Gļotādas imunitātes indukcija, ievadot plaušās uz šūnu mērķētas nanodaļiņas

KOPSAVILKUMS

Iepriekš mēs noskaidrojām, ka nanodaļiņai, kas konstruēta ar antigēnu, benzalkonija hlorīdu (BK) un c-poliglutamīnskābi (c-PGA), pēc subkutānas ievadīšanas bija augsta Th1 un Th2- tipa imūnās indukcija. Tomēr elpceļu infekciju profilaksei ir jāizraisa gļotādas imunitāte. Šajā pētījumā mēs pētījām nanodaļiņu, kas satur ovalbumīnu (OVA) kā modeļa antigēnu, BK un c-PGA, ievadīšanas plaušās ietekmi uz gļotādas imunitātes indukciju plaušās un serumā.

Kompleksu spēcīgi pārņēma RAW264.7 un DC2.4 šūnas. Pēc ievadīšanas plaušās OVA/BK/c-PGA kompleksam plaušu aizture bija ilgāka nekā tikai OVA. Komplekss ļoti inducēja OVA specifisko seruma imūnglobulīnu (Ig) G. Augsts IgG un IgA līmenis tika izraisīts arī bronhoalveolārajā skalošanas šķidrumā, un in vivo toksicitāte netika novērota. Visbeidzot, mēs efektīvi un droši izraisījām gļotādas imunitāti, ievadot OVA / BK / c-PGA kompleksu plaušās.

Pēdējos gados arvien vairāk pētījumu liecina, ka gļotādas imunitātei ir svarīga loma organisma imūnsistēmā. Gļotādas imunitāte attiecas uz cilvēka ķermeņa imūnsistēmu, kuras pamatā ir gļotādas, un tās aizsardzības spējas galvenokārt ir vērstas uz patogēnu invāziju cilvēka gļotādās, piemēram, elpošanas traktā, gremošanas traktā un reproduktīvajā traktā.

Gļotādas imunitāte pati par sevi nepadara organismu imūnāku, taču tā var palīdzēt mūsu organismam efektīvāk tikt galā ar svešu patogēnu invāziju. Nepārtraukti stimulējot gļotādas imunitāti, mūsu ķermenis ražo vairāk antivielu, kas uzlabo mūsu imunitāti.

Tātad, kā var stimulēt gļotādas imunitāti? Šeit ir daži ieteikumi:

1. Uzņemiet pietiekami daudz C vitamīna. C vitamīns ir dabisks antioksidants, kas uzlabo imūno šūnu darbību, kas palīdz cīnīties ar infekcijām. Augļi un zaļie lapu dārzeņi, piemēram, citroni, apelsīni un zemenes, ir bagāti ar C vitamīnu.

2. Palieliniet pienskābes baktēriju uzņemšanu. Pienskābes baktērijas var veicināt zarnu floras līdzsvaru un kavēt kaitīgo baktēriju augšanu. Parastie pienskābes baktēriju pārtikas produkti ir jogurts, skābēti kāposti, kimchi utt.

3. Praktizējiet elpošanu Dziļi ieelpojiet. Dziļa elpošana palielina skābekļa piegādi un ventilāciju plaušās, kas var palīdzēt izvadīt no plaušām uzkrātos patogēnus.

Īsāk sakot, gļotādas imunitātes stimulēšana ir svarīgs līdzeklis imunitātes uzlabošanai. Mums vajadzētu darīt visu iespējamo, lai uzlabotu mūsu gļotādas imunitāti ar diētu un dzīves paradumiem, lai aizsargātu savu veselību. No šī viedokļa mums ir jāuzlabo imunitāte. Cistanche var ievērojami uzlabot imunitāti, jo gaļas pelni satur dažādus bioloģiski aktīvus komponentus, piemēram, polisaharīdus, divas sēnes un Huang Li, kas var stimulēt imūnsistēmu. Dažāda veida šūnas, palielina to imūno aktivitāti.

