbaudīta katjonu zondes substrāta ASP plus (25 uM) transcelulārā transportēšana, izmantojot Transwell ieliktņus. ASP plus transportēšana no bazolaterālā uz apikālo (B-uz-A) bija daudz lielāka (līdz 2{14}}reizēm 120 minūtēs) nekā transportēšana no apikāla uz bazolaterālu (A-B) OCT2/MATE1 dubulttransficētajās šūnās (4.B attēls). Tika lēsts, ka B-to-A/A-B izplūdes attiecība pēc 120 minūtēm ir 2,7 OCT2/MATE1 šūnām, kas atbalsta ASP plus aktīvo sekrēciju. Turpretim kontroles šūnām bija daudz zemāks ASP plus transports abos virzienos, salīdzinot ar OCT2 / MATE1 šūnām. ASP plus transportēšana no B uz A bija tikai ievērojami augstāka, salīdzinot ar transportēšanu no A uz B kontroles šūnās 90 (1, reizes) un 120 minūtes (1 reizes). ). Visi turpmākie inhibīcijas testi tika veikti virzienā no B līdz A.
Ķīmisko vielu spēja inhibēt ASP plus plūsmu un uzkrāties OCT2/MATE1 dubulttransfektētās šūnās noteiktos testa apstākļos tika novērtēta, izmantojot trīs pozitīvas kontroles inhibitorus (cimetidīns 5 un 50 uM, pirimetamīns 1 uM un olanzapīns 20 uM) (4C attēls). Cimetidīns ir zināms OCT2 un MATE1 inhibitors, ar lielāku potenciālu MATE1 (1. tabula) [18]. Pirimetamīns ir specifisks MATE1 inhibitors [23], savukārt tika konstatēts, ka olanzapīns spēcīgāk inhibē OCT2 (papildu attēls S1) [18, 20]. Visas trīs ķīmiskās vielas inhibēja ASP plus transcelulāro plūsmu (18 procenti cimetidīna 5 uM, 40 procenti cimetidīna 50 uM, 36 procenti pirimetamīna 1 uM un 28 procenti olanzapīna 20 uM 120 minūtēs).
ASP plus intracelulāra uzkrāšanās tika arī kvantitatīvi noteikta lizātos 120 minūtēs. Cimetidīns un pirimetamīns palielināja ASP plus intracelulāro uzkrāšanos attiecīgi par 1.{2}} un 1.{4}} (galvenokārt MATE1 inhibīcijas dēļ), bet olanzapīns samazināja ASP plus intracelulāro uzkrāšanos par 51 procenti (sakarā ar OCT2 inhibīciju). Kontroles šūnās nevienā no laika punktiem netika novērota būtiska ASP plus B-uz A transportēšanas kavēšana. Kontroles šūnās arī nebija būtisku izmaiņu ASP plus intracelulārajā akumulācijā, salīdzinot ar nesēja kontroles šūnām, izņemot nelielu ASP plus uzkrāšanās samazināšanos 20 uM olanzapīna klātbūtnē.
2.4. ASP plus transcelulārā transporta inhibīcija, ko veic 5-HT3 antagonisti OCT2/MATE1-, kas ekspresē MDCK šūnas
Pieci 5-HT3 antagonisti (ondansetrons, palonosetrons, granisetrons, tropisetrons un dolasetrons) tika novērtēti pēc to spējas ietekmēt ASP plus transcelulāro transportēšanu un intracelulāro uzkrāšanos OCT2/MATE1 dubulttransfektētās šūnās (5. un 6. attēls). Cimetidīns (50 uM) tika iekļauts katrā eksperimentā paralēlā Transwells komplektā kā pozitīva kontrole. Interesanti, ka visi pieci 5-HT3 antagonisti uzrādīja dažādas pakāpes inhibīcijas ASP plus transcelulārajai B–A transportēšanai (5. attēls). Salīdzinot ar šūnām, kas apstrādātas ar nesēju, ondansetrons inhibēja ASP plus transportēšanu no B uz A no koncentrācijas atkarīgā veidā ar 36 procentu inhibīciju 120 minūtēs augstākajā pārbaudītajā koncentrācijā (20 uM). Palonosetronam un tropisetronam bija arī no koncentrācijas atkarīga ASP plus sekrēcijas inhibīcija, kas bija nozīmīga 10 un 20 uM visos laika punktos. ASP plus sekrēcijas kavēšana tika novērota, lietojot palonosetronu un tropisetronu 20 uM. Dolasetrons pie 10 un 20 uM inhibēja ASP plus transportēšanu tikai 120 minūtēs. Visbeidzot, granisetrons nemainīja ASP plus transportēšanu no B uz A nevienā pārbaudītajā koncentrācijā. Kontroles šūnas neuzrādīja būtisku inhibīciju ASP plus B–A transportēšanā ar kādu no 5-HT3 antagonistiem (dati nav parādīti).
