In vitro cilvēka gremošanas simulācijas ietekme uz fenola saturu un bioloģisko aktivitāti ūdens ekstraktos no turku cistas sugām 2. daļa

Lūdzu sazinietiesoscar.xiao@wecistanche.comlai iegūtu vairāk informācijas

Sasummēt

C.salvifolius ūdens ekstraktam bija labāka gremošanas enzīmu inhibējošā aktivitāte nekā citu sugu ekstraktiem. Turklāt visu ūdens ekstraktu IN paraugi atklāja zemākas enzīmu inhibējošās aktivitātes, salīdzinot ar ND paraugiem.

2.4. AGEs inhibējošā darbība

Kā parādīts 4. tabulā, no koncentrācijas atkarīga AGE inhibējošā aktivitāte tika novērota visos ūdens ekstraktos. CCA, CPA un CSA ND paraugiem bija labāka inhibējošā aktivitāte nekā atsauces savienojumam kvercetīnam gan 0,5, gan 1 mg/ml koncentrācijā. Tomēr tikai C.saluifolius ekstraktam bija labāka inhibējošā aktivitāte nekā kvercetīnam starp IN ekstraktu paraugiem. Biopieejamie ūdens ekstraktu paraugi uzrādīja zemākas AGE inhibējošās aktivitātes, salīdzinot ar nesagremotiem paraugiem. Saskaņā ar rezultātiem C.salvifolius ūdens ekstrakta ND paraugam bija visaugstākā AGE inhibējošā aktivitāte. Tomēr C.monspeliensis ūdens ekstrakta IN paraugs uzrādīja vājāko AGE inhibīcijas potenciālu pārbaudītajās koncentrācijās.

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

3. Diskusija

Brīvie radikāļi var uzbrukt olbaltumvielām, lipīdiem vai DNS, lai iegūtu elektronu, izraisot dažādas veselības problēmas. Šī iemesla dēļ ir svarīgi līdzsvarot ķermeņa antioksidantu sistēmu un brīvos radikāļus, kas veidojas oksidācijas rezultātā. Šī līdzsvara pasliktināšanās gadījumā rodas oksidatīvais stress [29]. Oksidatīvais stress ir viens no galvenajiem faktoriem, kas izraisa dažādus hroniskus traucējumus, piemēram, vēzi, diabētu, sirds un asinsvadu slimības, Alcheimera slimību u.c. Lai gan cilvēka organismā ir pašnodarbinātas antioksidantu sistēmas, lai cīnītos pretoksidatīvsJa rodas audu un orgānu bojājumi, šīs aizsardzības sistēmas var zaudēt savu efektivitāti dažādu apstākļu, piemēram, pārmērīga alkohola lietošanas, smēķēšanas, stresa, hroniskas narkotiku lietošanas un radiācijas uc dēļ [30]. Dažādos zinātniskos ziņojumos ir norādīts, ka sekundārajiem augu metabolītiem ir nozīmīga loma oksidatīvā stresa un tā kaitīgās ietekmes novēršanā [13,14,31]Lai gan biopieejamība ir svarīgs parametrs, kas ietekmē šo savienojumu bioaktivitāti, tas nav ņemts vērā. lielākā daļa pētījumu. Tomēr ir labi zināms, ka sekundārie metabolīti tiek pakļauti strukturālām transformācijām dažādu pH apstākļu, fermentatīvās aktivitātes un ķermeņa temperatūras dēļ kuņģa-zarnu traktā. Turklāt sekundāro metabolītu ķīmiskās īpašības, piemēram,molekulārāsvars, polaritāte un saistīšanās ar makromolekulām augu matricā arī ir nozīmīgi faktori, kas ietekmē to biopieejamību [13]. Attiecīgi savienojumu vai to metabolītu uzsūkšanās asinsritē pēc norīšanas ir būtiska, lai radītu to sistēmisko fizioloģisko iedarbību. In vitro fermentācijas simulācijas modeļi var sniegt pierādījumus vielu iespējamo biopieejamības īpašību novērtēšanai. Lai gan izmēģinājumos ar cilvēkiem ir nepieciešams apstiprinājums, lai apgalvotu jebkuru funkcionālu īpašību, in vitro simulācijas modeļus plaši izmanto kā alternatīvas in vivo pētījumiem vai izmēģinājumiem ar cilvēkiem, kas bieži ir ētiski apšaubāmi, resursietilpīgi, dārgi un laikietilpīgi [32].