Noklikšķiniet uz cistanche deserticola papildinājuma

1. Ievads

Akūtas elpceļu infekcijas gandrīz noteikti ir galvenais nāves cēlonis bērniem, kas jaunāki par 5 gadiem jaunattīstības valstīs (Williams et al., 2002). Elpceļu infekcijām ir izstrādātas vairākas vakcīnas, piemēram, pret gripu, garo klepu un pneimokoku (White, 1988; Pittman, 1991; Chen et al., 2020). Lielākā daļa šo vakcīnu tiek ievadītas intramuskulāri un subkutāni, kas varētu efektīvi inducēt seruma imūnglobulīna (Ig)G. Tomēr citi ceļi ir noderīgāki, lai stimulētu gļotādas imunitāti akūtu elpceļu infekciju profilaksei. Ir ziņots, ka gļotādas ievadīšana, piemēram, intranazāla un plaušu, efektīvi inducē gļotādas IgA un novērš elpceļu infekcijas (Giri et al., 2005; Ainai et al., 2017).

No otras puses, vakcīnas intranazālai un plaušu ievadīšanai nedrīkst saturēt adjuvantus, par kuriem ziņots, ka tie ievadīšanas vietā izraisa iekaisuma reakcijas un čūlas (Tamura et al., 1988; McKee et al., 2007). Vēl viena pieeja, lai uzlabotu vakcīnu efektivitāti bez adjuvantiem, ir izstrādāt sistēmu, kas var efektīvi ievadīt vakcīnas gļotādas antigēnu prezentējošās šūnās (APC).

Iepriekšējā pētījumā mēs izstrādājām jaunu vakcīnas ievadīšanas vektoru, kas konstruēts ar antigēnu, benzalkonija hlorīdu (BK) un c-poliglutamīnskābi (c-PGA). Komplekss, kas satur ovalbumīnu (OVA) kā modeļa antigēnu, BK un c-PGA (OVA/BK/c-PGA komplekss) efektīvi nogādāja OVA dendrītu šūnās un uzlaboja OVA specifisko seruma IgG indukciju pēc subkutānas ievadīšanas pelēm (Kurosaki et al. ., 2012). Šī pētījuma mērķis bija izpētīt OVA / BK / c-PGA kompleksa plaušu ievadīšanas ietekmi uz gļotādas imunitātes indukciju plaušās un serumā.

2. Materiāli un metodes

2.1. Ķimikālijas

OVA tika iegādāta no Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ASV). BK tika iegūts no Nacalai Tesque, Inc. (Kioto, Japāna). C-PGA nodrošināja Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. (Tokija, Japāna). Ar fluoresceīna izotiocianātu iezīmētā OVA (FITC-OVA) un Alexa Fluor 647-marķētā OVA (Alexa647- OVA) tika iegūta no Invitrogen (Carls, CA, ASV). Liellopu augļa serums (FBS) tika iegādāts no Biological Industries Ltd. (Kibbutz Beit Haemek, Izraēla). OPTI-MEM I tika iegūts no GIBCO BRL (Grand Island, NY, ASV), un premiksa antibiotiku šķīdums, kas satur penicilīnu, streptomicīnu un L-glutamīnu, tika iegūts no Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japāna). Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) un RPMI1640 barotne tika iegūta no Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. (Tokija, Japāna).

2.2. Sarežģīta sagatavošana

Iepriekš mēs izveidojām OVA/BK/c-PGA kompleksu ar svara attiecību 1:0.2:0.2 (Kurosaki et al., 2012). Lai pagatavotu OVA/BK kompleksu, atbilstošs daudzums BK šķīduma (pH 5.{11}}), kas izšķīdināts 5 procentos glikozē, tika sajaukts ar OVA šķīdumu (pH 7.0), kas izšķīdināts 5 procentos glikozes un atstāja uz 15 minūtēm 4 C temperatūrā. Lai OVA/BK kompleksu pārklātu ar c-PGA, OVA/BK kompleksam pievienoja c-PGA šķīdumu (pH 7,0), kas izšķīdināts 5 procentos glikozes, un atstāja vēl 15 minūtes plkst. 4 C. Katra kompleksa daļiņu izmērs un f-potenciāls tika mērīts, izmantojot Zetasiser Nano ZS (Malvern Instruments, Ltd., Malvern, UK).