2.5. ASP plus intracelulārā akumulācija OCT2/MATE1-izpauž MDCK šūnas pēc
Ārstēšana ar 5-HT3 antagonistiem
Zemas ondansetrona koncentrācijas (0,5 un 2,5 uM) izraisīja intracelulāro ASP pieaugumu par 13-kārtīgu, kā arī uzkrāšanos OCT2/MATE{7}}ekspresējošās šūnās, taču atšķirības nebija. salīdzinot ar nesējiem augstākās koncentrācijās (10 un 20 uM) (6. attēls). Tomēr kontroles šūnās tika novērota ASP plus uzkrāšanās samazināšanās (40 procenti) pie augstām ondansetrona koncentrācijām. OCT2/MATE1 šūnās tropisetrons un granisetrons palielināja ASP plus uzkrāšanos (attiecīgi 1,5 un 1{17}} reizes) augstākajā koncentrācijā (20 uM). Lietojot palonosetronu vai dolasetronu, netika novērotas būtiskas ASP un uzkrāšanās izmaiņas.
3. Diskusija
OCT2 un MATE1 ir galvenie transportētāji, kas koordinē organisko katjonu sekrēciju nierēs. Viņiem ir vairāki substrāti, kas pārklājas, tostarp metformīns, cisplatīns, lamivudīns un entekavīrs, kā arī noteiktas 5-HT3 antagonistu zāles [15–20,24]. Iepriekšējie pētījumi liecina, ka 5-HT3 antagonisti var arī kavēt OCT2 un MATE1 transportēšanu. Jo īpaši ir pierādīts, ka ondansetrons samazina cisplatīna un metformīna transportēšanu ar MATE1 [19]. Pašreizējā pētījuma mērķis bija paplašināt šo iepriekšējo darbu, lai salīdzinātu piecus 5-HT3 antagonistus, lai noteiktu to spēju inhibēt OCT2 un MATE1 atsevišķi, ja tie ir pārmērīgi ekspresēti HEK293 šūnās un koekspresēti MDCK šūnās un audzēti uz Transvela ieliktņiem. Ondansetrons un palonosetrons spēja inhibēt zondes katjonu ķīmiskās vielas ASP plus uzņemšanu HEK293 šūnās, kas ekspresē OCT2 vai MATE1, īpaši tik zemā koncentrācijā kā 0,1–0,5 uM. . Tāpat arī granisetrons, tropisetrons un dolasetrons spēja inhibēt katru transportētāju (tomēr augstākās koncentrācijās). Izmantojot OCT2/MATE1 divreiz transfektētas MDCK šūnas, ondansetrons inhibēja bazolaterālo līdz apikālo ASP plus sekrēciju visās pārbaudītajās koncentrācijās (0,5–20 uM), kas tika novērota tikai augstākās palonosetrona, tropisetrona un dolasetrona koncentrācijās. Šie dati, kas iegūti, izmantojot zondes fluorescējošu substrātu, liecina par iespējamu OCT2- un MATE1-mediētu zāļu mijiedarbību ar 5-HT3 antagonistiem.
Dati, kas iegūti OCT2 / MATE1 dubultā transficētajās šūnās, lielā mērā sakrīt ar HEK293 datiem, izņemot granisetronu. Ondansetrons, palonosetrons un tropisetrons uzrādīja no koncentrācijas atkarīgu ASP plus B-uz-A transportēšanas inhibīciju ar stiprumu secību, kas atspoguļo to, kas novērota ar MATE1 inhibīciju, kas novērota HEK293 šūnās. Pārsteidzoši, granisetrons neuzrādīja nekādu būtisku inhibīciju OCT2/MATE1 MDCK šūnās pat koncentrācijās, kas piecas reizes pārsniedza IC50 koncentrāciju, kas novērota HEK293 šūnās, kas ekspresē OCT2 vai MATE1. Tā kā MDCK šūnas vairāk līdzinās vietējām cauruļveida šūnām nekā HEK293 šūnas, pastāv iespēja, ka granisetrona izvietojums var tikt mainīts OCT2 vai MATE1 endogēno transporteru ortologu vai, iespējams, citu transportētāju ekspresijas dēļ. Piemēram, MDCK šūnas ļoti ekspresē suņu P-glikoproteīna transportētāju [25], kas var izraisīt granisetrona izplūdi. Šo spekulāciju apstiprina fakts, ka viena nukleotīda polimorfisms cilvēka MDR1/ABCB1 transportētājā uzlaboja granisetrona klīnisko efektivitāti vemšanas ārstēšanā [26]. Šie dati liecina, ka granisetrons var būt suņu P-glikoproteīna substrāts, izraisot intracelulārās koncentrācijas izmaiņas, kas pakļautas MATE1 transportētājam.