Cistanche var uzlabot imunitāti

Vairāki pētnieki ir pētījuši arī no dažādiem Cistus sugu orgāniem sagatavoto ekstraktu antioksidantu potenciālu. Saskaņā ar literatūras aptauju šis ir pirmais pētījums par Cistus sugām par fenola vielu biopieejamību un to ietekmi uz antioksidantu aktivitāti, izmantojot in vitro gremošanas simulācijas modeli. Karas et al. [33] ierosināja, ka 10 procenti polifenolu komponentu paliek nesagremoti augu matricā un 90 procenti no tiem tiek sagremoti kuņģa vai zarnu fāzē (attiecīgi aptuveni 48 procenti un 52 procenti). Kā minēts iepriekš, visus fenola daudzumus ūdens ekstraktos negatīvi ietekmēja cilvēka gremošanas simulācijas procedūra in vitro. Tādējādi tika konstatēti būtiski zudumi visu ekstraktu bioloģiski pieejamo paraugu fenola saturā. Turklāt kopējā proantocianidīna koncentrācija IN paraugos bija zem noteikšanas robežas visos ūdens ekstraktos. Dažādi pētījumi arī pamudināja gremošanas procedūras negatīvo ietekmi uz fenola savienojumiem augu ekstraktos un ar to saistīto bioaktivitāti. Piemēram, mēs ziņojām par Salvia virgata Jacq kopējo fenola saturu. to nelabvēlīgi ietekmēja arī gremošanas procedūra mūsu iepriekšējā pētījumā. Turklāt ekstrakta galveno metabolītu, ti, rutīna un rozmarīnskābes, daudzumam bija tendence samazināties [13]. Turpretim vairāki pētījumi ir ziņojuši par pretrunīgiem rezultātiem. Pētījumā Celeb et al. [34], viņi novēroja kopējā fenola skābes, flavonoīdu un fenola daudzuma pieaugumu Hypericum perfoliatum L metanola ekstrakta biopieejamajos paraugos. Faktiski galvenajiem metabolītiem, kvercitrīnam, hlorogēnskābei un gallskābei, bioloģiskās pieejamības koeficients pārsniedza 100. procenti . Šie pētījumi parādīja, ka gremošanas procedūras ietekme var atšķirties atkarībā no augu materiāliem. Lai noskaidrotu šīs atšķirības, ir svarīgi apsvērt gremošanas sistēmas darbības mehānismu uz fenola vielām. Serra et al. [35] ierosināja, ka fenola savienojumi galvenokārt atrodami glikozīdu, polimēru un esteru formās augu matricā un pirms uzsūkšanās tiek hidrolizēti gremošanas sistēmā. Fenola savienojumu strukturālās transformācijas kuņģa-zarnu traktā var ietekmēt dažādi faktori. Piemēram, savienojumi ar lielāku molekulmasu, piemēram, proantocianidīni vai procianidīni, pirms uzsūkšanās zarnās ir jāhidrolizē. Augu matricas struktūra ir arī ievērojams fenolu biopieejamības faktors; fenola savienojumi var saistīties ar makromolekulām augu matricā, piemēram, šķiedrām, olbaltumvielām un lipīdu molekulām. Tādējādi tikai no matricas atbrīvotie fenola komponenti var kļūt absorbējami no kuņģa-zarnu trakta. Turklāt dažādas pH vērtības un zarnu mikrobiotas fermentatīvā darbība ir vieni no citiem būtiskiem faktoriem, kas ietekmē fenola savienojumu ķīmiskās struktūras transformāciju [36]. Ņemot vērā šos datus, mēs varam izvirzīt hipotēzi, ka dažādi rezultāti, kas iegūti līdzīga veida eksperimentālos pētījumos, var būt saistīti ar gremošanas sistēmas sarežģītību un augu matricas sastāvu. Kā parādīts 3. tabulā, Cistus ekstraktu bioloģiski pieejamiem paraugiem bija vājāka antioksidanta aktivitāte nekā nesagremotajiem un pēckuņģa līdziniekiem, jo ​​tiem bija zemāks fenola saturs.

Turklāt abiem C. saluifolius ekstraktiem bija labāka antioksidanta aktivitāte DPPH, CUPRAC, FRAP un TOAC testos, salīdzinot ar citām sugām. Turklāt abiem C. paroiflorus ekstraktiem bija augstāka DMPD radikāļu attīrīšanas aktivitāte nekā citu sugu ekstraktiem. Kā norādīts 1. tabulā, kopējais fenolu, flavonoīdu un fenolskābes saturs C. salviifolius bija augstāks nekā citos paraugos. Tādējādi C. saloiifolius ekstraktu augstākais antioksidanta potenciāls var būt saistīts ar tā fenola saturu.

Turklāt bioloģiski pieejamo paraugu antioksidantu potenciāla samazināšanās, ar ogļhidrātiem saistītu enzīmu inhibējošā aktivitāte un AGE var būt saistīti ar flavonoīdu glikozīdu marķieru samazināšanos. Tomēr Cistus ekstrakti saturēja arī citas fenola vielas, kā norādīts 1. attēlā. Tāpēc ir nepieciešama detalizēta ekstraktu hromatogrāfiskā analīze, lai uzraudzītu gremošanas ietekmi uz bioloģisko aktivitāti.

