pētījumi ir parādījuši, ka autofagijai ir svarīga loma šūnu LD nogulsnēšanās regulēšanā, 2. daļa

Lūdzu sazinietiesoscar.xiao@wecistanche.comlai iegūtu vairāk informācijas

2.14. Laktātdehidrogenāzes (LDH) tests

Saskaņā ar ražotāja norādījumiem šūnas tika ievietotas 96-iedobes plāksnē ar ātrumu 5000 šūnu/iedobē, un tika savākta barotne, lai ar testa komplektu (Nanjing Jiancheng Bioinženierijas institūts) izmērītu LDH līmeni. Pēc tam paraugu absorbcija tika noteikta ar Multiskan Spectrum (Thermo Fisher Scientific) pie 450 nm.

2.15. BODIPY493/503, BODIPY 581/591 C11 un MitoTracker tumši sarkana krāsošana

Dzīvās šūnas tika mazgātas ar PBS un inkubētas ar 2 ug/ml BOD-IPY 493/503 (InvitrogenTM, Cat D3922) vai BODIPY 581/591 C11 (BD-C11）(2).{15}} μM, InvitrogenTM, Cat D3861）PBS 15 minūtes 37 grādu temperatūrā. MitoTracker Deep Red krāsošanai dzīvās šūnas tika inkubētas ar 0,5 ug/ml MitoTracker Deep Red (InvitrogenTM, Cat M22426) PBS šķīdumā 30 minūtes 3 grādu temperatūrā. Tika divreiz mazgāti PBS un fiksēti 3,5% PFA 10 minūtes, kam sekoja mazgāšana un pretkrāsošana ar Hoechst 3342 (Sigma, Cat B2261) 10 minūtes, pirms tie tika pārklāti uz stikla priekšmetstikliņiem attēlveidošanai.cik daudz cistanche jāņemAttēli tika novēroti un fotogrāfijas tika uzņemtas ar fluorescences mikroskopiju (Olympus, Tokija, Japāna).

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

2.16.Hoechst un PI krāsošana

Šūnas tika iekrāsotas ar Hoechst 33 342 (1 ul, kas atšķaidīts ar 50 0 ul PBS, Sigma, Cat B2261) un (vai) PI (0, 1 ul, atšķaidīts ar 500 ul PBS, Solarbio, (cistanche miegs) 1102 min.) pēc tam fiksēts un novērots ar fluorescences mikroskopiju (Olympus, Tokija, Japāna).

2.17.Plūsmas citometrija

Šūnas tika sagremotas un noskalotas ar D-hank's, pēc tam iekrāsotas ar aneksīnu V-FITC (5 ul, kas atšķaidīts 500 ul PBS)/PI (0,1 ul, atšķaidīts ar 500 ul PBS) apoptozes komplektu (CA1020, Solarbio, Pekina, Chian). ) saskaņā ar ražotāja protokolu. Pēc tam apoptotiskās šūnas tika analizētas, izmantojot plūsmas citometriju (gvajaves easyCyterM 8, Millipore, ASV). Mitohondriju ROS un mitohondriju membrānas potenciāla mērījumi tika veikti, kā publicēts 【12】. SH-SY5Y šūnas tika iekrāsotas ar MitoSOX (2,5 μM, Invitrogen, ASV) vai ar JC1 (10 ug/ml, T-3168, Invitrogen, ASV) 37 grādu temperatūrā 30 minūtes. Pēc divreiz mazgāšanas ar PBS šūnas tika atkārtoti suspendētas aukstā PBS, kas satur 1 procentu FBS plūsmas citometriskai analīzei. Dati tika analizēti ar FCS Express programmatūru (Guava Easy CyterM8, Millipore, Hayward, CA, ASV).