2.3. Šūnas

Tika izmantota peles makrofāgu šūnu līnija RAW264.7 un dendritisko šūnu līnija DC2.4. RAW264.7 šūnas tika audzētas DMEM, kas papildināts ar 10 procentiem FBS un antibiotikām. DC2.4 šūnas tika audzētas RPMI1640 barotnē, kas papildināta ar 10% FBS, antibiotikām, 1 mM neaizvietojamām aminoskābēm un 1 nM 2-merkaptoetanolu. Šīs šūnas tika novērtētas mitrinātā atmosfērā ar 5% CO2 gaisā 37 ° C temperatūrā.

2.4. In vitro šūnu uzņemšanas eksperiments

RAW264.7 šūnas un DC2.4 šūnas tika izklātas uz 24-iedobju plāksnēm (Corning, NY, ASV) ar blīvumu 2.0 104 šūnas/iedobē un kultivētas 50{ {21}} ml barotnes. Pēc 24- h iepriekšējas inkubācijas barotne tika aizstāta ar OPTI-MEM I barotni, un šūnas 2 stundas inkubēja ar 5 mg FITC-OVA un kompleksu, kas satur 5 mg FITC-OVA. Pēc inkubācijas šīs šūnas tika mazgātas ar PBS un novērotas fluorescējošā mikroskopā (BIOREVO BZ-9000; Keyence Co., Osaka, Japāna). Pēc novērošanas šīs šūnas tika lizētas 300 lL līzes buferšķīduma (pH 7,8 un 0,1 M Tris/HCl buferšķīdums, kas satur 0,05 procentus Triton X-100 un 2 mM EDTA). Lizāti tika ievietoti 96-iedobju plāksnēs, un FITC-OVA fluorescence tika mērīta pie emisijas viļņa garuma 530 nm ar ierosmes viļņa garumu 480 nm, izmantojot fluorometrisko mikroplašu lasītāju (Infinite-200Pro). M-Plex, Tecan Japan Co., Ltd., Kanagawa, Japāna). Lizāta olbaltumvielu saturs tika noteikts ar Bredforda testu, izmantojot BSA kā standartu. Absorbcija tika mērīta, izmantojot mikroplašu lasītāju pie 570 nm. FITC-OVA uzņemšana tika norādīta kā mg uz mg proteīna.

2.5. Dzīvnieki

Dzīvnieku kopšana un eksperimentālās procedūras tika veiktas saskaņā ar Nagasaki universitātes dzīvnieku eksperimentēšanas vadlīnijām ar Institucionālās dzīvnieku aprūpes un lietošanas komitejas apstiprinājumu. C57BL/6N peles tēviņi (5 nedēļas veci) tika iegādāti no Japānas SLC (Shizuoka, Japāna). Pēc transportēšanas pelēm 1 dienu pirms eksperimentiem ļāva aklimatizēties jaunajā vidē. Ievadīšana plaušās (40 ml) tika veikta, izmantojot mēles nospiedēju ar gaismu ar spontānu elpošanu pelēm, kas tika anestēzētas, ieelpojot izoflurānu (Horiguchi et al., 2015).

2.6. Kompleksa uzkrāšanās plaušās

Lai pārbaudītu OVA uzkrāšanos, 40 mg Alexa647-OVA un kompleksu, kas satur 40 mg Alexa647- OVA ar tilpumu 40 ml uz vienu peli, pelēm ievadīja ar plaušu palīdzību. Sešas dienas pēc ievadīšanas peles tika nogalinātas un plaušas tika izgrieztas. Alexa647-OVA fluorescējošā intensitāte peles plaušās tika novērota ar Xenogen IVIS Lumina sistēmu, kas savienota ar Living Image programmatūru datu iegūšanai (Xenogen, Co, Almeda, CA, ASV). Pēc novērošanas šīs plaušas tika homogenizētas ar līzes buferšķīdumu un homogenāti tika centrifugēti pie 15, 000 apgr./min (Kubota-3500, Kubota Corporation, Tokija, Japāna) 5 minūtes un Alexa647 fluorescence šajos supernatantos. tika noteikts ar mikroplates līderi pie ierosmes un emisijas viļņa garuma attiecīgi 640 un 670 nm.

2.7. Imunizācija

Peles tika imunizētas ar 5 procentu glikozes šķīdumu, 40 mg OVA, tukšu 8 mg BK un 8 mg c-PGA kompleksu (nesējs) un OVA/BK/c-PGA kompleksu, kas satur 40 mg OVA, ievadot plaušās, 4 reizes. iknedēļas. Divas nedēļas pēc pēdējās imunizācijas tika iegūts bronhoalveolārais skalošanas šķidrums (BALF) un serums. BALF un serums tika izmantoti ar enzīmu saistītā imūnsorbcijas testa (ELISA) testos.

