Iekaisumu uztveroši katalāzi imitējoši nanozīmi atvieglo akūtu nieru bojājumu, mainot lokālo oksidatīvo stresu

Abstrakts

Priekšvēsture:reaktīvās skābekļa sugas (ROS)un ir labi zināms, ka iekaisums, kas ir būtisks audu bojājumu veicinātājs, ir saistīts ar dažādām slimībām. Nieres ir jutīgas pret hipoksiju un neaizsargātas pret ROS. Tādējādi apburtais loks starpoksidatīvais stressun nieruhipoksija kritiski veicinauz progresēšanuhroniska nieru slimībaun visbeidzot,beigu stadijas nieru slimība. Tādējādi terapeitisko līdzekļu piegāde ar ROS bagāto iekaisuma vietu un terapeitisko līdzekļu atbrīvošana ir reāls risinājums.

Jauni augi nieru slimību ārstēšanai

Rezultāti: mēs izstrādājām ilgāk cirkulējošu, iekaisumu uztverošu, ROS attīrošu daudzpusīgu nanoplatformu, stabili ielādējot katalāzi imitējošu 1-dodekāntiolu stabilizētu Mn3O4 (dMn).3O4) nanodaļiņas ROS jutīgā nanomi-šūnas (PTC), kā rezultātā veidojas pret ROS jutīgs nanozīms (PTC-M). Hidrofobs dMn3O4iekšā tika ielādētas nanodaļiņasPTC micellas, lai novērstu priekšlaicīgu izdalīšanos cirkulācijas laikā un darbojas kā terapeitisks līdzeklis, reaģējot uz ROSnoslogotā dMn atbrīvošana3O4kad tas sasniedza iekaisuma vietu.

Atslēgvārdi:Mn3O4 nanodaļiņas, nanozīmi, iekaisumi,Išēmija-reperfūzija, Nieres

Fons

Acute kidney injury (AKI) is the term that covers a broad spectrum of renal function deterioration ranging from small changes in serum creatinine level to conditions requiring renal replacement therapy [1]. The KDIGO (Kidney disease: improving global outcomes) guidelines define AKI as an increase in serum creatinine of either>0.3  mg/dL within 48  h,>1,5 reizes no sākotnējā līmeņa septiņu dienu laikā vai urīna tilpuma samazināšanās<0.5 ml/kg/hour for six hours [1]. AKI is one of the rising global health problems that cause high morbidity and mortality and economic burden [2]. The incidence of AKI defined by the KDIGO guidelines was 21.6% in adults in in-hospital settings [3]. AKI may lead to several complications, including metabolic acidosis, hyperkalemia, uremia, volume overload, and damage to other organ systems, including death. Despite advances in medicine, mortality from AKI is still high. According to a meta-analysis of studies in in-hospital settings, AKI-associated mortality was reported to be 23.9% in adults [3]. The mortality rate of dialysis-requiring AKI patients exceeds 50% [4]. AKI increases the long-term risk of subsequent AKI, progressive chronic kidney disease (CKD), and end-stage renal disease (ESRD) [5]. Eventually, AKI increases socioeconomic and healthcare burdens. Nevertheless, there is no clear treatment for AKI to date. When AKI occurs, conservative treatments such as removing the causative factors, controlling water and electrolyte imbalances, performing renal replacement therapy, if necessary, and waiting for renal function to recover are applied.