2.18. Jūras zirgu elpošanas testi

Mitohondriju elpošanas funkcija dzīvās SH-SY5Y šūnās tika mērīta, izmantojot Seahorse ekstracelulārās plūsmas (XFe96) analizatoru (Agi-lent, Santa Clara, ASV), mainot skābekļa patēriņa ātrumu (OCR). SH-SY5Y šūnām, kas iesētas ar 3 × 10³ šūnām/iedobē, tika atļauts pielipt pie Seahorse šūnu kultūras plāksnēm un eksperimenta laikā sasniegt aptuveni 80 procentu saplūšanu. (cistanču tēja) Nākamajā dienā šūnas tika iepriekš apstrādātas ar Ka un pēc tam pakļauts MPP* iedarbībai vēl 24 stundas. OCR tika konstatēts pamata apstākļos, kam sekoja 1 μM oligomicīna, 1 μM FCCP, kā arī 1 μM rotenona un antimicīna A pievienošana.

Cistanche var uzlabot imunitāti

2.19. Statistiskā analīze

Dati tika parādīti kā vidējais ± SEM. Atšķirības nozīmīgumu noteica ar Stjudenta t-testu, divvirzienu dispersijas analīzi vai vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA), kam sekoja Tukey post hoc tests. Atšķirība tika uzskatīta par būtisku P<>

3. Rezultāti

Rezultāts1. Ka atjauno motoru disfunkciju un palielina dopamīna līmeni MPTP/p PD modeļa peļu striatumā

Lai izpētītu Kaon PD patoģenēzes neiroprotektīvo iedarbību, 4-mēnešus veciem C57BL/6 peļu tēviņiem tika injicēts neirotoksīns MPTP, lai izveidotu MPTP/p PD modeli, un tika ārstētas ar Ka (att. la). Pēc modeļa indukcijas tika izmantots rotarod tests un polu tests, lai novērtētu peļu motoru un uzvedības veiktspēju dažādās grupās. Kā parādīts, ar MPTP ārstētām pelēm rotarod darbības laiks bija ievērojami samazināts, un šo efektu novērsa Ka (1.b attēls). (cistanche tubulosa ieguvumi) Ka arī atjaunoja MPTP izraisītos uzvedības trūkumus, par ko liecina pagrieziena laika un kopējā laika samazinājums polu testā (1.c un d attēls), neietekmējot peļu ķermeņa svaru (att. le). Turklāt HPLC analīze parādīja, ka ar MPTP/p inficētām pelēm bija ievērojami pazemināts dopamīna līmenis striatumā, un šis līmenis tika atjaunots ar Ka apstrādi (1.f attēls). (cistanche tubulosa ekstrakts) Ka ārstēšana arī mazināja MPTP/p. p-inducēta dihidroksifeniletiķskābes (DOPAC, dopamīna metabolīta) līmeņa pazemināšanās striatumā (1.g attēls).supermens garšaugi cistancheŠie rezultāti liecina, ka MPTP izraisītām PD pelēm Ka atjauno motoru disfunkciju un palielina dopamīna līmeni striatumā.

2. rezultāts. Ka mazina DA neironu zudumu MPTP/p PD modeļa peļu SNpc

Tālāk, lai vēl vairāk novērtētu Kaon MPTP / p izraisīto DA neironu traucējumu neiroprotektīvo efektu, mēs pētījām tirozīna hidroksilāzes (TH) neironus peles SNpc, izmantojot imūnkrāsošanu. Kā parādīts 2a un b attēlā, MPTP/p izraisīja ievērojamu TH neironu skaita samazināšanos, ko mazināja Ka ārstēšana. Turklāt kopējo neironu stereoloģiskais skaits SNpc, kā definējis Nissl

1. att. Ka ārstēšana atvieglo motoru disfunkciju un palielina dopamīna līmeni MPTP/p PD modeļa peļu striatumā.