2.8. OVA specifisko antivielu indukcijas noteikšana

OVA pārklājumam katrā ELISA plākšņu iedobē tika pievienots 100 ml OVA šķīduma (10 mg/ml, 1 M nātrija hidrogēnkarbonātā) (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ASV). un inkubēja nakti 4 °C temperatūrā. Plāksnes trīs reizes nomazgāja ar fosfātu buferšķīdumu, kas satur 0,05 procentus Tween-20 (PBST), 200 ml bloķējošā reaģenta N 102 (Nichiyu, Co., Ltd., Tokija, Japāna). ) pievieno, lai bloķētu nespecifisko saistīšanos, un pēc tam inkubēja 6 stundas 4 °C temperatūrā. Plāksnes divas reizes mazgāja ar PBST. Pēc tam katrai iedobei pievienoja 100 ml 1000-kārtīgi atšķaidīta seruma un neatšķaidītu BALF paraugu alikvotas daļas un inkubēja nakti 4 °C temperatūrā. Pēc piecām mazgāšanas reizēm ar PBST 100 ml mārrutku peroksidāzes (HRP) – konjugētas kazas antivielas. -peles IgG, IgA, IgM, IgE, IgG1, IgG2a, IgG2b un IgG3 (1:10, 000) (Abcam, Kembridža, UK) – tika pievienoti katrai iedobei un inkubēti istabas temperatūrā 1 stundu un pēc tam piecas reizes mazgā ar PBST. TMB One šķīdums (Promega, WI, ASV) tika izmantots un sagatavots saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Pēc tam reakciju apturēja pēc 15 minūtēm, pievienojot 1 N sālsskābi. Absorbcija tika nolasīta pie 450 nm, izmantojot mikroplašu lasītāju.

2.9. OVA/BK/c-PGA kompleksa toksicitāte in vivo

OVA un OVA/BK/c-PGA komplekss pelēm tika ievadīts pa plaušu ceļu. BALF tika iegūts 3 un 24 stundas pēc ievadīšanas no pelēm. Divdesmit četras stundas pēc ievadīšanas tika izdalītas arī plaušas. Laktātdehidrogenāzes (LDH) aktivitāte BALF tika mērīta, izmantojot QuantiChromTM laktāta dehidrogenāzes komplektu (BioAssay Systems, CA, ASV) saskaņā ar fabrikas norādījumiem. Plaušu paraugi tika fiksēti 4 procentu paraformaldehīda fosfāta buferšķīdumā. Sadalīšana un hematoksilīna-eozīna (HE) krāsošana tika uzticēta GenoStaff (Tokija, Japāna). Ar HE krāsotas plaušu daļas tika novērotas ar mikroskopiju ar palielinājumu 20.

2.10. Statistiskā analīze

Atšķirību statistiskais nozīmīgums starp abām grupām tika novērtēts, veicot Stjudenta t-testu. Veicot Tukey testu, tika veikti vairāki grupu salīdzinājumi. Tika uzskatīts, ka p-vērtības < 0,05 liecina par statistisko nozīmīgumu.

3. Rezultāti

3.1. Kompleksa fizikāli ķīmiskās īpašības

Mēs izveidojām anjonu OVA/BK/c-PGA kompleksu ar svara attiecību 1:0.2:0.2. Ar c-PGA pārklātā kompleksa daļiņu izmērs bija aptuveni 105,4 nm un f-potenciāls aptuveni 35,5 mV.

3.2. Kompleksa uzņemšana šūnās

RAW264.7 šūnas un DC2.4 šūnas tika apstrādātas ar FITC-OVA un FITC-OVA/BK/c-PGA kompleksu, un tika vizualizēta FITC-OVA uzņemšana šūnās, kā parādīts 1. attēlā. FITC-OVA/BK/ c-PGA kompleksu ļoti uzņēma RAW264.7 šūnas un DC2.4 šūnas, un tika novērota spēcīga FITC-OVA zaļā fluorescence (attiecīgi 1. attēls (A, B). Tajā pašā laikā abās ar FITC-OVA apstrādātajās šūnās tika novērots neliels FITC-OVA daudzums.

