Ekstrakta izdalīšana no mīkstā koraļļu simbiotiskā mikroorganisma Salinispora Arenicola, kam piemīt citoprotektīvs un pretnovecošanās efekts 1. daļa

Abstrakts: Šūnas ir izstrādājušas ļoti integrētu sistēmu, kas ir atbildīga par proteomu stabilitāti, proti, proteostāzes tīklu (PN). Tā kā proteostāzes zudums ir novecošanās un ar vecumu saistītu slimību pazīme, PN moduļu aktivizēšana, iespējams, var pagarināt veselības ilgumu. Šeit mēs sniedzam datus par ekstrakta (SA223-S2BM), kas attīrīts no Salinispora arenicola TM223-S2 celma, kas tika izolēts no mīkstā koraļļa Scleronephthya lewinsohni, bioaktivitāti; šis koraļlis tika savākts 65 m dziļumā no mezofotiskās Sarkanās jūras ekosistēmas EAPC (Eilatas dienvidos, Izraēlā). Cilvēka šūnu apstrāde ar SA223-S2BM aktivētiem proteostatiskajiem moduļiem samazināja oksidatīvo slodzi un nodrošināja aizsardzību pret oksidatīvo un genotoksisko stresu. Turklāt SA223-S2BM pastiprināja proteasomu un lizosomu katepsīnu aktivitātes Drosophila mušas un uzrādīja ādu aizsargājošu iedarbību, par ko liecina efektīva ādas novecošanās enzīmu, elastāzes un tirozināzes inhibīcija. Mēs iesakām, ka SA223-S2BM ekstrakts ir daudzsološs avots, lai prioritāti piešķirtu molekulām ar pretnovecošanās īpašībām.

Cistanche glikozīds var arī palielināt SOD aktivitāti sirds un aknu audos un būtiski samazināt lipofuscīna un MDA saturu katrā audā, efektīvi attīrot dažādus reaktīvos skābekļa radikāļus (OH-, H2O₂ utt.) un aizsargājot no izraisītiem DNS bojājumiem. ar OH-radikāļiem. Cistanche feniletanoīda glikozīdiem ir spēcīga brīvo radikāļu attīrīšanas spēja, augstāka reducējošā spēja nekā C vitamīnam, tie uzlabo SOD aktivitāti spermas suspensijā, samazina MDA saturu un zināmā mērā aizsargā spermas membrānas darbību. Cistanche polisaharīdi var uzlabot SOD un GSH-Px aktivitāti eksperimentāli novecojošu D-galaktozes izraisītu peļu eritrocītos un plaušu audos, kā arī samazināt MDA un kolagēna saturu plaušās un plazmā, kā arī palielināt elastīna saturu. laba attīrošā iedarbība uz DPPH, pagarina hipoksijas laiku novecojošām pelēm, uzlabo SOD aktivitāti serumā un aizkavē plaušu fizioloģisko deģenerāciju eksperimentāli novecojošām pelēm Ar šūnu morfoloģisko deģenerāciju eksperimenti ir parādījuši, ka Cistanche ir labas antioksidanta spējas un tas var būt zāles ādas novecošanās slimību profilaksei un ārstēšanai. Tajā pašā laikā ehinakozīdam Cistančā ir ievērojama spēja attīrīt DPPH brīvos radikāļus un novērst reaktīvās skābekļa sugas un novērst brīvo radikāļu izraisītu kolagēna noārdīšanos, kā arī tam ir laba iedarbība uz timīna brīvo radikāļu anjonu bojājumiem.

Noklikšķiniet uz cistanches herba

【Lai iegūtu plašāku informāciju:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

Atslēgvārdi: novecošana; antioksidantu reakcijas; jūras mikroorganisms; proteostāzes tīkls; Salinispora arenicola

1. Ievads

Novecošanu raksturo no laika atkarīga funkcionālo spēju un stresa izturības samazināšanās, kā arī paaugstināts mirstības un saslimstības līmenis [1]. Novecošana nav tikai pasīvs process, jo to regulē evolucionāri konservēti molekulāri un šūnu signalizācijas notikumi [2,3]. Organismus pastāvīgi izaicina gan iekšēji (ar vielmaiņu saistīti), gan ārēji (no uztura vai vides radīti) stresa faktori, kas var izraisīt bojātu biomolekulu pakāpenisku uzkrāšanos un galu galā apdraudēt šūnu homeostāzi [4,5]. Olbaltumvielas ir iesaistītas visās galvenajās šūnu funkcijās, un tāpēc proteomu homeostāze (proteostāze) ir būtiska šūnu funkcionalitātei un izdzīvošanai [6].