(a) Eksperimenta shēmas shematiska diagramma. (cistanche tubulosa reddit) (b) Laiks uz stieņa tika mērīts rotarod testa veikšanai trīs dienas pēc kārtas. (cd) Laiks, kas nepieciešams, lai apgrieztos (apgriešanās laiks) un nokāptu no staba (kāpšanas laiks), tika reģistrēts staba testā. (e) Peļu ķermeņa svars tika izmērīts pētījuma beigās. (fg) Dopamīns (DA) un dihidroksifeniletiķskābe (DOPAC) striatumā tika analizēti ar augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju. Dati ir izteikti kā vidējais ± SEM.n=9-10 katrai grupai (b,c,d);n=6-8 katrai grupai (f,g).ns, nav nozīmīgs,* P<><><0.001, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine;="" ka,kaempferol.="" staining,="" verified="" that="" the="" loss="" of="" th+="" cells="" reflected="" cellular="" death="" but="" not="" the="" downregulation="" of="" th="" expression="" and="" showed="" that="" ka="" treatment="" restored="" the="" decrease="" in="" the="" number="" of="" nissl-positive="" neurons="" in="" the="" snpc="" of="" mptp-treated="" mice="" from="" 43.3%="" to="" 25.4%="" (fig.="" 2c="" and="" d).in="" addition,="">Bioflavonoīdu priekšrocībasKa ievērojami uzlaboja MPTP izraisīto TH un DAT proteīna ekspresijas samazināšanos, ko mēra ar Western blot metodi (2e-g att.). Šie pierādījumi apstiprina Kaona neiroprotektīvo iedarbību PD peles modelī.

3. rezultāts. Ka samazina LD vakuolu uzkrāšanos un oksidatīvo stresu ar MPTP/p ārstētām pelēm SNpc

Arvien vairāk pierādījumu liecina par LD iesaistīšanos NDD [10], konsekventi mūsu iepriekšējais darbs identificēja palielinātu LD MPTP izraisītu PD peļu SNpc [12]. LD var viegli identificēt un parādīt apaļas, zema blīvuma struktūras ar viendabīgām struktūrām. amorfs saturs [28]. Parasti LD var degradēties ar autofagijas palīdzību, lai izvairītos no uzkrāšanās [29].nopirkt cistancheLai noskaidrotu, vai Ka var regulēt LD PD, LD uzkrāšanās tika analizēta ar transmisijas elektronu mikroskopiju (TEM) kontroles SNpc, MPTP/p un MPTP/p ＋ Ka pelēm. Kā parādīts mūsu iepriekšējā darbā [12], LD skaits un lielums bija

palielinājās MPTP/p pelēm, salīdzinot ar fizioloģiskā šķīduma apstrādātajām kontrolgrupām (3.a un b. att.), un ievērojami samazinājās ar Ka apstrādātām pelēm (3.c-e att.). Turklāt pelēm, kas apstrādātas ar Ka, LD biežāk tika novēroti arī tuvumā, ieskauti autolizosomās vai to degradēti, kas tika definēti kā elektronu blīvas lipofuscīna granulas. Turpmāka TH neironu histoloģiskā krāsošana ar BODIPY, krāsvielu, kas īpaši iezīmē neitrālos lipīdus un ko parasti izmanto LD noteikšanai [30], parādīja, ka gan BODIPY, gan LD skaits un lielums SNpc bija augstāks PD pelēm nekā kontroles grupās. un ievērojami samazināja Ka ārstēšana (3.f-h att.).

Ja LD nevar savlaicīgi noārdīt, uzkrātie LD var tikt pakļauti peroksidācijai un veicināt mitohondriju ROS izraisītu stresu [4],attālumskas pastiprina neirotoksicitāti un slimības progresēšanu. Tādējādi mēs tālāk pētījām gēnu ekspresijas profilus, kas saistīti ar aizsardzību pret brīvo FA toksicitāti (Gpx8), neitralizējošām oksidatīvām sugām, superoksīda radikāļiem (Sod3) un ūdeņraža peroksīdu (Cat) un FA metabolismu (Acsbg1 un Dbi), kā ziņots [31] , kas visi bija pārsteidzoši samazināti SNpc ar MPTP ārstētām pelēm, salīdzinot ar kontroles grupām, un šie efekti tika uzlaboti ar Ka ārstētām PD pelēm (3.i attēls). Tāpat MPTP / p palielināja arī mRNS ekspresijas līmeni

2. att. Ka uzlabo DA neironu zudumu MPTP / p PD modeļa peļu SNpc.