Augu ekstraktu inhibējošais potenciāls uz gremošanas enzīmiem nesen ir piesaistījis lielāku uzmanību sintētisko inhibitoru drošības apsvērumu dēļ. Tāpēc augu ekstraktu inhibējošā iedarbība tika noteikta vairākos pētījumos, un šī iedarbība parasti bija saistīta ar fenola vielām, piemēram, flavonoīdiem, fenolskābēm, proantocianidīniem utt. Sun et al. [37] ierosināja, ka polifenolu savienojumi izrāda savu inhibējošo iedarbību, saistoties ar iepriekš minētajiem fermentiem ar hidrofobu spēku un nekovalento saišu palīdzību. Tāpēc polifenolu izraisītā -amilāzes un -glikozidāzes enzīmu aktivitātes inhibīcija ir saistīta ar to molekulārajām struktūrām. Lai gan šis mijiedarbības mehānisms ir pētīts, izmantojot dažādas metodes, piemēram, inhibīcijas kinētiku, molekulārās dokstacijas fluorescences dzēšanu utt., Konkrēts secinājums vēl nav iegūts [38]. Tomēr daudzos pētījumos ir ziņots, ka augu ekstraktu gremošanas enzīmu kavēšana ir tieši saistīta ar to fenola saturu. Iepriekš ziņots arī par līdzīgiem pētījumiem par Cistus sugu enzīmu inhibējošām aktivitātēm. Sayah et al. [39] pētīja C. monspeliensis un C. saluifolius 80 procentu metanola un ūdens ekstraktu -amilāzes un a-glikozidāzes inhibējošās aktivitātes. To rezultāti atbilda šim pētījumam, atklājot, ka C. salvijfolius ūdens ekstraktā ir augstāks glikozidāzes līmenis （IC50 ug/mL∶0.95±0.14) un o. -amilāze (IC50 ug/mL∶217,1±0,15）inhibējoša aktivitāte nekā C.monspeliensis ūdens ekstraktam (IC50 ug/mL∶14,58±1,26) un （ICsn ug/mL∶14,58±1,26）, attiecīgi. Abu ūdens ekstraktu inhibīcijas līmenis uz šiem enzīmiem bija augstāks nekā atsauces savienojumam akarboze (ICso ug/mL: 18,01±2.00) Līdzīgi kā mūsu pētījumā, tie atklāja korelāciju ar enzīmu inhibēšanas līmeni un kopējo vērtību. fenola un flavonoīdu daudzums. Gan kopējais fenola, gan kopējais flavonoīdu saturs C. salvijfolius ūdens ekstraktā (attiecīgi 408,43 ± 1,09 mg GAE un 140.00±1,15 RE) bija augstāks nekā C.monspeliensis ūdens ekstraktā (261,76 ±1,9 mg GAE un GAE). 78.{47}}±1,15 RE). Orhan et al. [40] pētīja arī gremošanas enzīmu inhibēšanas potenciālu 80% ūdens un etanola ekstraktiem no C.laurifolius lapām. Saskaņā ar to rezultātiem 80% etanola ekstraktam (71,7% ±0,6) bija spēcīga amilāzes inhibējošā aktivitāte, salīdzinot ar ūdens ekstraktu (39,3% ±2,2) koncentrācijā 1 mg/ml. Viņi ierosināja, ka fenola savienojumi, īpaši flavonoīdi, tieši ietekmē insulīna sekrēciju, novēršot beta šūnu apoptozi un atbalstot pretdiabēta darbību. Šī hipotēze, kas korelē ar mūsu rezultātiem, norāda, ka C. salviifolius ūdens ekstraktu ND paraugam bija visaugstākais kopējais flavonoīdu un fenola saturs un vislielākās o-amilāzes un o-glikozidāzes inhibējošās aktivitātes. Kā norādīts 4. tabulā, C. salviifolius ūdens ekstraktam bija labāka gremošanas enzīmu inhibējošā iedarbība nekā citiem ekstraktiem.

Turklāt ūdens ekstraktu IN paraugos bija mazāks fenola un flavonoīdu daudzums nekā ND paraugos, un tādējādi šajā darbā tika atklāta zemāka enzīmu inhibējošā aktivitāte. Lai gan gremošanas procedūra negatīvi ietekmēja ekstraktu fenola saturu, tiem joprojām bija ievērojama gremošanas enzīmu inhibējoša aktivitāte. Vairākos pētījumos flavonoīdu glikozīdi tika ziņots kā galvenie metabolīti augu ekstraktos ar spēcīgua-amilāzeun -glikozidāzes inhibēšanas potenciāls [41-43]Lai gan fenola savienojumu inhibēšanas mehānisms uz gremošanas enzīmiem vēl nav atklāts, ir veikti struktūras un aktivitātes attiecību pētījumi ar dažiem fenola komponentiem, piemēram, flavonoīdiem, fenolskābēm, proantocianidīniem. un tanīni Struktūras-aktivitātes attiecību pētījumi par flavonoīdiem parādīja, ka C-gredzena C2=C3 dubultsaite pastiprina šādu savienojumu gremošanas enzīmu inhibīcijas potenciālu. Tā kā šī saite paaugstina elektronu blīvumu, palielinās flavonoīda un fermenta mijiedarbības stiprums [44]. Turklāt hidroksilgrupas uz C-5 un C-7 veicina flavonoīdu o-amilāzes inhibēšanas potenciālu. Tika arī ierosināts, ka flavonoīdu skeleta hidroksilēšana pozitīvi ietekmē to a-amilāzi un- glikozidāzes enzīmsinhibējošais potenciāls[45]. Kā norādīts iepriekš, visi marķieru flavonoīdi šajā pētījumā bija flavonola glikozīdi, kuriem bija šīs iepriekš aprakstītās strukturālās prasības. Tomēr pēc in vitro gremošanas procedūras ar to saistītās aktivitātes ievērojami samazinājās bioloģiski pieejamos ūdens ekstraktu paraugos.