Proteomu integritāti uztur proteostāzes tīkls (PN), kas attiecas uz visiem subcelulārajiem nodalījumiem un tiek regulēts šūnu, audu un organisma līmenī, lai nodrošinātu organisma veselību un ilgmūžību [7]. Proteostāzes uzturēšanai šūnām ir jākoordinē un jāregulē visu polipeptīdu sintēzes, locīšanas, šķirošanas, transportēšanas un degradācijas funkcijas [8, 9]. Šīs šūnu funkcijas galvenokārt veic trīs galvenie savstarpēji saistīti PN zari, proti, molekulāro šaperonu tīkls, ubikvitīna-proteasoma (UPP) un autofagijas-lizosomu (ALP) proteolītiskie ceļi [10, 11].

Molekulārie šaperoni nodrošina pareizu olbaltumvielu locīšanu un konformācijas uzturēšanu, kā arī sadarbojas ar degradācijas ceļiem [12]. UPP ir galvenā proteīnu sintēzes kvalitātes kontroles vieta, un tā ir iesaistīta normālu īslaicīgu proteīnu un nelabojamu nepareizi salocītu vai nesalocītu proteīnu pārstrādē [6], savukārt ALP ir atbildīgs par olbaltumvielu agregātu un bojātu organellu atpazīšanu un noņemšanu. [13]. Proteostāzes zudums ir novecošanas pazīme [14], kā arī galvenais riska faktors daudzām ar vecumu saistītām cilvēka patoloģijām, tostarp vēzim, cukura diabētam, sirds un asinsvadu slimībām un neirodeģeneratīvām slimībām [15]. Tāpēc PN aktivizēšana tiek uzskatīta par daudzsološu pieeju, lai aizkavētu novecošanas un ar vecumu saistītu slimību rašanos un/vai progresēšanu [16–18].

Ādas novecošanos raksturo strukturālas un funkcionālas izmaiņas (cita starpā) ekstracelulārās matricas komponentos, piemēram, elastīnā [19]. Elastāze ir enzīms, kas iesaistīts elastīna noārdīšanā, izraisot grumbu veidošanos un elastības zudumu [20]. Tirozināze ir galvenais melanīna sintēzes enzīms, kas ir atbildīgs par (cita starpā) cilvēka ādas pigmentāciju [21,22]. Tomēr pārmērīga tirozināzes aktivācija ir saistīta ar vairākiem ādas traucējumiem, piemēram, hiperpigmentāciju un melanomu[22,23]. Tāpēc elastāzes un tirozināzes inhibīcija ir ievērojama pieeja ādas novecošanai.

Dabiskajiem produktiem (NP) ir sena vēsture — labi dokumentēta, pirms mūsdienu zinātnes un tehnoloģiju dzimšanas dažādās kultūrās — cilvēku slimību ārstēšanā [24–26]. Tādējādi NP var kalpot kā ļoti bagātināti izejmateriāli un sastatnes zāļu izstrādei; patiešām, vairāk nekā puse no visām zālēm ir vai nu NP, NP atvasinātas vai NP iedvesmotas [27–29]. Jūras pasaule, kurā ir vislielākā bioloģiskā daudzveidība, lielākoties nav izpētīta, un tāpēc tā var būt plašākais resurss jaunu NP atklāšanai [30]. Starp organismiem, kas dzīvo jūras vidē, mīkstie koraļļi ir daudzsološi bioaktīvo NP nodrošinātāji, un ir zināms, ka tajos ir daudz dažādu mikroorganismu [31, 32].