(ab) Tirozīna hidroksilāzes (TH) pozitīvo neironu mikrofotogrāfijas (a) un TH pozitīvo neironu stereoloģiskie skaitļi substantia nigra pars compacta (SNpc) (b). Mēroga joslas ir tādas, kā norādīts. (cd) Krezilvioleti pozitīvo šūnu mikrofotogrāfijas (c) un krezilvioleti pozitīvo šūnu stereoloģiskie skaitļi SNpc (d). Mēroga josla, 120 um. (piem.) Western blot analīze TH un DAT proteīna ekspresijai SNpc (e) un kvantitatīvā analīze (f, g). Kvantitatīvie dati tiek normalizēti ar fizioloģiskā šķīduma kontroles grupu. Dati ir izteikti kā vidējais ± SEM.*P<><0.01, by="" one-way="" anova="" followed="" by="" tukey's="" post="" hoc="" test.n="4-5" for="" each="" group.="" ve,="" vehicle,="" ka,="" kaempferol;="" mptp,1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydroloyridine..="" (for="" interpretation="" of="" the="" references="" to="" color="" in="" this="" figure="" legend,="" the="" reader="" is="" referred="" to="" the="" web="" version="" of="" this="" article.="" of="" nadph="" oxidase="" subunits="" such="" as="" nox1,="" nox2,="" and="" nox4="" in="" the="" snpc="" of="" mptp/p="" mice,="" which="" were="" further="" blunted="" by="" ka="" treatment="" (fig.="" 3j).="" taken="" together,="" these="" data="" suggest="" that="" ka="" alleviates="" mptp/p-induced="" ld="" accumulation,="" peroxidation,="" and="" ros-mediated="">

4. rezultāts. Ka aizsargā SH-SY5Y šūnas pret MPP plus izraisītu apoptozi

MPP, MPTP aktīvais metabolīts, inhibē mitohondriju kompleksos enzīmus un izraisa šūnu nāvi, kas ir tieši saistīta ar PD [32]. Pēc tam mēs pētījām, vai Ka varētu novērst MPPt izraisītu neironu apoptozi in vitro. Kā parādīts 4.a un b attēlā, MPPt (40 uM, 24 h) izraisīja LDH izdalīšanos no SH-SY5Y šūnām, un Ka (30 un 60 uM) būtiski mazināja LDH izdalīšanos, neietekmējot šūnu izdzīvošanu (4.a attēls). Tā kā Ka izraisīja būtisku aizsargājošu efektu koncentrācijā 30 μM (att. 4b), mēs izmantojām šo koncentrāciju turpmākajos eksperimentos. Hoechst/PI krāsošanas rezultāti arī parādīja, ka Ka ievērojami samazināja šūnu procentuālo daudzumu ar MPPt izraisītu hromatīna kondensāciju (4.c un d. attēls) un šūnu apoptozi, par ko liecina palielinātā Hoechst fluorescences intensitāte (4.c att.) un Ar Hoechst/PI iekrāsotas šūnas (Hoechst plus /PI') (4.e attēls). Turklāt, kā noteikts plūsmas citometrijā, MPP plus izraisīta šūnu apoptoze, par ko liecina palielināts ar aneksīnu V iekrāsoto šūnu procentuālais daudzums (AV/PI un AV plus /PI plus ), tika aizsargāts ar Ka (4.f un g attēls). Turklāt Ka ievērojami mainīja MPP izraisītās izmaiņas ar apoptozi saistītā proteīna ekspresijā, par ko liecina Bcl-2 augšupregulācija, Bax pazemināta regulēšana (4. hi-j att.) un samazināta kaspāzes-3 šķelšanās. (4h, k att.). Šie dati liecina, ka Ka var novērst MPPt kaitīgo ietekmi uz šūnu izdzīvošanu.