Lai gan OCT un MATE transportētāju substrāti un inhibitori lielā mērā pārklājas, pastāv atšķirības. Zāļu un zāļu mijiedarbība, kuras pamatā ir transportētājs, bieži var būt atkarīga no novērtējamā upura substrāta identitātes, kā tas ir pierādīts attiecībā uz OCT2 [27–29]. Attiecībā uz OCT2 katjonu substrāta izvēlei ir gan kvantitatīva, gan kvalitatīva ietekme uz inhibīcijas apjomu un veidu [27, 28]. Turpretim transportētā substrāta šķietamā Miķeļa konstante un IC50 vērtības MATE1 inhibīcijai četros dažādos substrātos bija līdzīgas [30]. Šie dati liecina, ka uz hMATE1 ārējās virsmas ir kopīga saistīšanās vieta substrātu un inhibitoru mijiedarbībai. Rezultātā 5-HT3 antagonistu zāļu mijiedarbība ar OCT2 un MATE1 var notikt, izmantojot dažādus mehānismus, neskatoties uz to kopīgo katjonu raksturu. Ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai virzītu pašreizējo pētījumu, izmantojot zondes substrātu un novērtējot mijiedarbību ar specifiskiem zāļu substrātiem, piemēram, cimetidīnu, metformīnu un cisplatīnu.
Lai novērstu sliktu dūšu un vemšanu, papildus 5-HT3 antagonistiem tiek izmantotas arī citas zāļu klases. Sākotnējos pētījumos mēs novērtējām citu pretvemšanas līdzekļu spēju inhibēt OCT2 un MATE{3}}mediēto ASP plus transportēšanu HEK293 šūnās. Interesanti, ka olanzapīns, prohlorperazīns un metoklopramīds inhibēja OCT2 aktivitāti dažādās koncentrācijās (papildu attēls S1). Neviena no šīm zālēm neinhibēja MATE1 aktivitāti 10 uM koncentrācijā (dati nav parādīti). Citi pretvemšanas līdzekļi, tostarp aprepitants un deksametazons, neietekmēja ASP plus uzņemšanu OCT2- vai MATE{10}}, kas ekspresē HEK293 šūnas (dati nav parādīti). Rezultātā citas pretvemšanas zāles (olanzapīns, prohlorperazīns un metoklopramīds), ko lieto vienlaikus ar 5-HT3 antagonistiem, var ietekmēt arī katjonu sekrēciju nierēs, jo īpaši to spējas kavēt OCT2 uzņemšanu.
Ir svarīgi apsvērt, cik labi in vitro modeļi apkopo cilvēka endogēnā transporta pazīmesnieres. Cilvēka OCT2 un MATE1 proteīna līmeņi iepriekš tika kvantificēti divreiz transfektētās MDCK šūnās ar LC-MS/MS (hOCT2 un hMATE1 bija attiecīgi 28,6 un 6,9 fmol/ug membrānas proteīna) [31]. Salīdzinājumam, pētījumi, kas nosaka proteīna ekspresiju cilvēka nieres garozā un cilvēka nieru membrānās, atklāj pieticīgāku ekspresijas atšķirību starp diviem transportētājiem vai pat lielāku MATE1 ekspresiju (OCT2 7.4 pmol/mg, MATE{{14). }}.1 pmol/mg) [22] un (OCT2 5 fmol/ug, MATE1 10 fmol/ug) [32]. Šīs atšķirības starp in vitro modeļiem un OCT2 un MATE1 endogēno cilvēka ekspresiju ir jāņem vērā un jāņem vērā, izstrādājot fizioloģiski pamatotus farmakokinētikas modeļus potenciālai katjonu zāļu mijiedarbībai nierēs.