Ņemot vērā šos faktus, mēs pašlaik veicam plašu augstas caurlaidības NP skrīningu, lai identificētu bioaktīvās molekulas, kas potenciāli varētu aizkavēt šūnu novecošanos un/vai in vivo novecošanos. Šajā pētījumā mēs pārbaudījām Salinispora arenicola (S. arenicola) TM223-S2 celma metanola ekstraktu, proti, SA223-S2BM, izmantojot in vitro testus, kā arī uz šūnām balstītus testus. un in vivo bioloģiski vadītas pieejas. S. arenicola TM223-S2 celms tika izolēts no mīkstā koraļļa Scleronephthya lewinsohni (S. Levinson) (sākotnēji Verseveldt un Benayahu nosauca par Scleronephthya lewinsohni, 1978), kas tika ilgtspējīgi iegūts no mezofotiskās Sarkanās jūras ekosistēmas. Eilatas dienvidos, Izraēlā) 65 m dziļumā. SA223-S2BM metanola ekstrakts aktivizēja citoprotektīvos mehānismus gan cilvēka šūnās, gan Drosophila melanogaster (D. melanogaster) mušiņās, un in vitro radīja ādu aizsargājošas īpašības. Tāpēc SA223-S2BM ekstrakts varētu būt avots, lai varētu identificēt molekulas ar potenciālām citoprotektīvām un pretnovecošanās īpašībām.

2. Materiāli un metodes

2.1. SA223-S2BM ekstrakta izcelsme un izolācija

2.1.1. Koraļļu kolekcija

Mīksto koraļļu S. Levinson savāca ar ROV H800 (ECA Robotics), ko vadīja Sems Rotbergs R/V no Eilatas Jūras zinātņu starpuniversitāšu institūta (IUI). In situ fotografēšana tika veikta ar vāja apgaismojuma melnbalto kameru VS300 (ECA Robotics) un 1CAM Alpha HD kameru (SubC Imaging). Paraugi tika iegūti ar ROV sviru no Eilatas mezofotiskā rifa pie naftas mola termināļa (29◦300 47.0900 N, 34◦350 56.7100 E) 65 m augstumā 7. martā. 2017. Savākšanas vietai raksturīgs mērens slīpums ar akmeņainiem plankumiem, ko ieskauj smilšaina jūras gultne. Pēc savākšanas materiāls tika nekavējoties sasaldēts -80 ◦C. Vaučera paraugs tika saglabāts 70 % etanolā taksonomiskai identifikācijai un tika deponēts Telavivas Universitātes Steinhardta Dabas vēstures muzejā (SMNHTAU_Co{16}}).

2.1.2. Celmu izolācija un identifikācija

S. arenicola TM223-S2 tika izolēts no 1 ml S. Levinson parauga. Savākto mīksto koraļļu paraugu samaļ sterilā jūras ūdenī un karsēja 50 ◦C 1 stundu. Iegūtā suspensija tika sērijveidā atšķaidīta, uzklāta uz selektīvās izolācijas agara barotnes un inkubēta 28 ◦C temperatūrā vismaz 6 nedēļas. Salinispora celms tika izolēts, un kolonija tika attīrīta uz jūras buljona agara (MBA) (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ASV) un konservēta -20 ◦ C temperatūrā 10 procentu glicerīna šķīdumā.

2.1.3. Filoģenēzes izmeklēšana

Filogēnā analīze tika veikta, izmantojot 16S rRNS gēna fragmentu, kas amplificēts no S. arenicola TM223-S2 genoma DNS. Celma TM223-S2 genoma DNS tika izolēta, izmantojot DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. 16S ribosomu RNS fragments tika pastiprināts ar PCR, izmantojot praimerus 16S F 27, AGA GTT TGA TC(AC) TGG CTC AG (Tm: 56,3 ◦C) un 16S R 1492, TAC GG(CT) TAC CTT GTT (ACG ACT) Tm: 57,5 ​​◦C). Amplikoni tika sekvencēti ar Sangera sekvencēšanu, un sekvences tika saskaņotas ar NCBI Targeted Loci projekta 16S ribosomu RNS datubāzi, izmantojot MUSCLE. Izlīdzinājums tika manuāli pārbaudīts, un spraugas tika noņemtas. Evolūcijas vēsture tika secināta, izmantojot maksimālās varbūtības metodi un Tamura-Nei modeli [33] ar 1000 atkārtojumiem. Sākotnējais heiristiskās meklēšanas koks tika iegūts automātiski, piemērojot kaimiņu savienojuma un BioNJ algoritmus pāru attālumu matricai, kas aprēķināta, izmantojot maksimālās saliktās iespējamības (MCL) pieeju, un pēc tam izvēloties topoloģiju ar augstāku log varbūtības vērtību. Evolūcijas analīzes tika veiktas MEGA X versijā 10.1.7 [34].