Parasti augu ekstraktu inhibējošais potenciāls uz AGE ir saistīts ar vairākiem faktoriem, ti, to fenola saturu, antioksidantu potenciālu, metālu helātu veidošanās spējām, olbaltumvielu mijiedarbību un AGE receptoru bloķējošām aktivitātēm[13]. Kā parādīts 4. tabulā, ūdens ekstraktu biopieejamie paraugi uzrādīja zemākas AGE inhibējošās aktivitātes, salīdzinot ar ND paraugiem, jo ​​in vitro fermentācijas procedūra negatīvi ietekmēja fenola saturu ekstraktos. Saskaņā ar pašreizējiem pētījuma rezultātiem C.salvifolius ūdens ekstrakta ND paraugam bija visaugstākā AGE inhibējošā aktivitāte, kā arī kopējais fenola un flavonoīdu saturs. Salīdzinājumam, C.monspeliensis ūdens ekstrakta IN paraugs uzrādīja vājāko AGE inhibīcijas potenciālu, ko var attiecināt uz tā zemāko kopējo flavonoīdu un fenola saturu. Tā kā flavonoīdi ir plaši izplatīti augu ekstraktos, augļos, dārzeņos un dzērienos, vairāki pētījumi ir pastiprinājuši flavonoīdu inhibīcijas potenciālu uz AGE veidojumiem. Tie paši flavonoīdi, kas šajā pētījumā tika piešķirti kā marķiera fenoli, tika ziņots arī kā marķiera savienojumi citos pētījumos[46-48].

Līdzīgi kā gremošanas enzīmu inhibīcija, flavonoīdu AGE inhibējošās aktivitātes stimulēja C2=C3 dubultsaite un A un C gredzenu hidroksilēšana. Tomēr cukura piesaiste flavonoīdu skeletam samazina inhibējošo aktivitāti [49]. No otras puses, Servantes-Lauren et al. [50] ierosināja, ka glikozīdu flavonam{5}} piemīt lielāks AGE inhibīcijas potenciāls nekā citiem flavonoīdu glikozīdiem. Šī hipotēze var būt izskaidrojums samazinātajai AGE inhibīcijai bioloģiski pieejamos paraugos. Piemēram, kvercitrīns un hiperozīds netika konstatēti C.monspeliensis ūdens ekstrakta biopieejamajos paraugos, kas ir iemesls zemākai C.monspeliensis IN paraugu aktivitātei salīdzinājumā ar citu sugu ekstraktiem. Lai gan kvercitrīns netika konstatēts C. saloifolius ūdens ekstraktā, ievērojami lielāks hiperozīda un salidrosīda daudzums var būt tā augstās AGE inhibīcijas aktivitātes cēlonis. Kopumā tika novērota pozitīva korelācija starp flavonoīdu marķieru saturu paraugos un to inhibējošo potenciālu uz AGE.

4. Materiāls un metodes

4.1.Ķīmiskās vielas

Visas eksperimentos izmantotās atsauces, fermenti un ķīmiskās vielas tika iegādātas no Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, ASV). Eksperimentos tika izmantoti analītiskas kvalitātes materiāli.

4.2.Augu paraugi

C.creticus un C.saloifolius gaisa daļas tika savāktas no Yeditepe universitātes pilsētiņas (Kayisdagi, Stambula) 2018. gada aprīļa pēdējā nedēļā. C.mon-speliensis un C.paroiflorus daļas no gaisa tika savāktas no netālu no AlacatI Kutlu Aktas. Balaji, Cesme, Izmira 2018. gada maija otrajā nedēļā. C. laurifolius gaisa daļas tika savāktas no Kemeras-Doganhisaras ceļa Konjas štatā 2018. gada jūnija pirmajā nedēļā. Prof. Dr. Erdem Yesilada autentificēja augu materiālus. C.creticus (YEF18013), C.lauri-folios (YEF18017), C.monspeliensis (YEF18015), C.paroiforus (YEF18016) un C.salvifolus (YEF18014) kuponu paraugi tika glabāti Pharmacognos departamenta Herbarium. Farmācijas fakultāte, Yeditepe University, Stambula, Turcija.

4.3.Ieguves procedūra

Ūdens ekstrakcija tika izvēlēta, jo to parasti izmanto kā sagatavošanas paņēmienu tradicionālajā medicīnā. Rupji gaisā žāvētas un pulverveida gaisa daļasCistanchesugas (100 g) ekstrahēja ar karstu destilētu ūdeni (80 grādi, 1,5 l), izmantojot kratīšanas ierīci 15 minūtes. Pēc tam ūdens ekstrakti tika filtrēti caur filtrpapīru un samazinātā spiedienā iztvaicēti līdz sausumam. Pēc liofilizācijas procedūras pabeigšanas ekstrakti tika izšķīdināti destilētā ūdenī tālākai apstrādei (nesagremots paraugs: ND) (ekstraktu iznākums: 13,04 procenti C.creticus, 15,7 procenti C.laurifolius, 12,8 procenti C.monspeliensis. ,14,94 procenti C.parviflorus, 14,74 procenti C.salvifolius).