Pašreizējais pētījums galvenokārt bija vērsts uz katjonu zāļu nieru sekrēciju. Tomēr ir svarīgi atzīt, ka aknas izsaka arī OCT1 un MATE1, kas nodrošina katjonu ķīmisko vielu žults attīrīšanu. Tas ir svarīgi, jo 5-HT3 antagonisti atšķiras pēc savas struktūras, metabolisma, saistīšanās ar olbaltumvielām un klīrensa ceļiem. Strukturāli 5-HT3 receptoru antagonisti satur bāzisku amīnu, aromātisku vai heteroaromātisku gredzenu sistēmu un karbonilgrupu (vai līdzīgu struktūru), kas ir vienā plaknē ar aromātisko reģionu (1. attēls) [33]. Konkrēti, amīna daļas struktūra irdansetronam atšķiras un ietver imidazolu, savukārt 6-locekļa gredzeni ir iekļauti citos 5-HT3 antagonistos. Šo strukturālo atšķirību nozīme mijiedarbībā ar OCT2 un/vai MATE1 prasa turpmāku izpēti, taču tā varētu izskaidrot nozīmīgāko ondansetrona ietekmi zemākās koncentrācijās. Turklāt daži 5-HT3 antagonisti tiek plaši iztīrītiniereskā vecāki vai metabolīti (piemēram, palonosetrons un tropisetrons). Daudzus 5-HT3 antagonistus (tostarp ondansetronu, tropisetronu, palonosetronu un granisetronu) spēcīgi metabolizē (48–95 procenti) citohroma P450 enzīmi aknās. Nesen veikti pētījumi ir parādījuši, ka metabolītiem var būt lielāka nozīme zāļu mijiedarbībā, nekā tika uzskatīts iepriekš [34]. Ir nepieciešama turpmāka OCT2 un MATE1 transportēšanas pārbaude ar galvenajiem 5-HT3 antagonistu metabolītiem, kas pārsniedz 25 procentus no sākotnējās sistēmiskās iedarbības. Tāpat ķīmiskajā klasē ir zāles ar īsu pussabrukšanas periodu (< 6="" h,="" ondansetron,="" and="" tropisetron),="" moderate="" half-lives="" (8–9="" h,="" granisetron,="" and="" dolasetron),="" and="" a="" long="" half-life="" (40="" h,="" palonosetron).="" these="" factors="" should="" be="" considered="" when="" evaluating="" potential="" drug-drug="" interactions="" using="" in="" vitro="" transporter="">
Pamatojoties uz 2020 FDA vadlīnijām par metabolismu in vitro un ar transportētāju mediētu zāļu un zāļu mijiedarbības pētījumiem [35], zāles var inhibēt transportētāju in vivo, ja: Cmax (nesaistītā)/IC50 vērtība. ir lielāks vai vienāds ar 0,1. Pamatojoties uz šīm vadlīnijām, ondansetrona MATE1 Cmax/IC50 vērtības norāda uz iespējamu zāļu mijiedarbību in vivo, izmantojot ASP plus kā zondes substrātu. Citu 5-HT3 antagonistu IC50 vērtību salīdzinājums ar to Cmax vērtībām (no liela nanomolāra līdz zemam mikromolāram) neliecina par zāļu mijiedarbības risku, vismaz ar ASP plus kā cietušā substrātu. Tāpat mēs pašlaik nezinām 5-HT3 antagonistu intrarenālo koncentrāciju, kas būtu svarīga, lai novērtētu iespējamo MATE1 zāļu mijiedarbību. Ir ierobežoti klīniskie dati, kas novērtē ar ondansetronu saistītu zāļu mijiedarbību ar OCT/MATE substrātiem. Piemēram, ondansetrons paaugstina kreatinīna un metformīna līmeni veseliem cilvēkiem nieru transportera inhibīcijas dēļ [21,36]. Interesanti, ka ondansetrons ne tikai samazināja metformīna nieru klīrensu, bet arī uzlaboja glikozes tolerances pasākumus [21]. Citos klīniskos pētījumos ir ziņots, ka ondansetrons paaugstina substrāta zāļu nefrotoksicitāti, potenciāli mainot transportētāju mediēto sekrēcijunieres[37–39]. Kopā šie dati pamato turpmāku ondansetrona zāļu mijiedarbības izpēti, inhibējot OCT un MATE transportētājus.