2.1.4. Audzēšanas apstākļi

S. arenicola TM223-S2 sporas tika konservētas –20 ◦C temperatūrā 10 procentu glicerīnā. Pirms kultivēšanas celms tika atdzīvināts 15 dienas uz 15 cm Petri plāksnes, kas satur MB (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ASV), kas papildināts ar 2 procentiem agara (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA , ASV). Uz plāksnes virsmas tika uzliets sterils jūras ūdens (4 × 10 ml), un sporas un micēlijs tika iegūts no plāksnes, viegli skrāpējot virsmu ar skalpeli, lai izveidotu inokulātu. Šķidrā stāvokļa fermentācija (LSF) tika veikta 2 l Erlenmeijera kolbā 20 dienas 28 ◦ C temperatūrā un 130 apgr./min. Amberlite XAD16 sveķi (30 g/l) (Amberlite XAD16HP N, Certis, Lenntech, Delfgauw, Nīderlande) tika pievienoti pirms sterilizācijas, lai ļautu mikrobu metabolītu slazdīšanai in situ. Pieci mililitri inokulāta tika izmantoti, lai inokulētu 1 L uz MB, kas satur 30 g Amberlite XAD16 sveķu. Agara stāvokļa fermentācija kopā ar cietās fāzes ekstrakciju (SPE) [35] tika veikta uz MB barotnes (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ASV), kas papildināta ar 2% agara (Difco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ASV) 20 dienas 28 ◦C temperatūrā. Sterilizēts Amberlite XAD16 (35 g), kas sajaukts ar 35 ml inokulāta, tika homogēni izplatīts uz 1 MB agara Petri plāksnes (25 cm × 25 cm).

LSF gadījumā XAD16 sveķi tika atdalīti no buljona kultūras, filtrējot, un mazgāti ar ūdeni, pirms tos eluēja ar etilacetātu (100 ml) un pēc tam ar metanolu (100 ml). Eluāti tika koncentrēti līdz sausam vakuumā un izšķīdināti DMSO koncentrācijā 10 mg / ml. Iegūtais ekstrakts SA223-S2LAE (ekstrahēts, izmantojot etilacetātu) tika izmantots bioloģiskajiem novērtējumiem.

SPE gadījumā XAD16 sveķi tika iegūti, rūpīgi saskrāpējot agara plāksnes virsmu. Atgūtos sveķus mazgā ar ūdeni, lai likvidētu biomasu, pirms to eluēja ar etilacetātu (100 ml) un pēc tam ar metanolu (100 ml). Eluāti tika koncentrēti līdz sausam vakuumā un izšķīdināti DMSO koncentrācijā 10 mg / ml. Iegūtie ekstrakti, SA223-S2BAE (ekstrahēts, izmantojot etilacetātu) un SA223-S2BM (ekstrahēts, izmantojot metanolu), tika izmantoti bioloģiskajiem novērtējumiem.

2.2. Elastāzes un tirozināzes inhibējošās aktivitātes

Prioritārā ekstrakta elastāzi inhibējošā aktivitāte tika novērtēta, izmantojot IV tipa elastāzi no cūku aizkuņģa dziedzera (PPE) (Merck KGaA, Darmštate, Vācija) un substrātu N-sukcinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilīds (Merck KGaA, Darmštate, Vācija), kā aprakstīts iepriekš [36]. Kā ziņots iepriekš, tika noteikta ekstrakta spēja inhibēt tirozināzes katalītisko darbību L-DOPA oksidēšanā līdz dopahromam [37].

2.3. Šūnu līnijas, šūnu kultūras apstākļi un šūnu dzīvotspējas pārbaude

Cilvēka priekšādas fibroblasti (BJ šūnas) tika iegādāti no American Tissue Culture Collection (ATCC), savukārt cilvēka iemūžinātie keratinocīti (HaCaT šūnas) tika iegūti no Elabscience, Inc. Abas šūnu līnijas tika kultivētas Dulbecco modificētajā ērgļa barotnē (DMEM) (Thermo Fisher). Scientific Inc., Waltham, MA, ASV), kas papildināti ar 10% (v/v) liellopu augļa serumu (FBS) un 1% (v/v) neaizvietojamām aminoskābēm, un tika uzturēti 5% CO2, 95% apstākļos. mitrums un 37 ◦C. Visās izmantotajās eksperimentālajās procedūrās šūnas tika subkultivētas, izmantojot tripsīna / EDTA šķīdumu (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ASV). SA223-S2BM ekstrakta ietekme uz šūnu dzīvotspēju tika novērtēta, izmantojot MTT testu, kā ziņots iepriekš [38]. Šūnu apstrāde ar ūdeņraža peroksīdu (H2O2) un doksorubicīnu (DXR) tika veikta, kā aprakstīts attēlu leģendās; H2O2 un DXR tika iegūti no Merck KGaA (Darmštate, Vācija).