4.4. Cilvēka gremošanas simulācijas metode in vitro

Cilvēka gremošanas simulācijas modelis tika izmantots Cistus paraugiem in vitro, pēc Celeb et all iepriekš aprakstītās metodes[34]. Pirmkārt, 1 g NaCl un 1,6 g pepsīna tika izšķīdināti 500 ml destilēta ūdens, lai iegūtu simulētu kuņģa šķidruma šķīdumu. (SGF). Vēlāk SGF šķīduma pH tika sakārtots līdz 2 ar HCl (5 M); 17,5 ml šī šķīduma sajauca ar 2,5 ml augu paraugiem un šo maisījumu ievietoja kratītā ūdens vannā 37 grādu temperatūrā 2 stundas, lai. imitēt gremošanas sistēmas peristaltikas kustības. Pēc 2 stundām paraugi tika ievietoti ledus vannā, lai inaktivētu fermentatīvās reakcijas; 2 ml paraugu tika atstāti malā kā "pēc kuņģa" (P) paraugs turpmākiem eksperimentiem. Aukstajos parauga šķīdumos atradās celulozes dialīzes membrāna, kas piekrauta ar atbilstošu NaHCO3 daudzumu (1 M, pH7); tādējādi tika atdarināta uzsūkšanās kuņģa-zarnu traktā. Pēc tam 4,5 ml žultsskābju/pankreatīna šķīduma tika apvienoti ar šķīdumiem, un maisījumu inkubēja vēl 2 stundas 37 grādu temperatūrā. Visbeidzot, šķidrums dialīzes membrānas iekšpusē tika iegūts kā "bioloģiski pieejams" paraugs (IN). Kad procedūra bija beigusies, visi paraugi tika saglabāti -20 pakāpē turpmākiem eksperimentiem. 4.5. Fenola profila novērtējums in vitro

4.5.1.Kopējā fenola satura noteikšana

Kopējā fenola satura spektrofotometriskā noteikšana paraugos tika veikta 96-iedobes plāksnes veidnē saskaņā ar metodi, ko iepriekš aprakstīja Baraks et al.【32】; tika pievienoti 75 uL NagCO3 (20 procenti H2O). 20 μL svaigi pagatavota parauga un standartšķīduma. Pēc tam ar maisījumu tika apvienoti 100 μL Folin-Ciocalteu reaģenta. Pēc 30 minūšu inkubācijas perioda istabas temperatūrā tumsā absorbcija tika mērīta pie 690 nm. Gallskābe tika izmantota kā standartšķīdums dažādās koncentrācijās, lai izveidotu kalibrēšanas līkni, un kopējais fenola saturs tika izteikts kā gallskābes ekvivalenti (GAE).

4.5.2.Kopējā flavonoīdu satura noteikšana

Kopējā flavonoīdu satura spektrofotometriskā noteikšana paraugos tika veikta 96-iedobes plāksnes veidnē saskaņā ar Bardakci et al iepriekš skaidroto metodi[51]; 150 ul 75 procentu etanola, 10 ul alumīnija hlorīda , un 10 uL 1M nātrija acetāta trihidrāta tika atsevišķi apvienoti ar 50 μL parauga un standartšķīduma. Pēc tam šos maisījumus inkubēja tumšās istabas temperatūrā 30 minūtes. Pēc inkubācijas perioda absorbcija tika aprēķināta pie 405 nm.Kvercetīnstika izmantots kā standartšķīdums dažādās koncentrācijās, lai izveidotu kalibrēšanas līkni, un kopējais flavonoīdu saturs tika attēlots kā kvercetīna ekvivalenti (QE). 4.5.3.Kopējā fenolskābes satura noteikšana

Kopējais fenolskābes saturs paraugos tika mērīts spektrofotometriski, ievērojot procedūru, par kuru iepriekš ziņoja Barak et al. [52]. Pirmkārt, destilētā ūdenī tika izšķīdināts atbilstošs nātrija nitrīta un nātrija molibdāta daudzums, lai iegūtu Arnow reaģentu. Pēc tam 1 ml paraugu atsevišķi apvienoja ar 1 ml Arnow reaģenta, 1 ml 0,1 M HCl un 1 ml 1 M NaOH. Pēc tam maisījuma tilpumu noregulēja līdz 10 ml ar destilētu ūdeni un nekavējoties nolasīja absorbciju pie 490 nm. Kofeīnskābe tika izmantota kā standartšķīdums dažādās koncentrācijās, lai iegūtu kalibrēšanas līkni, un kopējais fenolskābes saturs tika norādīts kā kofeīnskābes ekvivalenti (CAE).

4.5.4.Kopējā proantocianidīna satura pārbaude

Kopējā proantocianidīna satura spektrofotometriskā noteikšana paraugos tika veikta 96-iedobes plāksnes veidnē, izmantojot Barak et al. metodi. [1]Īsumā, 25 μL parauga šķīdumu tika sajaukti attiecīgi ar 150 μL 4 procentu vanilīna un 75 μL HCl šķīduma (32 procenti). Pēc 15 minūšu inkubācijas laika tumšās istabas temperatūrā absorbcija tika noregulēta līdz 492 nm. Katehīna hidrāts tika izmantots kā standartšķīdums dažādās koncentrācijās, lai iegūtu kalibrēšanas līkni. Kā kontroles šķīdums tika izmantots metanols. Kopējais proantocianidīna saturs paraugos tika norādīts kā katehīna ekvivalenti (CE).

4.6. Brīvo radikāļu attīrīšanas aktivitātes testi 4.6.1. DPPH radikāļu attīrīšanas aktivitātes tests

Paraugu DPPH radikāļu attīrīšanas aktivitāte tika noteikta 96-iedobes plāksnes veidnē pēc Celeb et al modificētās metodes.[53]. Sākumā tika svaigi pagatavots 150 uM DPPH šķīdums. Pēc tam 200 μL DPPH šķīduma tika sajaukti ar 25 μL parauga šķīdumiem. Pēc tam šo maisījumu inkubēja tumšās istabas temperatūrā 50 minūtes. Absorbcija tika aprēķināta pie 540 nm. Butilēts hidroksitoluols (BHT) tika izmantots kā standartšķīdums dažādās koncentrācijās. Kā kontroles šķīdums tika izmantots metanols. Paraugu aktivitāte tika uzrādīta kā EC50, kas atbilst koncentrācijai, kas uzrāda 50 procentu aktivitāti.