Rezumējot, šie in vitro dati liecina, ka daudziem 5-HT3 antagonistiem ir lielāka spēja inhibēt MATE1, tādējādi palielinot katjonu zāļu koncentrācijas palielināšanos kanāliņos. Turklāt ondansetrons bija pietiekami spēcīgs, lai palielinātu zondes substrāta ASP plus intracelulāro koncentrāciju koncentrācijās, kas bija tuvu klīniski nozīmīgajai Cmax. Šie dati atbilst iepriekšējiem in vivo pētījumiem ar pelēm, kur, vienlaikus lietojot ondansetronu, tika novērota pastiprināta cisplatīna izraisīta nefrotoksicitāte [19]. Pamatojoties uz pašreizējiem kritērijiem zāļu klīniskās mijiedarbības potenciāla novērtēšanai, citi mūsu pētījumā pārbaudītie 5-HT3 antagonisti, kā arī pretvemšanas līdzekļi, visticamāk, rada mazāku klīniski nozīmīgas zāļu mijiedarbības risku daudz zemākas terapeitiskās iedarbības dēļ. koncentrācijas plazmā un augstākas inhibīcijas konstantes.
4. Materiāli un metodes
4.1. Ķimikālijas
4-(4-(Dimetilamino)stiril)-N-metilpiridīnija jodīds (ASP plus ) tika iegādāts no Life Technologies (Grand Island, NY, ASV). Tropisetrons tika iegādāts no Abcam (Kembridža, MA, ASV). Visas pārējās ķīmiskās vielas ir no Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ASV).
4.2. Šūnu līnijas un šūnu kultūra
Tukša vektora (EV) kontroles (pcDNA{0}}transfektēta) un Flp-In cilvēka embrija nieres (HEK)293 šūnu līnijas, kas stabili ekspresē cilvēka MATE1 un OCT2 transportētājus, dāsni nodrošināja Dr. Ketija Džakomīni no Kalifornijas Universitātes Sanā. Fransisko. HEK293 šūnas tika kultivētas Dulbecco modificētajā ērgļa barotnē (DMEM), kas papildināts ar 10 procentiem liellopu augļa seruma, 2 mM L-glutamīna, 100 U/ml penicilīna, 100 ug/ml streptomicīna un 200 ug/ml. Vector higromicīna D3NA 1 plus un pcDNA3.1/Hygro( plus )) un cilvēka OCT2/MATE1 dubulttransfektētās Madin-Darby suņu nieru (MDCK) šūnu līnijas dāsni nodrošināja Dr. Džoanna Vanga no Vašingtonas Universitātes Sietlā, Vašingtonā. MDCK šūnas tika uzturētas minimālajā ēteriskajā barotnē (MEM), kas papildināta ar 10% liellopu augļa serumu, 500 ug/ml G418 un 200 ug/ml higromicīna B. Visas šūnu līnijas tika kultivētas mitrinātā inkubatorā 37oC temperatūrā ar 5% CO2.
4.3. Uzņemšanas un izplūdes inhibīcijas testi HEK293 šūnās
OCT2- un MATE1-pārāk ekspresējošās HEK293 šūnas tika iesētas skaidrās ar poli-D-lizīnu pārklātās 24-iedobju plāksnēs (Fisher Scientific, Hanover Park, IL, ASV) un audzētas 24 stundas. līdz aptuveni 90% saplūst. Pēc vienreizējas mazgāšanas ar iepriekš uzsildītu Henka buferēto sāls šķīdumu (HBSS), šūnas tika iepriekš inkubētas 30 minūtes 37oC temperatūrā ar dažādiem 5-HT3 antagonistiem OCT2 šūnām vai 30 mM NH4Cl šķīdumā HBSS pie pH 6,5 MATE1 šūnām intracelulārai lietošanai. paskābināšanās. Uzņemšana OCT2 šūnās tika uzsākta, pakļaujot 10 uM fluorescējoša substrāta ASP plus tieši inkubācijas vidē. Uzsūkšanās MATE1 šūnās tika uzsākta, uzklājot HBSS pie pH 7,4, kas satur 5-HT3 antagonistus un 10 uM fluorescējošo substrāta ASP plus . Pēc 1 minūtes inkubācijas 37oC temperatūrā uz kratītāja substrāta uzņemšana tika apturēta, pievienojot ledusaukstu HBSS, kas satur 500 uM cimetidīna. Barotne tika noņemta un četras reizes mazgāta ar ledusaukstu HBSS. Šūnas tika lizētas ar 1 procentu Triton X-100. Fluorescence tika noteikta, izmantojot Spectramax Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ASV) šādos viļņu garumos (ierosinājums 485 nm / emisija 495 nm). Intracelulārā fluorescence tika normalizēta līdz kopējai olbaltumvielu koncentrācijai šūnu lizātos no katras iedobes, izmantojot bicinhonīnskābes (BCA) testu (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, ASV). Eksperimenti tika atkārtoti trīs reizes ar trīs līdz četriem atkārtojumiem katrā eksperimentā.