FITC-OVA uzņemšana šūnās tika kvantitatīvi noteikta RAW264.7 šūnās un DC2.4 šūnās (1. attēls (C)). FITC-OVA/BK/c-PGA komplekss uzrādīja ievērojami lielāku uzņemšanu nekā FITC-OVA abās šūnās (p < 0,01).

3.3. Alexa647-OVA uzkrāšanās plaušās pēc ievadīšanas plaušās

Alexa647-OVA un Alexa647-OVA/BK/c-PGA komplekss tika ievadīts pelēm plaušās, lai noteiktu Alexa647-OVA kā antigēna uzkrāšanos plaušās. 6 dienas pēc ievadīšanas plaušas tika sadalītas, un to fluorescences intensitāte tika vizualizēta, izmantojot Xenogen IVIS Lumina System. Ex vivo fluorescējošais attēls ir parādīts 2. attēlā (A). Augsta fluorescences intensitāte tika novērota visā plaušās 6 dienas pēc ievadīšanas plaušās, lai gan liesā, sirdī, nierēs un aknās nebija fluorescences intensitātes (dati nav parādīti). 6. dienā Alexa647-OVA/BK/c-PGA kompleksam plaušās akumulācija bija augstāka nekā Alexa647-OVA. Kā parādīts 2. attēlā (B), Alexa akumulācija plaušās bija ievērojami lielāka. 647-OVA/BK/c-PGA komplekss nekā Alexa647- OVA (p < 0,05).

3.4. OVA specifiskā antiviela serumā pēc kompleksa ievadīšanas plaušās

5% glikozes šķīdums, BK/c-PGA komplekss (nesējs), OVA un OVA/BK/c-PGA komplekss tika ievadīts pelēm četras reizes, un pēc tam serumā tika ievadīts OVA specifiskais IgG, IgA, IgM, un IgE tika noteikts ar ELISA, kā parādīts 3. attēlā. OVA un OVA/BK/c-PGA kompleksa ievadīšana plaušās palielināja IgG līmeni pelēm, lai gan pelēm, kurām tika ievadīti 5 procenti glikozes un nesēja, netika konstatēts OVA specifiskais IgG. Turklāt IgG un IgA ražošana pēc OVA/BK/c-PGA kompleksa ievadīšanas bija ievērojami augstāka nekā pēc OVA ievadīšanas (p < 0,05 vai 0,01). No otras puses, OVA vai OVA / BK / c-PGA komplekss neizraisīja OVA specifisko IgM un IgE.

3.5. OVA specifiskā antiviela BALF pēc kompleksa ievadīšanas plaušās

Tika noteikts arī OVA specifiskais IgG, IgA, IgM un IgE BALF, kā parādīts 4. attēlā. IgG līmeni būtiski paaugstināja OVA, salīdzinot ar līmeni pēc kontroles un nesēja ievadīšanas (p < ,05 vai .01). Neskatoties uz to, OVA/BK/c-PGA komplekss būtiski palielināja ne tikai IgG, bet arī IgA BALF (p < 0,01). Tomēr OVA vai OVA/BK/c-PGA komplekss neizraisīja OVA specifisko IgM un IgE.

3.6. IgG apakštipi serumā pēc kompleksa ievadīšanas plaušās

OVA specifisko IgG apakštipu, piemēram, IgG1, IgG2a, IgG2b un IgG3 indukcijas iedarbība serumā tika noteikta, kā parādīts 5. attēlā. Salīdzinot ar kontroli un nesēju, OVA būtiski palielināja tikai IgG1 (p < .01). Visu apakštipu antivielu līmenis, ko izraisīja OVA/BK/c-PGA komplekss, bija ievērojami augstāks nekā kontroles un nesēja izraisītais līmenis (p < 0,05 vai 0,01).

3.7. IgG apakštipi BALF pēc kompleksa ievadīšanas plaušās

Tika noteikti arī OVA specifiskie IgG apakštipi, piemēram, IgG1, IgG2a, IgG2b un IgG3 BALF, kā parādīts 6. attēlā. OVA būtiski palielināja tikai IgG1 līmeni, salīdzinot ar tiem, ko izraisīja kontrole un nesējs (p < .01). . Salīdzinot ar kontroli, nesēju un OVA, OVA/BK/c-PGA komplekss izraisīja ievērojami augstāku antivielu līmeni visos apakštipos (p < 0,05 vai 0,01).