4.6.2. DMPD radikālas attīrīšanas aktivitātes tests

Paraugu DMPD plus (N,N-dimetil-p-fenilēndiamīna) radikāļu attīrīšanas aktivitāte tika veikta 96-iedobes plāksnes šablonā saskaņā ar metodi, ko iepriekš aprakstīja Inan et al. [13]. Pirmkārt, 10{{10}} mM DMPD plus šķīdums, 0,05 M FeCl; Tika svaigi pagatavots 6H2O šķīdums un 0,01 M acetāta buferšķīdums. Pēc tam 1 ml DMPD šķīduma, 100 ml acetāta buferšķīduma un 0,2 ml FeCl; 6H2O šķīdums tika sajaukts, un vēlāk 15 μL parauga šķīdumu tika apvienoti ar 210 μL šī maisījuma. Pēc inkubācijas perioda tumšās istabas temperatūrā 50 minūtes absorbcija tika mērīta pie 492 nm. Trolox tika izmantots kā standartšķīdums dažādās koncentrācijās, lai iegūtu kalibrēšanas līkni. Paraugu šķīdumu koncentrācija bija 1 mg/ml. Paraugu DMPD radikāļu attīrīšanas aktivitātes tika norādītas kā Trolox ekvivalenti (TE). 4.7. Metālu reducējošās aktivitātes testi

4.7.1. Dzelzs reducējošo antioksidantu jaudas tests (FRAP)

Paraugu FRAP aktivitātes noteikšana tika veikta 96 iedobju plāksnes veidnē, ievērojot procedūru, par kuru iepriekš ziņoja Bardakci et al.[54]. Eksperimenta sākumā FRAP reaģents tika izveidots, sajaucot acetāta buferšķīdumu, dzelzs-tripiridiltriazīnu un FeCl; 6H2O šķīdumi. Pēc tam FRAP reaģents tika ievietots 37 grādu krāsnī uz 30minūtēm. Pēc tam 10 ul parauga šķīdumu tika apvienoti ar attiecīgi 30 ul destilēta ūdens un 260 μL FRAP reaģenta. Pēc inkubācijas laika 37 grādu temperatūrā 30 minūtes absorbcija tika noregulēta uz 593 nm. Standarta līkne tika izveidota, izmantojot dažādas molaritātes dzelzs sulfāta (025-2 mM) šķīdumu, lai novērtētu rezultātus. BHT tika izmantots kā standartšķīdums dažādās koncentrācijās. Paraugu FRAP aktivitātes tika parādītas kā mM FeSO4 1 g sausā ekstrakta.

4.7.2. Varas samazinoša antioksidanta kapacitātes pārbaude (CUPRAC)

Paraugu CUPRAC aktivitāte tika noteikta 96-iedobes plāksnes veidnē pēc Celeb et al. modificētās metodes. 【31】; 85 μL CuSO4 (10 mM), neokuprīna un amonija acetāta šķīdumu un 51 ul destilēta ūdens pievienoja atsevišķi 43 ul parauga šķīdumu. Pēc inkubācijas perioda (20 minūtes) 50 grādu temperatūrā ūdens vannā absorbcija tika mērīta pie 450 nm. Askorbīnskābi izmantoja kā standartšķīdumu dažādās koncentrācijās, lai iegūtu kalibrēšanas līkni. Paraugu CUPRAC aktivitātes tika uzrādītas kā askorbīnskābes ekvivalenti (AAE). 4.8. Kopējās antioksidantu aktivitātes tests (TOAC) Paraugu kopējās antioksidanta aktivitātes noteikšana tika veikta 96-iedobes plāksnes veidnē, ievērojot Celeb et al. [55]. Sākumā tika sajaukts noteikts daudzums monobāziskā nātrija fosfāta, amonija molibdāta tetrahidrāta un sērskābes, lai iegūtu TOAC šķīdumu. Pēc tam 300 μL TOAC šķīduma pievienoja 30 μL parauga šķīdumu. Pēc inkubācijas perioda 95 grādu temperatūrā ūdens vannā 90 minūtes absorbcija tika noteikta pie 690 nm. Askorbīnskābi izmantoja kā standartšķīdumu dažādās koncentrācijās, lai iegūtu kalibrēšanas līkni. Paraugu TOAC aktivitātes tika attēlotas kā askorbīnskābes ekvivalenti (AAE). 4.9.Biopieejamības indeksa novērtējums

Biopieejamības indekss (BAvI) tika aprēķināts saskaņā ar teorētisko vienādojumu, ko aprakstīja Inan et al.[13]: BAVI=CIN/CND "Bioloģiskās pieejamības indekss" (BAvI) tika aprakstīts kā fenolu skaita attiecība. biopieejamajā paraugā (IN) uz nesagremotajā paraugā (ND). 4.10. Marķieru flavonoīdu kvantitatīva noteikšana ar HPTLC