4.4. Transvela pētījumi MDCK-OCT2/MATE1 šūnās
Control and OCT2/MATE1-expressing MDCK cells were evaluated for protein expression of OCT2 and MATE1 using SDS-PAGE and western blotting with specific primary antibodies (OCT2, sc292622 1:500 and MATE1, sc133390 1:250, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), followed by an antirabbit HRP-conjugated secondary antibody (1:1000, Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) and Super Signal Western Dura Extended Duration Substrate (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Detection was performed with a FluorChem imager (ProteinSimple, Santa Clara, CA, USA). Both MDCK cell lines were seeded on 0.4 um transwell inserts (VWR, Radnor, PA, USA) at a density of 2 × 105 cells/cm2. Transport experiments were performed 3 to 5 days after seeding. The integrity of MDCK monolayers was verified by measuring transepithelial electrical resistance (TEER) >150 o*cm2, izmantojot epitēlija voltu ommetru EVOM2 (World Precision Instruments, Sarasota, FL). Pareiza blīvu savienojumu veidošanās tika pārbaudīta arī, mērot luciferdzeltenā pasīvo caurlaidību bazolaterālā līdz apikālajam (B-to-A) virzienā. Lucifera dzeltenais (20 uM) tika uzklāts uz bazolaterālās kameras 1 stundu, un barotne tika savākta no apikālās kameras. Lucifera dzeltenā fluorescence tika nolasīta pie ierosmes viļņa garuma 430 nm un emisijas viļņa garuma 538 nm. Vidējās pasīvās caurlaidības (Papp) vērtības bija 7 × 10-7 cm/s, kas atbilst literatūras vērtībām [40].
Pēc šūnu vienreizējās mazgāšanas ar Henka buferēto sāls šķīdumu (HBSS) pH 7, 4, pēc mazgāšanas bufera aspirācijas gan no apikālās, gan bazālās kameras tika uzsākti transportēšanas pētījumi. Šūnas tika inkubētas ar 5-HT3 antagonistiem apikālajā kamerā HBSS pH 6.0 un 5-HT3 antagonistiem ar ASP plus (25 uM) bazolaterālajā kamerā HBSS pH 7,4 un inkubētas. 37 oC 120 min. Lai izmērītu no laika atkarīgu transcelulāro transportu, inkubācijas barotnes alikvota daļa (100 uL) no apikālās kameras (uztvērējkameras) tika savākta 40, 60, 90 un 120 minūtēs un aizstāta ar vienādu tilpumu svaiga buferšķīduma, kas satur {{ 19}}HT3 antagonists vai pozitīvās kontroles ķīmiskā viela sākotnējā koncentrācijā. Pēc 120 minūtēm apstrādes barotne tika noņemta, un Transwells trīs reizes nomazgāja ar ledus aukstu HBSS. Šūnas tika lizētas ar 1 procentu Triton X-100. Fluorescence tika noteikta, izmantojot Spectramax Microplate Reader pie šādiem viļņu garumiem (ierosinājums 485 nm/emisija 495 nm). Izmantojot BCA testu, intracelulārā fluorescence tika normalizēta līdz šūnu lizātu kopējai proteīna koncentrācijai no katras transwell. Eksperimenti tika veikti trīs atsevišķos Transwell ieliktņos.
4.5. Statistiskā analīze
Statistikas analīzei tika izmantota GraphPad Prism v6 (GraphPad Software, La Jolla, CA, ASV). Km un Vmax tika aprēķināti, izmantojot nelineāro regresiju (Mihaelisa-Mentena enzīmu kinētikas vienādojums, (Y=Vmax × X/(Km plus X), piemērots mazākajiem kvadrātiem).) Dati ar diviem mainīgajiem tika analizēti, izmantojot divu mainīgo. ANOVA veids, kam seko vienvirziena ANOVA un/vai Daneta posthoc tests vairākiem salīdzinājumiem. IC50 vērtības tika aprēķinātas, izmantojot nelineāru regresiju, lai atbilstu mazākajiem kvadrātiem. Atšķirības tika uzskatītas par statistiski nozīmīgām, ja p <>
Papildu materiāli:Tālāk norādītais ir pieejams tiešsaistē vietnē https://www.mdpi.com/article/10 .3390/ijms22126439/s1.