2.4. Drosophila līnijas un ilgmūžības tests

Šajā pētījumā mēs izmantojām Drosophila w1118 celmu, kas iegādāts no Bloomington Drosophila Stock Center (Bloomington, IN, ASV). Mušas tika uzturētas 25 ◦C un 60 procentu mitrumā 12 h gaismas: 12 h tumsas ciklā. Visos iesniegtajos eksperimentos tika analizēti tikai mušu somatiskie audi (galva un krūšu kurvis), jo reproduktīvajos audos ir atšķirīga proteostatisko mehānismu un novecošanas ātruma regulēšana, salīdzinot ar somatiskajiem audiem [39].

Mušu ilgmūžība tika pārbaudīta, kā aprakstīts iepriekš [40], izmantojot mušas mātītes un tēviņus (vienāds skaits uz dzimumu), kas tika kultivētas flakonos, kuros bija (vai nebija) pētītais ekstrakts. Mušas tika pārvietotas flakonos ar svaigu pārtiku ik pēc divām dienām, un nāves gadījumi tika reģistrēti katru dienu. Izdzīvošanas līknēm un statistiskajai analīzei tika izmantota Kaplan-Meier procedūra un log-rank (Mantel-Cox) tests; nozīmīgums tika pieņemts pie p < 0,05.

2.5. Reaktīvo skābekļa sugu (ROS) mērīšana

Šūnas vai mušu audi tika inkubēti ar CM-H2DCFDA krāsvielu (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ASV) koncentrācijā 10 µM PBS 30 minūtes tumsā (37 ◦C un 25 ◦C). Pēc krāsas noņemšanas šūnas vai mušu audus 15 minūtes inkubēja ar PBS tumsā (attiecīgi 37 ◦C un 25 ◦C), lizēja līzes buferšķīdumā [150 mM NaCl, 1% (v/v) NP{{ 11}}, 50 mM Tris, pH 8,0] un pēc tam centrifugēja pie 14,000 g 15 minūtes (4 ◦C). Pēc tam proteīnu saturs tika mērīts ar Bredforda testu (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ASV), un radītā fluorescence tika mērīta Spark® daudzmodu mikroplašu lasītājā (Tecan Trading AG, Männedorf, Šveice) ierosināšanas laikā. un emisijas viļņu garumi attiecīgi 490 un 540 nm. Ūdeņraža peroksīds (H2O2) tika izmantots kā pozitīva kontrole, jo ir plaši zināms, ka tas izraisa oksidatīvus bojājumus/stresu [41].

2.6. RNS ekstrakcija, cDNS sintēze un kvantitatīvā reālā laika PCR (Q-RT-PCR) analīze

Kopējā RNS tika ekstrahēta no šūnām, izmantojot RNAiso plus (Takara Bio Inc., Shiga, Japāna), un kvantitatīvi noteikta ar BioSpec-nano spektrofotometru (Shimadzu Inc., Kioto, Japāna). Pēc tam 1 µg RNS tika pārveidots par cDNS, izmantojot FastGene Scriptase II cDNS komplektu (NIPPON Genetics, Düren, Vācija). Lai veiktu kvantitatīvās reāllaika PCR analīzes, tika izmantots 5x HOT FIREPol® EvaGreen® qPCR Supermix (Solis BioDyne, Tartu, Igaunija) un PikoRealTM reāllaika PCR sistēma (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ASV). Pētīto cilvēka gēnu specifiskie praimeri bija tādi, kā aprakstīts iepriekš [42]. HMBS gēns tika izmantots kā normalizētājs.

2.7. Imunoblotēšanas analīze un proteasomu un katepsīnu aktivitātes mērīšana

Imunoblotēšanas pētījumi tika veikti, kā aprakstīts iepriekš [43]. Primārās un ar mārrutku peroksidāzi konjugētās sekundārās antivielas tika uzklātas 1 stundu istabas temperatūrā, un imūnbloti tika izstrādāti, izmantojot uzlaboto hemiluminiscences reaģentu komplektu (ClarityTM Western ECL Substrate, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, ASV). Imunoblotu kvantitatīvā noteikšana tika veikta, izmantojot skenēšanas densitometriju un ImageJ programmatūru [44].