Išēmijas-reperfūzijas bojājums (IRI)ir orgānu bojājums, ko izraisa pārejoša asins plūsmas samazināšanās vai pārtraukšana, kam seko reperfūzija, un ar to var saskarties dažādās klīniskās situācijās, piemēram, šoka, miokarda infarkta, išēmiskā insulta, lielas operācijas un orgānu transplantācijas gadījumā. Nieru IRI ir viens no galvenajiem AKI cēloņiem, kā rezultātā strauji pasliktinās nieru darbība. Nieres ir orgāns, kas ir īpaši jutīgs pret išēmiskiem apvainojumiem, un ievainotās cauruļveida epitēlija šūnas izraisa traucētu atkritumu izdalīšanos un ūdens, elektrolītu un skābju-bāzes līdzsvara kontroli [6]. Ir zināms, ka nieru kanāliņu šūnu bojājumu mehānisms IRI ir saistīts ar iekaisumu, ko izraisa reperfūzijas laikā radušās reaktīvās skābekļa sugas (ROS) [6–8]. Tāpēc ir bijuši mēģinājumi piemērot ROS attīrīšanu IRI ārstēšanai. Tomēr tā reālā klīniskā izmantošana ir ierobežota, jo pastāv bažas par sistēmiskām blakusparādībām, tostarp paaugstinātas jutības reakcijas [9]. Antioksidantu, piemēram, edaravona, ievadīšana jau ir izmantota, lai noņemtu ROS IRI. Tomēr tam bija vairākas blakusparādības, un līdz ar to ir izvirzītas prasības pēc jauniem un efektīviem antioksidantiem, piemēram, nanozīmiem (nanomateriāliem, kuriem piemīt dabiska enzīmu līdzīga aktivitāte) [9–13]. Yao et al. atklāja, ka Mn3O4 nan daļiņām piemīt vairākas enzīmus atdarinošas aktivitātes, ti, superoksīda dismutāzi un katalāzi imitējošas aktivitātes, kā arī hidroksilradikāļu attīrīšanas aktivitāte [11]. Tika pierādīts, ka Mn3O4 piemīt spēcīgāka ROS attīrīšanas spēja nekā citiem enzīmiem, piemēram, V2O5, CeO2, Co3O4, MnFe2O4 un Fe3O4, un tas bija labāks par citiem mangāna oksīda veidiem (MnOx (MnO2, MnO un Mn2O3).

1. att. Shematisks attēls, kas parāda PTC-M sagatavošanu un darbības veidu A PTC-M sintēze, B PTC-M darbības mehānisms (1) PTC-M intravenoza injekcija (2) ievadītais PTC-M cirkulē asinīs un uzkrājas iekaisuma vietā (3) PTC-M destabilizācija, ko izraisa raksturīgā ROS, kas atrodas iekaisuma vietā (4) noslogotā dMn 3O4 izdalīšanās iekaisuma vietā (5) atbrīvotais dMn3O4 katalizē ROS izvadīšanu, izraisot (6) iekaisuma, apoptozes un fibrozes mazināšana (7) nieru bojājumu mazināšana un (8) nieru darbības uzlabošana