Autora ieguldījums:Konceptualizācija, BG, MSJ, LMA; metodoloģija, BG, XW; formālā analīze, BG, LMA; resursi, LMA; rakstīšana — oriģinālā projekta sagatavošana, BG, LMA; rakstīšana — apskats un rediģēšana, MSJ, LMA; projektu administrācija, LJA; finansējuma iegūšana, MSJ, EAJ, LMA Visi autori ir izlasījuši un piekrituši publicētajai manuskripta versijai.
Finansējums:Šo pētījumu finansēja Nacionālais vispārējo medicīnas zinātņu institūts (Grant GM123330) un Nacionālais Vides veselības zinātņu institūts (dotācijas ES005022, ES007148), Nacionālais vēža institūts (granti CA072720, CA046934, CA008748) un Nacionālais diabēta un Gremošanas un nieru slimības (Grant DK093903), Nacionālo veselības institūtu sastāvdaļas.
Institucionālās pārbaudes padomes paziņojums: nav piemērojams.
Informētas piekrišanas paziņojums:Nav piemērojams.
Paziņojums par datu pieejamību:Nav piemērojams.
Pateicības:Mēs ļoti novērtējam dāsnās HEK293 transportētāja šūnu līnijas no Kathy Giacomini un transfektētās MDCK šūnu līnijas no Džoanas Vangas.
Interešu konflikti:Autori paziņo, ka nav interešu konflikta.
Atsauces
1. Acara, M.; Rennick, B. Organisko katjonu divfāzu ietekme uz citu organisko katjonu izdalīšanos. J. Pharmacol. Exp. Tur. 1976, 199, 32–40. [PubMed]
2. Holohans, PD; Ross, CR Organisko katjonu transporta mehānismi nieru plazmas membrānas pūslīšos: 1. Prettransporta pētījumi. J. Pharmacol. Exp. Tur. 1980, 215, 191–197.
3. Kinsella, JL; Holohans, PD; Pessah, NI; Ross, CR Organisko jonu transportēšana nieru garozas luminālās un antiluminālās membrānas pūslīšos. J. Pharmacol. Exp. Tur. 1979, 209, 443–450.
4. Volds, JS; Miller, BL Organisko jonu izplūdes kavēšana no nieru garozas šķēlītēm. Experientia 1978, 34, 630–631. [CrossRef] [PubMed]
5. Gesners, A.; Kēnigs, J.; Fromm, MF Transportera mediētu zāļu un zāļu mijiedarbības klīniskie aspekti. Clin. Pharmacol. Tur. 2019, 105, 1386–1394. [CrossRef]
6. Smits, HS; Kokss, LR; Smith, EJ 5-HT3 receptoru antagonisti sliktas dūšas/vemšanas ārstēšanai. Ann. Palliat. Med. 2012, 1., 115.–120. [CrossRef] [PubMed]
7. Kostāls, B.; Gunnings, SJ; Neilors, RJ; Tyers, MB Jaunā 5-HT3-receptoru antagonista GR38032F ietekme uz kuņģa iztukšošanos jūrascūciņām. Br. J. Pharmacol. 1987, 91, 263–264. [CrossRef]
8. Kriss, MG; Gralla, RJ; Klārks, RA; Tyson, LB. Serotonīna antagonista GR-C507/75 (GR38032F) devas noteikšana, ja to lieto kā pretvemšanas līdzekli pacientiem, kuri saņem pretvēža ķīmijterapiju. Dž.Klins. Oncol. 1988, 6, 659–662. [CrossRef]
9. Tricco, AC; Blondāls, E.; Veronika, AA; Soobiah, C.; Vafaei, A.; Ivory, J.; Strifler, L.; Kardoso, R.; Reinens, E.; Ninčiks, V.; un citi. Serotonīna receptoru antagonistu salīdzinošā drošība un efektivitāte pacientiem, kuriem tiek veikta ķīmijterapija: sistemātisks pārskats un tīkla metaanalīze. BMC Med. 2016, 14, 216. [CrossRef]