Proteasomu un katepsīnu fermentatīvās aktivitātes šūnās vai mušu audos tika mērītas ar VersaFluor™ fluorometru sistēmu (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), izmantojot Suc-LLVY-AMC (himotripsīnam līdzīga aktivitāte, CT-L). un Z-FR-AMC fluorpeptīdi (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, ASV), kā aprakstīts iepriekš [42,45,46]. 6-bromoindirubīna-30 -oksīms (6BIO) tika izmantots kā pozitīva kontrole, jo ir zināms, ka tas aktivizē UPP gan cilvēka šūnās, gan Drosophila mušās [42,47]; zāles Rapamicīns tika izmantotas kā pozitīva ALP un katepsīnu indukcijas kontrole [48].

2.8. Izmantotās antivielas

Primārās antivielas pret 5 (sc-55009) proteasomas apakšvienību, NQO1 (sc-16464), Beclin 1 (BECN1) (sc-11427), klasterīnu (CLU) (sc{{7}). }), HSP27 (sc-13132), HSP70 (sc-59570) un GAPDH (sc-25778), kā arī ar mārrutku peroksidāzi konjugētās sekundārās antivielas tika iegādātas no Santakrusas. Biotechnology, Inc. (Dallasa, Teksasa, ASV). Primārās antivielas pret 53BP1 (4937), phospho-Histone H2A.XSer139 (H2A.X) (9718) un phosphor-p53Ser15 (9286) tika iegūtas no Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, ASV). Antiviela pret SQSTM1/p62 (BML-PW9860) tika iegādāta no Enzo Life Science, Inc. (Farmingdale, NY, ASV).

2.9. Statistiskās analīzes

Eksperimenti tika veikti vismaz dublikātos. Statistiskajām analīzēm tika izmantota programma MS Excel. Statistiskā nozīmība tika novērtēta, izmantojot Stjudenta t-testu (t-testu). Datu punkti atbilst neatkarīgo eksperimentu vidējam rādītājam, un kļūdu joslas apzīmē standarta novirzi (SD); nozīmīgums pie p < 0.05 vai p < 0,01 grafikos ir norādīts attiecīgi ar vienu vai divām zvaigznītēm.

3. Rezultāti

3.1. Ar mīksto koraļļu saistītā aktinomicīta identifikācija S. Levinson

Mērķtiecīgais mikrobu celms tika izolēts no koraļļa S. Levinson, kas ir mīksts koraļļu endēmisks Sarkanajā jūrā. Šo koraļļu kolonijas parasti atrodas dziļās vietās gan augšējo mezofotisko koraļļu rifu ekosistēmās (30–60 m), gan zemāko mezofotisko koraļļu rifu ekosistēmās (60–105 m) [49]. Turklāt tas ir azooksantelāta mīkstais koraļlis, kas savas enerģētiskās vajadzības iegūst, barojoties ar filtru, un tāpēc tas ir sastopams biotopos, kas pakļauti spēcīgām ūdens straumēm.

Filoģenētiskajā analīzē, kas balstīta uz 16S rRNS secību, tika konstatēts, ka izolāts TM223-S2 pieder pie Salinispora ģints (1. attēls).

Tā kā S. arenicola var atšķirt no S. Pacifica un S. tropica, pamatojoties uz 16S rRNS secību [50], mēs nosaucām šo izolātu S. arenicola TM223-S2 ar Genbank pievienošanās numuru MW446171. Celms tika kultivēts, kā norādīts sadaļā Materiāli un metodes, un ekstrahēts attiecīgi ar etilacetātu un metanolu. Sākotnējā bioloģiskā izmeklēšana liecināja, ka ekstraktam no šķidrās kultūras SA223-S2BAE un etilacetāta ekstraktam no cietās kultūras SA223-S2LAE nebija nekādas nozīmīgas bioloģiskās aktivitātes (S1. attēls). Tāpēc šajā pētījumā tika izmantots tikai metanola ekstrakts no cietās kultūras, kas saistīta ar ekstrakciju cietā fāzē, SA223-S2BM.