Salidrosīda, hiperozīda un kvercitrīna koncentrācijas kvantitatīvā noteikšana visos simulācijas paraugos (ND, PG, IN) no Cistus sugas ūdens ekstraktiem tika veikta ar augstas izšķirtspējas plānslāņa hromatogrāfiju (HPTLC) (CAMAG, Muttenz, Šveice) pēc Guzelmeric et al apstiprinātās metodes.[16] Hiperozīds, salidrosīds un kvercitrīns tika sagatavoti 25, 50 un 100 ug/ml koncentrācijās, un svaigi pagatavoto paraugu šķīdumu koncentrācijas tika noregulētas uz 10 mg/ml. Šie šķīdumi tika uzklāti uz normālās fāzes silikagēla plāksnēm ar stikla pamatni (20 cm × 10 cm, Merck, Darmštate, Vācija) ar noteiktiem tilpumiem (1-5 μL standarta šķīdumiem un 5 ul parauga šķīdumiem), izmantojot 100 μL šļirces ( Hamiltona, Bonaduza, Šveice) Uzklāšanas procedūra tika veikta ar Linomat 5 paraugu aplikatoru. Izstrādes process tika veikts automatizētā izstrādes kamerā (ADC 2) un etilacetāts: dihlormetāns. etiķskābe. skudrskābe: ūdens (10:25:10). :10:10:10me) tika izvēlēta kā kustīgā fāze. Pēc tam plāksnes tika atvasinātas ar dabīgā produkta reaģentu (NPR) (1 g difenilborskābes 2-aminoetilesterīna 200 ml etilacetāta) iegremdēšanas ierīcē (CAMAG).hiperozīdsun kvercitrīns tika analizēti spektrofotometriski pie 260 nm, salidrozīda daudzums tika mērīts pie 330 nm ar UV skeneri. Standartu Rf vērtības tika noteiktas kā hiperozīds (≈0,35), kvercitrīns (≈0,45), tilirozīds (≈0,65). Tika konstatēts, ka korelācijas koeficienti (r2) ir × 0. marķieru flavonoīdu kvantitatīvai noteikšanai.

4.11. Ar diabētu saistītu enzīmu inhibējošā darbība

4.11.1. -Glikozidāzes inhibējošā aktivitāte

- Nesagremoto un bioloģiski pieejamo paraugu, kas iegūti no Cistus sugu ūdens ekstraktiem, glikozidāzes inhibējošās aktivitātes tika pārbaudītas pēc metodes, ko iepriekš skaidroja Balan et al. [56]. Pirmkārt, atbilstošs mononātrija fosfāta un nātrija fosfāta daudzums tika sajaukts ar 100mM fosfāta buferšķīdumu (pH7). o--glikozidāzes enzīms tika izšķīdināts fosfāta buferšķīdumā, lai iegūtu a-glikozidāzes šķīdumu (0.2U/mL). Pēc tam 170 ul fosfāta buferšķīduma, 20 μL -glikozidāzes šķīduma un 20 ul parauga šķīdumu tika apvienoti un inkubēti 37 grādu krāsnī 15 minūtes. Pēc tam maisījumam tika pievienoti 20 μL 2,5 mM p-nitrofenil- -D-glikopiranozīda šķīduma 100 mM kālija fosfāta buferšķīdumā (pH 7,0) un tika veikts vēl viens inkubācijas periods 37 °C temperatūrā. grādu 15 min. Pēc tam maisījumam pievienoja 80 μL 0, 2 M nātrija karbonāta šķīduma, lai pārtrauktu reakciju. Absorbcija tika mērīta pie 405 nm. Par atsauci tika izmantots kvercetīna šķīdums dažādās koncentrācijās. Rezultāti tika novērtēti kā inhibējošās aktivitātes procents 1 mg/mL un 0,5 mg/mL koncentrācijās Cistus sugu ūdens ekstraktu ND un IN paraugos. 4.11.2. -Amilāzes inhibējošā aktivitāte Nesagremotu un bioloģiski pieejamu paraugu, kas iegūti no Cistus sugas ūdens ekstraktiem, o-amilāzes inhibējošā aktivitāte tika noteikta, ievērojot Balan et al iepriekš aprakstīto procedūru.[56]. Paraugu a-amilāzes inhibējošās aktivitātes spektrofotometriskā noteikšana tika veikta, izmantojot DNS (3,5-dinitrosalicilskābes) reaģentu. Kā norādīts metodē, maltoze veidojas no cietes pārvēršanas, un sārmainā DNS dzeltenā krāsa pārvēršas oranži sarkanā krāsā, pateicoties maltozei, kas ražota no cietes. Tādējādi 96 mM DNS šķīdums tika sagatavots no nātrija kālija tartrāta šķīduma (izšķīdināts 2 M NaOH) un noteikta DNS daudzuma (izšķīdināts destilētā ūdenī) maisījuma. Pēc tam 20 grādu temperatūrā (pH: 6,9) sagatavoja 20 mM nātrija fosfāta buferšķīdumu ar 6,7 mM NaCl (u-amilāzes enzīma kofaktors). a-amilāzes enzīms (1 U/mL) un ciete (10 mg/mL) tika izšķīdināts šajā buferšķīdumā. Pēc tam 50 μL nātrija fosfāta buferšķīduma un 10 μL a-amilāzes enzīma šķīduma tika sajaukti ar 20 μL parauga šķīdumiem. Šo maisījumu inkubēja 37 grādu temperatūrā 45 minūtes. Pēc inkubācijas perioda maisījumam pievienoja 20 μL cietes šķīduma. Vēl viens inkubācijas periods tika sākts 37 grādos 45 minūtes. Tāda pati procedūra tika piemērota paraugiem, nepievienojot w-amilāzes enzīma šķīdumu, ko sauc par "parauga fonu". Kontroles grupa tika pētīta ar to pašu procedūru, ja nebija paraugu šķīdumu. Absorbcija tika mērīta pie 540 nm. Akarbozi izmantoja kā salīdzināmo šķīdumu dažādās koncentrācijās. Rezultāti tika parādīti kā inhibējošās aktivitātes procents 1 mg/mL un 0,5 mg/mL koncentrācijās ND un IN paraugos no Cistus sugu ūdens ekstraktiem. 4.11.3.AGE inhibējošā aktivitāte Nesagremotu un bioloģiski pieejamu paraugu AGE inhibējošā aktivitāte no Cistus sugu ūdens ekstraktiem tika noteikta pēc Starow-icz et al. [57]. Pirms jebkura procesa tika svaigi sagatavoti 1 mg / ml un 0, 5 mg / ml ND un IN paraugi. Pēc tam 1 ml ND un IN paraugu šķīdumu pievienoja 1 ml 10 mg/ml koncentrācijas liellopu seruma albumīna (BSA) šķīduma. Kontroles paraugi tika sagatavoti, nepievienojot ND un IN paraugu šķīdumus, un tukšie paraugi tika sagatavoti, nepievienojot 0, 5 M glikozi. Pēc tam visus sagatavotos paraugus 40 stundas inkubēja kratītā ūdens vannā 55 grādu temperatūrā. Pēc inkubācijas perioda beigām fluorescences intensitātes aprēķināšanai tika izmantots Thermo ScientificTM VarioskanTMLUX daudzmodu mikroplašu lasītājs 370 nm ierosmes/440 nm emisijas diapazonā. Kvercetīns tika izmantots kā standartšķīdums dažādās koncentrācijās.