3.8. OVA/BK/c-PGA kompleksa toksicitāte in vivo

Pelēm tika ievadīts 5 procentu glikozes šķīdums, OVA un OVA/BK/c-PGA komplekss. LDH aktivitāte BALF tika noteikta 3 vai 24 stundas pēc ievadīšanas (7. attēls). OVA un OVA/BK/c-PGA kompleksa ievadīšana maz ietekmēja LDH līmeni BALF.

Divdesmit četras stundas pēc ievadīšanas no šīm pelēm tika atdalītas plaušas histoloģiskai analīzei. Ar HE iekrāsotas plaušu sekcijas ir parādītas 8. attēlā. Pelēm, kas tika ārstētas ar OVA un OVA/BK/c-PGA kompleksu, netika novērotas histoloģiskas novirzes.

4. Diskusija

Plaušas kontrolē elpošanu un ir pakļautas daudziem patogēniem, piemēram, vīrusiem un baktērijām, kas izraisa elpceļu infekcijas. Šie patogēni inficējas caur plaušu gļotādu, tāpēc, lai aizsargātu pret elpceļu infekcijām, ir jārada gļotādas imunitāte. Novērst elpceļu infekcijas, svarīga loma ir gļotādas imunitātei; tomēr vakcīnas intradermāla un intramuskulāra ievadīšana nevar spēcīgi stimulēt gļotādas imunitāti (Ito et al., 2003; Amorij et al., 2007). Gļotādas imūnsistēma, kas inducē sekrēcijas IgA, veidojas uz gļotādas virsmas. Ir ziņots, ka vairākas APC, piemēram, dendrītiskās šūnas un makrofāgi, atrodas gļotādas virsmā (Kopf et al., 2015). Turklāt ar bronhiem saistītie limfoīdie audi (BALT) ir atrodami bronhu gļotādā un ir limfoīds folikuls, kam ir galvenā loma elpceļu gļotādas imunitātē (Bienenstock, 1980). Paredzams, ka vakcīnas ievadīšana plaušās efektīvi stimulēs gļotādas imūnsistēmu. Tāpēc mēs izveidojām OVA / BK / c-PGA kompleksu, lai novērtētu tā kā vakcīnas lietderību, ko ievada caur plaušu ceļu.

4. attēlā parādīta OVA specifisko antivielu BALF koncentrācija pēc OVA un OVA/BK/c-PGA kompleksa ievadīšanas plaušās. OVA ievadīšana plaušās palielināja IgG, bet maz ietekmēja IgA BALF. No otras puses, OVA / BK / c-PGA komplekss ievērojami izraisīja IgA sekrēciju BALF. Turklāt IgG indukcija serumā bija ievērojami augstāka pēc OVA/BK/c-PGA kompleksa ievadīšanas nekā pēc OVA ievadīšanas (3. attēls). Seruma IgG ir svarīgs, lai novērstu jebkādu infekciju saasināšanos (Huber et al., 2006; Schroeder & Cavacini, 2010). Rezultāti liecina, ka OVA / BK / c-PGA komplekss var novērst elpceļu infekcijas ar augstu gļotādas IgA indukciju un elpceļu infekcijas saasināšanos ar augstu IgG indukciju serumā. Turklāt OVA/BK/c-PGA kompleksa IgE indukcija netika novērota, un šis rezultāts liecināja par nelielu OVA/BK/c-PGA kompleksa alerģiskas reakcijas risku.

OVA/BK/c-PGA komplekss var arī inducēt ne tikai IgG1 un IgG2b, bet arī IgG2a un IgG3 (5. attēls). IgG1 un IgG2b ir zināmi kā Th2-tipa imūnglobulīni, kas mediē humorālo imūnreakciju, un IgG2a un IgG3 ir zināmi kā Th1-tipa imūnglobulīni, kas mediē šūnu imūnreakciju (Firacative et al., 2018). . Tāpēc OVA / BK / c-PGA komplekss var izraisīt gan humorālās, gan šūnu imūnās atbildes. Šie rezultāti liecina, ka šī sistēma varētu būt noderīga vakcīnām pret infekcijām, kā arī pret vēzi. Profilaktiskā iedarbība, antigēnu izraisītas Th1- un Th2-tipa citokīnu atbildes reakcijas inducējamā BALT, Treg populācijā un IL-10 indukcijā turpmāk jānovērtē, izmantojot reālus infekciju vai vēža antigēnus. pētījumiem.