10. Boelig, RC; Bārtons, SJ; Sakons, G.; Kellija, AJ; Edvards, SJ; Berghella, V. Intervences, lai ārstētu hyperemesis gravidarum: Cochrane sistemātisks pārskats un metaanalīze. J. Matern. Fetal Neonatal Med. 2018, 31, 2492–2505. [CrossRef]
11. Hake, N.; Naqvi, RM; Dasgupta, M. Ondansetrona efektivitāte pēcoperācijas delīrija profilaksē vai ārstēšanā — sistemātisks pārskats. Var. Geriatr. J. 2019, 22, 1.–6. [CrossRef] [PubMed]
12. Makparlins, C.; O'Donels, A.; Robsons, SC; Beijers, F.; Molonijs, E.; Braients, A.; Bredlijs, Dž.; Muirhead, CR; Nelsons-Pīrsijs, C.; Ņūberija-Bērzs, D.; un citi. Hyperemesis Gravidarum un sliktas dūšas un vemšanas ārstēšana grūtniecības laikā: sistemātisks pārskats. JAMA 2016, 316, 1392–1401. [CrossRef] [PubMed]
13. Van, V.; Džou, L.; Sun, L. Ondansetrons par neiraksiālo morfīna izraisītu niezi: Randomizētu kontrolētu pētījumu metaanalīze. Dž.Klins. Pharm. Tur. 2017, 42, 383–393. [CrossRef]
14. Jokojs, A.; Mihara, T.; Ka, K.; Goto, T. Ramosetrona un ondansetrona salīdzinošā efektivitāte pēcoperācijas sliktas dūšas un vemšanas novēršanā: atjaunināts sistemātisks pārskats un metaanalīze ar izmēģinājumu secīgu analīzi. PLoS ONE 2017, 12, e0186006. [CrossRef]
15. Morze, BL; Kolurs, A.; Hadsons, LR; Hogans, AT; Čens, LH; Brekmens, RM; Savada, GA; Falons, JK; Smits, dators; Hillgren, KM Organisko katjonu transportētāja 1 (OCT1) substrātu farmakokinētika 1./2. oktobra izsitumu pelēm un sugu atšķirības aknu OCT{5}}izmantotajā uzņemšanā. Narkotiku Metab. Dispos. 2020, 48, 93–105. [CrossRef] [PubMed]
16. Cvetkovs, MV; Saadatmanda, AR; Bokelmans, K.; Meineke, I.; Kaizers, R.; Brockmoller, J. OCT1 polimorfismu ietekme uz 5-HT(3) antagonistu tropisetrona un ondansetrona uzņemšanu šūnās, koncentrāciju plazmā un efektivitāti. Farmakogenomika. J. 2012, 12, 22.–29. [CrossRef] [PubMed]
17. Žu, P.; Jā, Z.; Guo, D.; Sjons, Z.; Huangs, S.; Guo, J.; Džans, V.; Polli, JE; Džou, H.; Li, Q.; un citi. Irinotekāns maina morfīna izvietojumu, inhibējot organisko katjonu transportētāju 1 (OCT1) un 2 (OCT2). Pharm. Res. 2018, 35, 243. [CrossRef]
18. Kido, Y.; Matsons, P.; Giacomini, KM Recepšu medikamentu bibliotēkas profilēšana iespējamai nieru zāļu un zāļu mijiedarbībai, ko izraisa organisko katjonu transportētājs 2. J. Med. Chem. 2011, 54, 4548–4558. [CrossRef] [PubMed]
19. Li, Q.; Guo, D.; Dongs, Z.; Džans, V.; Džans, L.; Huana, SM; Polli, JE; Shu, Y. Ondansetrons var pastiprināt cisplatīna izraisītu nefrotoksicitāti, inhibējot vairākus toksīnus un ekstrūzijas proteīnus (MATE). Toksikols. Appl. Pharmacol. 2013., 273., 100.–109. [CrossRef]
20. Wittwer, MB; Zur, AA; Khuri, N.; Kido, Y.; Kosaka, A.; Džans, X.; Morisejs, KM; Sali, A.; Huangs, Y.; Giacomini, KM Spēcīgu, selektīvu vairāku zāļu un toksīnu ekstrūzijas transportera 1 (MATE1, SLC47A1) inhibitoru atklāšana, izmantojot recepšu zāļu profilēšanu un skaitļošanas modelēšanu. J. Med. Chem. 2013, 56, 781–795. [CrossRef] [PubMed]