4.12.Statistikas analīze

Visi eksperimenti tika veikti neatkarīgi trīs dažādos laikos. Lai noteiktu datu parametrisko vai neparametrisko sadalījumu, tika izmantota programmatūra GraphPad Prism (6.1 versija). Vienvirziena ANOVA Tukey vairāku salīdzinājumu analīzes sadaļa tika izmantota, lai novērtētu TPC, TFC, TPAC, TSC, TPACC, FRAP, CUPRAC, TOAC, DPPH un DMPD testus. No otras puses, o-amilāzes, glikozidāzes un AGE inhibīcijas eksperimentu rezultāti tika pārbaudīti, izmantojot divvirzienu ANOVA Sidaka vairāku salīdzinājumu analīzi. Nozīmīgi rezultāti tika parādīti ar p<0.05. 5.="">

Šajā pētījumā tika pētīti visu Turcijas florā reģistrēto Cistus sugu ūdens ekstrakti, lai noteiktu to fenola profilus un in vitro antioksidantu un pretdiabēta potenciālu. Tā kā novārījums vai infūzija ir izplatīta tradicionālo zāļu forma, eksperimentālos pētījumos aktivitātes novērtēšanai īpaši svarīgi ir izmantot ūdens ekstraktus. No otras puses, hidrofīlās sastāvdaļas ūdens ekstraktā pēc norīšanas tiek pakļautas virknei vielmaiņas transformāciju kuņģa-zarnu traktā. Tāpēc, lai pareizi novērtētu tradicionālo zāļu formu aktivitāti, ir jāizpēta arī bioloģiski pieejamo metabolītu aktivitātes.

Šis ir pirmais pētījums, kurā tiek pārbaudīta cilvēka gremošanas simulācijas metodes in vitro ietekme uz turku Cistus sugām. Turklāt šajā pētījumā pirmo reizi tika pētīts Turkish Cistus sugu inhibīcijas potenciāls uz AGE. Turklāt salidrozīdam, hiperozīdam un kvercitrīnam tika piešķirts marķierisflavonoīdi, un to koncentrācijas izmaiņas tika uzraudzītas in vitro gremošanas procedūrā. Lai gan kuņģa-zarnu trakta gremošanas procedūras negatīvi ietekmēja ekstraktu fenola saturu un pretdiabēta un antioksidantu aktivitātes, tiem joprojām bija ievērojama bioaktivitāte. Saskaņā ar rezultātiem C.saloifolius ekstrakts tika atklāts kā visspēcīgākais augs fenola satura un antioksidantu un pretdiabēta aktivitāšu ziņā. Visbeidzot, turku Cistus sugas gaisa daļām ir bagātīgs fenola saturs un potenciālas antioksidantu un pretdiabēta aktivitātes. Lai gan biopieejamības novērtēšanai tika izmantota in vitro gremošanas simulācijas metode, tā var pilnībā neatdarināt organismā notiekošos vielmaiņas ceļus. Tāpēc ir nepieciešami turpmāki in vivo un klīniskie pētījumi, lai detalizēti novērtētu fenola savienojumu biopieejamību un to ieguldījumu ziņotajā farmakoloģiskajā iedarbībā.

Šis raksts ir izvilkts no Molecules 2021, 26, 5322