Rezultāti

dMn3O4 nanodaļiņu un polimēru konjugātu sintēze un raksturojums

Te dMn3O4 NP tika sintezēti, izmantojot kopizgulsnēšanas metodi, un stabilizēti, izmantojot 1-dodekāntiola tiola grupas (2.A att.). Lauka emisijas transmisijas elektronu mikroskopijas (FE-TEM) analīze parādīja, ka dMn3O4 NP vidējais izmērs bija mazāks par 2{{10}} nm (18.0±0,6 nm) (2.B attēls). ). 1. papildu fails: S1A un S1B attēlā parādīti sagatavotā dMn3O4 attēli un shematisks attēlojums. Enerģijas dispersīvās rentgena spektroskopijas (EDS) dati parādīja Mn klātbūtni no Mn3O4 un sēra un oglekļa klātbūtni no SH-C12 (2. att. C un 1. papildu fails: S1C attēls). Rentgenstaru fotonu spektroskopijas (XPS) analīzes rezultāti attēloja Mn 2p XPS spektru, kas sastāvēja no diviem pīķiem, kas atradās pie 641,42 eV un 653,23 eV, un šie maksimumi tika attiecināti uz attiecīgi Mn 2p3/2 un Mn 2p1/2 (att. 2D un papildu fails 1: attēls S2). Enerģijas starpība starp šīm divām virsotnēm bija 11, 81 eV, kas labi saskanēja ar ziņoto literatūru par Mn3O4. dMn3O4 NP rentgenstaru pulvera difrakcijas (XRD) modelī, kā parādīts 2. E attēlā, visas izmērītās difrakcijas pīķi labi sakrita ar hausmanīta Mn3O4 [ICDD: #001–1127] standarta modeli, apstiprinot to augsti kristāliskumu. daba. Uz ROS reaģējošais PTC konjugāts tika sagatavots, izmantojot pakāpeniskas ķīmiskas reakcijas, kur tioketāla (TK) saistītājs ar terminālo karboksilātu grupu tika noteikts vispirms. Pēc tam TK linkera karboksilgrupa tika konjugēta ar metoksi-PEG amīna (PEG-AM) aminogrupu, izmantojot EDC/NHS reakciju, veidojot PEG-TK. Visbeidzot, otra PEG-TK karboksilgrupa atkal tika konjugēta ar stearamīna aminogrupu, izmantojot EDC/NHS reakciju [15]. ROS nereaģējošais PC konjugāts tika sagatavots, konjugējot stearīnskābi ar PEG-AM. PTC un PC sastāvs tika analizēts ar 1H kodolmagnētiskās rezonanses (NMR) spektroskopiju (1. papildu fails: S3 attēls). KMR spektri uzrādīja raksturīgos maksimumus pie δ 0,83 un 1,23 ppm, kas atbilst C18 metil un metilēna protoniem. Maksimums pie δ 3,6 atbilda PEG O–CH2–CH2-. C18 aizstāšanas pakāpe (DS %) PTC un PC tika aprēķināta attiecīgi 78% un 46%.

PTC-M enzīma sagatavošana un raksturojums

ROS jutīgās nano micellas (PTC) tika ielādētas ar dMn3O4, kā rezultātā tika iegūts PTC-M. PTC-M pagatavošanai tika izmantota PTC dMn3O4 padeves attiecība (20%). Sagatavoto PTC un PTC-M hidrodinamiskais diametrs, zeta potenciāls un FE-TEM attēli ir parādīti 3.A attēlā un 1. papildu failā: S4A attēls. PTC FE-TEM attēli demonstrēja sfēriskas nano micellas ar vienādu daļiņu izmēru. PTC-M hidrodinamiskais diametrs bija nedaudz palielināts pēc dMn3O4 iekraušanas, jo dMn3O4 iesaiņojās hidrofobajā telpā, savukārt zeta potenciāls abās nanomicellās palika negatīvs PEG ekranēšanas dēļ. PTC un PTC-M FE-TEM attēli parādīja vienmērīgi sadalītas daļiņas. Slodzes saturs un iekapsulēšanas efektivitāte tika aprēķināta, izmantojot masas spektrometrisko analīzi, un tika aprēķināta attiecīgi 10±3% un 17±6%. dMn3O4 klātbūtne bija redzama PTC-M FE-TEM attēlos (3.A att.), kas tika apstiprināta ar PTC-M EDS analīzi, kas parāda Mn no Mn3O4, sēru un oglekli no SH-C12 un oglekli. , slāpeklis un skābeklis no PEG (1. papildu fails: S5 attēls). Tika veikta termogravimetriskā (TGA) analīze, un tika aprēķināts, ka dMn3O4 slodze ir 12% (1. papildu fails: S6B attēls). ROS nejutīgas micellas, kas ielādētas ar dMn3O4 (PC-M), arī tika sagatavotas kā kontroles ar to pašu metodi.