5. rezultāts. Ka nomāc MPPt izraisītu LD uzkrāšanos un lipīdu peroksidāciju, kas mediē mitohondriju bojājumus SH-SY5Y šūnās

Jaunākie pētījumi liecina, ka negaidīta LD uzkrāšanās var izraisīt paaugstinātu lipīdu peroksidācijas izraisītu stresu un paātrināt mitohondriju disfunkciju, kas veicina neirodeģenerāciju [10]. Mūsu iepriekšējais darbs arī parādīja, ka palielinātie LD SNpc bija saistīti ar PD patoloģiju pelēm [12]. Lai izpētītu, vai Ka aizsargājošais efekts bija saistīts ar LD uzkrāšanos in vitro, mēs vispirms veicām LD specifisku krāsošanu SH-SY5Y šūnās, izmantojot BODIPY 493/503, un novērojām palielinātu LD nogulsnēšanos (paaugstināts neitrālo lipīdu līmenis)

6. rezultāts. Ka veicina autofagiju un samazina mtROS veidošanos MPP plus apstrādātās SH-SY5Y šūnās

Parasti LD tiek nogādāti lizosomās caur autofagiju, un tos var sadalīt FA, lai izvairītos no peroksidācijas. Tomēr pierādījumi liecina, ka ir traucēta autofagija, kam ir izšķiroša nozīme PD [2]. Ja autofagija ietver LD sadalīšanu porcijās, lai tās sadalītos lizosomās (6.a attēls), šo procesu īpaši sauc par lipofagiju [2]. Lai noskaidrotu, vai autofagija ir iesaistīta Ka neiroprotektīvajā iedarbībā, mēs pārbaudījām ar autofagiju saistīto proteīnu līmeni. Kā parādīts 6b-d attēlā, kultivētās SH-SY5Y šūnās ar mikrotubuliem saistītā proteīna vieglās ķēdes 3 (LC3)-II līmenis bija ievērojami samazināts, savukārt p62 ekspresija bija ievērojami palielināta ar MPP plus apstrādātajām šūnām. ko mēra ar imūnblotēšanu, un šo efektu ievērojami mainīja Ka. Tālāk mēs pētījām izmaiņas autofagijā, imūnkrāsojot LC3. Lai ļautu autofagosomām uzkrāties šūnās, tika pievienots bafilomicīns, lai novērstu autofagosomu saplūšanu ar lizosomām. Kā parādīts, ar MPP* apstrādātajās šūnās tika konstatēts palielināts LC3b puncta skaits, kas liecina par traucētu autofagisko degradāciju, un šo efektu arī mainīja Ka (6.e un f attēls). Šie rezultāti liecina, ka LD SH-SY5Y šūnās tiek mobilizēti ar autofagiju iespējamai noņemšanai un ka Ka var veicināt autofagiju, lai samazinātu oksidēto lipīdu uzkrāšanos. Paaugstināta lipīdu peroksidācija var saasināt mitohondriju bojājumus, palielinot mitohondriju oksidatīvo stresu [4]. Turklāt Ka ārstēšana ievērojami samazināja robusto mtROS veidošanos, ko noteica MitoSOX krāsošana (6.g un h att.), un samazināja disfunkcionālu mitohondriju skaitu, ko noteica mitohondrijiem raksturīgās etiķetes, lai atšķirtu elpojošo (MitoTracker dziļi sarkans) un kopējo ( MitoTracker zaļš) mitohondriji (6.i un j att.). Turklāt, lai iegūtu tiešu skatu uz mitohondriju izmaiņām, mēs tālāk noteicām skābekļa patēriņa ātrumu (OCR), izmantojot Seahorse XF analizatoru. Kā parādīts 6.k attēlā, mitohondriju elpošana tika samazināta ar MPPt apstrādātajās šūnās, savukārt Ka ārstēšana acīmredzami novērš šo MPP plus radīto bojājumu (6.k attēls).