Spēcīgajai imūnās atbildes reakcijas indukcijai ar OVA/BK/c-PGA kompleksu ir jābūt saistītai ar kompleksa augsto aizturi plaušās un efektīvu OVA piegādi plaušu gļotādās esošajos APC. Mūsu rezultāti to apstiprināja, parādot, ka 6 dienas pēc ievadīšanas Alexa647-OVA/BK/c-PGA komplekss palika plaušās un uzrādīja ievērojami augstāku fluorescenci nekā Alexa647- OVA (2. attēls). Kompleksa veidošanās var novērst OVA difūziju un aizsargāt OVA no proteāžu noārdīšanās plaušu gļotādā. Turklāt OVA/BK/c-PGA komplekss spēja efektīvi piegādāt OVA RAW264.7 makrofāgu šūnās un DC2.4 dendritiskajās šūnās (1. attēls). Šie rezultāti liecināja, ka OVA / BK / c-PGA kompleksu uzņems alveolārie APC un izraisīs augstu imūnreakciju pēc ievadīšanas plaušās. Ir ziņots, ka ar c-PGA pārklātas nanodaļiņas tika uzņemtas ar gamma-glutamiltranspeptidāzes mediētu endocitotisko ceļu (Du et al., 2015). Mēs arī apstiprinājām, ka ar c-PGA pārklātās nanodaļiņas tika uzņemtas c-PGA specifiskajā endocitozes ceļā (Kurosaki et al., 2009). OVA/BK/c-PGA kompleksu var uzņemt APC plaušās, izmantojot tos pašus mehānismus. Tomēr joprojām nav skaidrs, kuras šūnas ir atbildīgas par OVA uzņemšanu un sekojošu antigēna prezentāciju specifiskas imunitātes indukcijā. Nākotnē būtu jāveic turpmāki pētījumi par detalizētiem imūnās indukcijas mehānismiem.

Ir izstrādāti daudzi adjuvanti, lai uzlabotu vakcīnu efektivitāti; tomēr ziņots, ka adjuvanti injekcijas vietā izraisa iekaisuma reakcijas (Tamura et al., 1988; McKee et al., 2007). Tāpēc adjuvantu ievadīšana plaušās var izraisīt smagas blakusparādības, piemēram, pneimoniju. Pēc OVA/BK/c-PGA kompleksa ievadīšanas plaušās LDH līmenis BALF nepaaugstinājās (7. attēls), un ar HE iekrāsotajā sadaļā netika novērotas histoloģiskas novirzes (8. attēls). Tiek ziņots, ka c-PGA ir bioloģiski saderīgs un bioloģiski noārdāms polimērs, kas neuzrāda imūnsistēmas iekaisuma reakcijas (Prodhomme et al., 2003; Ye et al., 2006). BK ir drošs kvartāra amonija savienojums, kas klīniski plaši izmantots kā pretmikrobu piedeva (Marple et al., 2004). Šie ziņojumi atbalsta arī OVA/BK/c-PGA kompleksa drošību. No otras puses, augstāks LDH līmenis tika novērots 3 stundas pēc ievadīšanas plaušās nekā 24 stundās, pat kontroles grupā. Šie rezultāti liecina, ka plaušu ievadīšana izraisīja nelielu kairinājumu. Pirms OVA/BK/c-PGA kompleksa klīniskās lietošanas ir nepieciešami turpmāki drošības pētījumi.

Šajā pētījumā mēs parādījām augstu gļotādas imūnsistēmas indukciju ar jaunu vakcīnas ievadīšanas vektoru, kas konstruēts ar antigēna proteīnu, BK un c-PGA pēc ievadīšanas plaušās. Sistēmu var izmantot vakcīnām pret dažādām elpceļu infekcijām.

Izpaušanas paziņojums

Autors(-i) nav ziņojis par potenciālu interešu konfliktu.