Lai apstiprinātu TK saites lomu PTC-M destabilizācijā, kas reaģē uz ROS, un dMn3O4 izdalīšanos, PTC-M tika pakļauts ROS apstākļiem, pievienojot H2O2. Kā vadīklas mēs izmantojām ROS nejutīgo PC-M. Gan PTC-M, gan PC-M bija sfēriska morfoloģija ar cieši iesaiņotu dMn3O4 nano micellās, bet pēc apstrādes ar H2O2 PTC-M virsmontāža tika izkropļota, kam sekoja dMn3O4 izdalīšanās, kas pēc tam tika izkropļota. apkopoti, kā parādīts FE-TEM attēlos, savukārt PC-M uzrādīja stabilas struktūras pat pēc H2O2 iedarbības (3.B att. un 1. papildu fails: S4B attēls). PTC-M ROS jutība tika vēl vairāk apstiprināta, salīdzinot hidrodinamiskā diametra un zeta potenciāla izmaiņas ar PC-M, kā parādīts 1. papildu failā: S7 attēls. ROS nejutīgā PC-M hidrodinamiskais diametrs un zeta potenciāls pēc H2O2 pievienošanas neuzrādīja nekādas pamanāmas atšķirības. Tomēr ROS jutīgajam PTC-M bija samazināti hidrodinamiskie izmēri, iespējams, tāpēc, ka ar TK pārrāvumu tika noņemts PEG ekranējums, kā rezultātā tika destabilizēta struktūra. Pēc H2O2 pievienošanas zeta potenciāls atgriezās no negatīva uz pozitīvu lādiņu, kas varētu būt saistīts ar PEG atdalīšanu un pakļaušanu tvaicēšanai. Mēs tālāk pētījām izmēru izmaiņas, pārbaudot stabilitāti laika gaitā, izsekojot hidrodinamiskos diametrus H2O2 klātbūtnē vai bez tā (3. att. C). Pēc H2O2 pievienošanas hidrodinamiskie diametri ievērojami samazinājās 10 sekunžu laikā bez turpmākām izmaiņām laikā līdz sešām dienām, turpretim tikai PTC-M eksperimenta laikā uzrādīja stabilus izmērus, kas liecina par labu PTC-M koloidālo stabilitāti. Mēs arī pārbaudījām stabilitāti 10% FBS un novērojām, ka PTC-M uzrādīja labu stabilitāti līdz 4 dienām (1. papildu fails: S9 attēls). Hidroksidinamiskie diametri un zeta potenciāla variācijas tika saskaņotas arī ar ROS jutīgām un nejutīgām tukšām nano micellām (PTC un PC) (1. papildu fails: S8 attēls). Visi šie salīdzinošie pētījumi ROS klātbūtnē vai bez tās parādīja sagatavoto nanomolu vai galīgā dMn3O4 PTC-M enzīma stabilitāti un ROS jutību.

2. att. dMn3O4 sintēze un raksturojums Shematisks dMn 3O4 sintēzes ilustrācija, B FE-TEM attēli, C EDS analīze, D XPS spektrs un dMn3O4 NP E XRD modeļi