Rezultāts7. Autofagijas inhibīcija apvērš Kaon LD uzkrāšanās, mitohondriju disfunkcijas un DA neironu bojājumu nomācošo efektu in vitro

Lai pārbaudītu, vai autofagija ir viens no galvenajiem mehānismiem, ar kuru Ka mediē DA neiroprotekciju, tika izmantots autofagijas inhibitors 3-MA. Mēs atklājām, ka Ka inhibējošā ietekme uz MPP# izraisītiem bojājumiem, tostarp samazināta LD uzkrāšanās (7.a un b. att.), samazināta mtROS ražošana (7.c un d. attēls) un atvieglota mitohondriju disfunkcija (7.e un f. attēls) SH-SY5Y šūnas tika ievērojami bloķētas ar 3-MA. Tā kā LD oksidācija un mitohondriju disfunkcija ir cieši saistītas ar DA neironu nāvi, mēs pēc tam pārbaudījām primāri kultivētos DA neironus. Mēs apstrādājām kultivētos mesencephalon TH plus neironus ar Ka un / vai MPPf un kvantitatīvi noteicām TH plus neironu procesu skaitu un garumu, izmantojot imūnkrāsošanu. Morfoloģiskā analīze atklāja, ka neironu procesu skaitu un garumu ievērojami samazināja MPP plus un aizsargāja Ka, un šo aizsardzību vēl vairāk mainīja 3-MA (7.g-i. att.). Šie dati liecina, ka Ka mazina DA neironu bojājumus, veicinot autofagiju.

8. rezultāts. Atg5 klusēšana atcēla Ka-mediēto neironu zuduma novēršanu in vivo

Lai vēl vairāk apstiprinātu, ka Ka aizsargā pret MPTP / p izraisītu TH plus neironu zudumu no autofagijas atkarīgā veidā, mēs apklusinājām Atg5, divpusējā meencefalonā mikroinjicējot ar adeno saistītu vīrusu (AAV), kas ekspresē iepriekš raksturotu shRNS pret Atg5 (att. .8a), kā aprakstīts iepriekš [25]. Sākotnējos eksperimentos mēs novērojām, ka Atg5 shRNS transfekcija 2 nedēļas panāca pietiekamu GFP ekspresiju TH plus neironos (8.b att.) un inhibēja ATG5 ekspresiju injicēto peļu SNpc (Zīm. 8c). Mēs noskaidrojām, ka Atg{13}}notriekšana mainīja Ka neiroprotektīvo efektu, par ko liecina paaugstināta TH proteīna ekspresija (8.d un e attēls) un palielināts TH plus neironu skaits (8.f un g attēls). Šie dati vēl vairāk apstiprina autofagijas ieguldījumu Ka aizsargājošajā iedarbībā PD pelēm. Noslēgumā mēs apstiprinājām, ka Ka aizsargā pret MPTP / p izraisītiem bojājumiem, samazinot LD oksidāciju un mitohondriju disfunkciju, veicinot autofagiju.

4. Diskusija

Šis pētījums parādīja, ka dabiskā mazā molekula Ka bija galvenais faktors, ar kuru autofagiskā signalizācija varēja kavēt lipīdu oksidatīvo toksicitāti. Mūsu rezultāti parādīja, ka autofagijas ceļš ir galvenā regulējošā cilpa, caur kuru Ka mazina LD peroksidāciju un sekojošus mitohondriju bojājumus, un koncentrējās uz autofagijas regulētās LD toksicitātes lomu mitohondriju bojājumu mazināšanā, vienlaikus novēršot neirodeģenerāciju pārmērīga oksidatīvā stresa dēļ (att. 9).