Finansējums

Šo darbu atbalstīja Japānas Zinātnes veicināšanas biedrība (JSPS) KAKENHI ar dotācijām [JP20K12649 un JP20K07156].

Atsauces

1.Ainai A, Suzuki T, Tamura SI u.c. (2017). Visas inaktivētas gripas vīrusa vakcīnas intranazāla ievadīšana kā daudzsološs gripas vakcīnas kandidāts. Viral Immunol 30:451–62.

2.Amorij JP, Saluja V, Petersen AH, et al. (2007). Ar inulīnu stabilizētas gripas apakšvienības vakcīnas ievadīšana plaušās, kas sagatavota, žāvējot ar izsmidzināšanu, izraisa sistēmiskas, gļotādas humorālas, kā arī šūnu mediētas imūnās atbildes BALB/c pelēm. Vakcīna 25:8707–17.

3.Bienenstock J. (1980). Ar bronhiem saistīti limfoīdie audi un imūnglobulīnu saturošu šūnu avots gļotādā. Vides veselības perspektīva 35:39–42.

4.Chen JR, Liu YM, Tseng YC u.c. (2020). Labākas gripas vakcīnas: nozares perspektīva. J Biomed Sci 27:11.

5. Du X, Xiong L, Dai S u.c. (2015). Ar c-PGA pārklātas mezoporainas silīcija dioksīda nanodaļiņas ar kovalenti pievienotiem priekšzālēm, lai uzlabotu šūnu uzņemšanu un intracelulāru GSH reaģējošu izdalīšanos. Adv Healthc Mater 4: 771–81.

6. Firacative C, Gressler AE, Schubert K u.c. (2018). Cryptococcus neoformans ar T palīgu (Th)1- un Th2- saistīto antigēnu identificēšana plaušu infekcijas peles modelī. Sci Rep 8:14.

7. Giri PK, Sable SB, Verma I u.c. (2005). Intranazālās un subkutānās imunizācijas ceļu salīdzinošais novērtējums gļotādas vakcīnas izstrādei pret eksperimentālo tuberkulozi. FEMS Immunol Med Microbiol 45:87–93.

8. Horiguchi M, Oiso Y, Sakai H u.c. (2015). Fosfoinositīda 3-kināzes inhibitora ievadīšana plaušās ir hroniskas obstruktīvas plaušu slimības ārstnieciska ārstēšana ar alveolu reģenerāciju. J Control Release 213:112–9.

9. Huber VC, McKeon RM, Brackin MN u.c. (2006). Vakcīnas izraisīta imūnglobulīna G1 (IgG1) un IgG2a antivielu atšķirīgā ietekme uz aizsargājošu imunitāti pret gripu. Clin Vaccine Immunol 13: 981–90.

10. Ito R, Ozaki YA, Yoshikawa T u.c. (2003). Anti-hemaglutinīna IgA un IgG antivielu loma dažādās vakcinēto peļu elpceļu vietās letālas gripas pneimonijas novēršanā. Vakcīna 21:2362–71.

11.Kopf M, Schneider C, Nobs SP. (2015). Plaušu rezidentu makrofāgu un dendritisko šūnu attīstība un darbība. Nat Immunol 16: 36–44.

12. Kurosaki T, Kitahara T, Fumoto S u.c. (2009). Trīskārši pDNS, polietilēnimīna un gamma-poliglutamīnskābes kompleksi gēnu piegādes sistēmām. Biomateriāli 30:2846–53.

13. Kurosaki T, Kitahara T, Nakamura T u.c. (2012). Efektīvas vēža vakcīnas izstrāde, izmantojot antigēna proteīna mērķa sistēmu APC. Pharm Res 29:483–9.

14. Mārpls B, Rolands P, Beningers M. (2004). Drošības pārskats par benzalkonija hlorīdu, ko izmanto kā konservantu intranazālos šķīdumos: pārskats par pretrunīgiem datiem un viedokļiem. Otolaryngol Head Neck Surg 130: 131-41.

15. McKee AS, Munks MW, Marrack P. (2007). Kā darbojas adjuvanti? Svarīgi apsvērumi attiecībā uz jaunās paaudzes adjuvantiem. Imunitāte 27: 687–90.

For more information:1950477648nn@gmail.com