Tālāk mēs pārbaudījām galīgā PTC-M enzīma H2O2 eliminācijas īpašību dMn3O4 NP slodzes dēļ. Tas tika pārbaudīts, izmantojot tereftalskābi (TA) kā nākotnes centu zondi. TA reaģēja ar H2O2, veidojot 2-hidroksiterftalskābi ar fluorescējošu maksimumu pie 425 nm. dMn3O4 pārvērš H2O2 par ūdeni un skābekli, un līdz ar to fluorescējošā intensitāte samazinās, apstiprinot katalāzes aktivitāti, kā parādīts 3.D attēlā. Te PTC-M uzrādīja spēcīgu fluorescences intensitātes samazināšanos, salīdzinot ar tukšo micellu PTC H2O2 klātbūtnē laika gaitā. PTC-M katalāzei līdzīgā aktivitāte bija arī atkarīga no koncentrācijas, kā parādīts 1. papildu failā: S10 attēls. PTC-M skābekļa ražošanas jauda tika tālāk pārbaudīta, izmantojot O2-specifisku fluorescējošu zondi Ru(DDP) H2O2 klātbūtnē. Desmit Ru (DDP) pilsētās fluorescence samazinās O2 klātbūtnē, kas liecina par efektīvu O2 ražošanu. Kā parādīts 3. E attēlā, Ru(DDP) fluorescences intensitāte samazinājās H2O2 klātbūtnē PTC-M grupā, savukārt H2O2 klātbūtne tikai PTC grupā uzrādīja nelielu fluorescences samazināšanos (3.F attēls). apstiprinot katalāzes aktivitāti, kas izraisa skābekļa veidošanos PTC-M. Visbeidzot, izmantojot skābekļa noteikšanas mērītāju, mēs apstiprinājām PTC-M H2O2 eliminācijas īpašību. Kā parādīts 3G attēlā, PTC-M skābekļa ražošana tika palielināta sākotnējā laikā, kam sekoja lēns pieaugums, bet tukšās micellas PTC neuzrādīja skābekļa ražošanu. H2O2 disproporcija tika novērota, veidojoties skābekļa burbuļiem PTC-M grupā, kā parādīts 1. papildu failā: S11A attēls. Tika arī novērots, ka PTC-M uzrādīja lielāku skābekļa ražošanu, salīdzinot ar dMn3O4 atsevišķi, iespējams, tāpēc, ka dMn3O4 ir cieši iesaiņota PTC-M, padarot to pieejamāku reakcijai salīdzinājumā ar brīvo dMn3O4 (1. papildu fails: attēls S11B). Lai gan nano micellas bija atslābušas H2O2 apstrādes dēļ, kā parādīts FE-TEM, dMn3O4 joprojām varēja būt PTC-M iekšpusē, kā rezultātā katalāzes aktivitāte bija augsta, salīdzinot ar brīvo dMn3O4. Visi šie rezultāti kopā apstiprināja PTC-M izcilo katalāzes imitācijas aktivitāti.