3.2. Ekstrakts SA223-S2BM neuzrāda toksicitāti cilvēka šūnās un aktivizē PN galvenās sastāvdaļas

Pirmkārt, mēs pārbaudījām SA223-S2BM ietekmi uz normālu ādas BJ fibroblastu un cilvēka iemūžinātu HaCaT keratinocītu dzīvotspēju, veicot MTT toksicitātes testu. Šim nolūkam šūnas tika inkubētas 24 stundas ar pieaugošām ekstrakta koncentrācijām, un, kā parādīts 2A1, A2 attēlā, ekstraktam nav citotoksiskas iedarbības ne uz vienu no divām pārbaudītajām šūnu līnijām koncentrācijās līdz 10 µg/mL. ; augstākās koncentrācijās (virs 10 µg/mL) ekstrakts samazina šūnu dzīvotspēju galvenokārt HaCaT šūnās.

Pēc tam mēs pētījām ekstrakta ietekmi uz šūnu ceļiem, kas nodrošina šūnas proteomu stabilitāti. Mēs novērojām, ka īslaicīga (24 h) BJ fibroblastu iedarbība uz pētāmo ekstraktu būtiski inducēja PSMB7 proteasomas gēna ekspresiju (koncentrācijā 10 µg/ml), bet paralēli tam bija tendence palielināt PSMB6 gēns tādā pašā koncentrācijā (2.B1. attēls). Turklāt ekstrakts izraisīja 20S proteasomas gēna PSMB6 un 19S proteasomas gēna RPN11 ekspresiju 1 µg/ml koncentrācijā HaCaT šūnās (2.B2. attēls). Turklāt BJ fibroblastu apstrāde ar ekstraktu 24 stundas izraisīja vieglu 20S 5 proteasomas apakšvienības ekspresijas līmeņu indukciju pie koncentrācijas 1 µg/ml (2.C attēls). Pamatojot mūsu konstatējumus, ekstrakta iedarbība ievērojami palielināja himotripsīnam līdzīgo proteasomu aktivitāti gan BJ fibroblastos, gan HaCaT keratinocītos pēc 24 stundu inkubācijas (attēls 2D1, D2); atšķirīgos pārbaudīto ekstrakta koncentrāciju rezultātus starp BJ un HaCaT šūnām var attiecināt uz šūnu tipam raksturīgiem efektiem.

Turklāt Q-RT-PCR ekspresijas analīzes atklāja, ka BJ fibroblastu apstrāde ar ekstraktu 24 stundas izraisīja ar ALP saistītu gēnu, ko sauc par CTSB, CTSL, CTSD un SQSTM1, ekspresijas līmeņus koncentrācijā 10 µg/mL ( Attēls 3A1). Turklāt mēs novērojām, ka HaCaT šūnu iedarbība uz ekstraktu 24 stundas izraisīja ALP funkcionalitātē iesaistīto gēnu (CTSB, CTSL, CTSD un SQSTM1) ekspresijas līmeņu indukciju (3A2. attēls).

Saskaņā ar šiem atklājumiem mēs novērojām ar autofagiju saistīto proteīnu BECN1 un SQSTM1/p62 regulēšanu pēc BJ fibroblastu iedarbības ar ekstraktu koncentrācijā 1 µg/ml (3.B1. attēls); paaugstināts proteīnu BECN1 un SQSTM1/p62 ekspresijas līmenis tika novērots arī HaCaT keratinocītos abās pētītajās koncentrācijās (3.B2. attēls). Saskaņā ar to mēs noskaidrojām, ka ekstrakts uzlaboja lizosomu katepsīnu fermentatīvo aktivitāti gan BJ, gan HaCaT šūnās (3C1, C2 attēls); atkal pārbaudīto ekstrakta koncentrāciju atšķirīgos rezultātus starp BJ un HaCaT šūnām var attiecināt uz šūnu tipam raksturīgo iedarbību.

Turklāt mēs pārbaudījām ekstrakta ietekmi uz galvenajiem molekulāro chaperonu ekspresijas līmeņiem. Tādējādi imunoblotēšanas analīzes atklāja, ka ekstrakts izraisīja molekulāro chaperonu CLU (abās pētītajās koncentrācijās) ekspresijas līmeņus BJ šūnās (3D1. attēls), kā arī HSP27 (1 µg/ml) un HSP70 (abās pētītajās koncentrācijās). HaCaT šūnās (3D2. attēls).

【Lai iegūtu plašāku informāciju:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】