In vitro šūnu dzīvotspēja un šūnu uzņemšana

Lai apstiprinātu šūnu uzņemšanu un ROS jutīgo pilsētu ar intracelulāri sadalītu ROS jutīgu-PTC un lietderīgās slodzes izdalīšanās modeli, mēs salīdzinājām PTC ar PC in vitro apstākļos. Pirmkārt, mēs pārbaudījām sagatavoto PTC, PC, PTC-M un PC-M šūnu dzīvotspēju HK-2 šūnās, izmantojot WST-1 testu (1. papildu fails: S12. attēls). Tukšās micellas piedzīvoja nelielu šūnu nāvi, bet pēc dMn3O4- slodzes šūnu dzīvotspēja samazinājās, bet izmaiņas nebija statistiski nozīmīgas. Tā kā tukšās micellas nebija citotoksiskas, nelielas izmaiņas šūnu dzīvotspējā varētu būt saistītas ar virsmas adsorbēto dMn3O4. PTC-M un PC-M IC50 vērtība tika noteikta attiecīgi 130,41 un 247,17 ug/ml (4.A attēls). Lai turpinātu pētīt nano micellu intracelulāro uzņemšanu un izplatību, IR780 tika izmantots kā paraugzāles un sagatavotas ar IR780 ielādētas PTC nanomicellas, PTC-IR780, lai vizualizētu IR780 fluorescences intensitāti, izmantojot jautru klātbūtnes mikroskopiju (Evos FL Auto 2, Thermo Fisher Scientific). , ASV) (4.B att.). Kā kontroles grupa mēs analizējām arī ROS nejutīgā PC-IR780 uzņemšanu. Salīdzinot ar PC-IR780, PTC-IR780 uzrādīja lielāku uzņemšanu HK-2 šūnās (1. papildu fails: S13 attēls). Precīzs iemesls pastiprinātai PTC-IR780 uzņemšanai apstākļos, kas nav ROS, nav skaidrs, tomēr tas varētu būt tāpēc, ka PTC varētu uzrādīt nelielu jutību pret normālu ROS līmeni šūnu kultūras apstākļos, kā rezultātā PEG tiek noņemts, atstājot virsmu. lādiņš nedaudz pozitīvs. PC-IR780 uzrādīja līdzīgu uzņemšanas modeli neatkarīgi no ROS, ko izraisīja H2O2 apstrāde vai hipoksijas izraisīti ROS apstākļi, jo tas nebija jutīgs, turpretim PTC-IR780 uzrādīja atšķirīgu sadalījuma modeli šūnās, kas varētu būt saistīts ar pastiprinātu IR780 izdalīšanos. šūnu iekšpusē. Iepriekšējie šūnu dzīvotspējas dati (1. papildu fails: S11 attēls), kas parāda palielinātu šūnu nāvi PTC-M, būtu arī tāpēc, ka salīdzinājumā ar PC ir palielināta PTC uzņemšana šūnās. IR780 jodīds ir ļoti hidrofoba krāsviela, kas var izrādīt augstu afinitāti pret šūnu membrānu un parāda ļoti spilgtu signālu neatkarīgi no ROS iedarbības. Šūnu uzņemšana tika tālāk analizēta, pārbaudot vidējo fluorescences intensitāti (MFI) ar fluorescences aktivētu šūnu šķirošanas (FACS) analīzi (4.C attēls), kas apstiprināja ar fluorescences mikroskopiju iegūtos datus. Kā parādīts, MFI bija visaugstākais ROS jutīgajā PTC IR780 grupā, salīdzinot ar citām grupām, apstiprinot pastiprinātu IR780 izdalīšanos šūnās. Mēs tālāk Quan piesaistīja MFI no dažādām grupām (att. 4D), kas atbalstīja mikroskopijas datus, kas liecina, ka PC-IR780 neuzrādīja nekādas būtiskas atšķirības šūnu uztveršanā pat ROS izraisītos apstākļos, turpretim PTC IR780 uzrādīja būtisku šūnu pieaugumu. uzņemšanu, ārstējot ROS izraisītos apstākļos. PTC uzņemšana šūnās tika noteikta arī, pārbaudot atlikušo Mn šūnās pēc apstrādes ar PTC-M. Kā parādīts 4. E attēlā, PTC-M uzrādīja no koncentrācijas atkarīgu uzņemšanu HK-2 šūnās. Tādējādi šie rezultāti apkopo nano micellu pastiprināto internalizāciju un paātrināto izdalīšanos šūnās, iespējams, pateicoties nanomicellu demontāžai ar ROS starpniecību.

Mēs veicām in vitro pētījumus HK{0}} šūnās, lai sīkāk izpētītu PTC-M ietekmi uz oksidatīvā stresa apstākļiem šūnu līmenī. HK-2 šūnas tika stimulētas ar H2O2, reprezentatīvu ROS (5.A att.). H2O2 pastiprināta hēma oksigenāzes (HO)-1 ekspresija, kas tika uzlabota ar PTC-M vienlaicīgu ārstēšanu (5.A att.). Lai pārbaudītu intracelulāro ROS izmaiņu modeli, tika veikts Te 2′,7′-dihlordihidrofluoresceīna diacetāta (DCF DA) tests. Ar H2O2 stimulētajām Te HK-2 šūnām bija augsta fluorescences intensitāte, bet pēc vienlaicīgas apstrādes ar PTC-M fluorescences intensitāte tika samazināta (5.B att.). Te BAX/BCL-2 attiecība tika palielināta ar H2O2 ārstēšanu, ko arī atjaunoja ar PTC-M kopapstrādi, norādot uz aizsardzību pret apoptozi (5. C attēls). HK-2 šūnām, kas apstrādātas ar H2O2, bija ievērojams progresīvs aneksīna V+/PI− iekrāsošanās pieaugums, ko novērsa PTC-M (5. D attēls). H2O2-inducētā ERK, JNK un p38 fosforilēšanās arī tika nomākta, vienlaikus apstrādājot ar PTC-M, lai gan netika novērota būtiska fosforilētā P38 samazināšanās (5.C att.). Šie dati liecina, ka PTC-M nomāca ROS izraisītos apoptotiskos procesus nieru kanāliņu epitēlija šūnās.