LD ir neitrālu lipīdu uzglabāšanas intracelulāras vietas [5], un tās ir būtiskas lipīdu metabolismam un enerģijas homeostāzei, savukārt LD disfunkcija ir saistīta ar daudzām slimībām [16]. Uzkrājošie pierādījumi liecina, ka LD loma bioloģijā un patoloģijā ir ievērojami plašāka, nekā tika uzskatīts iepriekš. CNS ir pierādījumi, ka palielināts LD neironos un glia ir saistīts ar neirodeģeneratīvo patoloģiju [10,36]. Sīkāk LD ir konstatēti gan Aplysia neironu aksonos, kas kultivēti in vitro [37], gan smadzeņu sekcijās no Hantingtona slimības modeļi [38]. Turklāt tika pierādīts, ka neironi ir īpaši jutīgi pret lipīdu toksicitāti, un LD uzkrāšanās, ko nevar savlaicīgi noņemt, izraisa paātrinātu LD peroksidāciju un var izraisīt neirodeģenerāciju [17].

Lipīdu uzkrāšanās hiperaktīvos neironos ir toksiska ne tikai tāpēc, ka šie lipīdi ir jutīgi pret peroksidāciju. Turklāt liekā LD saturs var iekļūt neoksidatīvos vielmaiņas ceļos, izraisot pārmērīgu keramīda veidošanos, kas ir toksisks šūnām [39]. Jaunākie pētījumi ir arī parādījuši, ka šūnās ar LD defektiem FA var pārveidot par acilkarnitīniem, kas pēc tam izraisa mitohondriju disfunkciju un ROS veidošanos [40]. Šiem procesiem, visticamāk, būs specifiskas un dziļas sekas hiperaktīvos neironos, jo disfunkcionāli mitohondriji apdraud FA patēriņa spēju, un mtROS ražošana vēl vairāk izraisa membrānas lipīdu peroksidāciju.

Tādējādi LD homeostāzei jābūt labi kontrolētai neironos, kas ir ļoti svarīgi, lai izvairītos no toksicitātes un galu galā saglabātu smadzeņu veselību. Šajā pētījumā mēs esam noskaidrojuši, ka mazā dabiskā molekula Ka inhibē neironu LD toksicitāti, kas izpaudās kā palielināta LD uzkrāšanās, paaugstināta lipīdu peroksidācija un paaugstināta ar lipīdu toksicitāti saistītā gēnu ekspresija MPP # inficētajās SH-SY5Y šūnās. Vēl svarīgāk ir tas, ka mēs esam arī parādījuši, ka ārstēšana ar Ka samazina 45]. Šajā pētījumā mēs novērojām defektīvu autofagiju/lipofagiju MPPt ievainotajās neironu šūnās, tostarp samazinātu LC3-II līmeni un paaugstinātu p62 ekspresiju, un palielināts šūnās nogulsnēto LC3B punktu skaits. Bojāta lipofagija ievainotajās SH-SY5Y šūnās tika novērsta, apstrādājot ar Ka. Tā rezultātā Ka samazināja oksidēto LD, bojāto mitohondriju uzkrāšanos un mtROS veidošanos ar MPP # apstrādātajās SH-SY5Y šūnās. Svarīgi, ka autofagijas inhibīcija ar 3-MA atcēla Ka-mediēto oksidēto LD un bojāto mitohondriju elimināciju un mazināja DA neironu bojājumus in vitro. Turklāt autofagijas inhibīcija ar Atg5 notriekšanu in vivo mainīja Kaon DA neironu deģenerācijas aizsargājošo iedarbību MPTP izraisītajā PD peles modelī. Kopumā šie atklājumi liecina, ka Ka inhibē ar LD toksicitāti saistītus mitohondriju bojājumus, veicinot autofagiju eksperimentālā PD modelī.

Uzkrājošie pierādījumi liecina, ka palielināta mtROS veidošanās ir galvenā augstas aktivitātes neironu īpašība, un tā ir novērota daudzos NDD, tostarp PD [46]. Ziņojumi par to, vai ROS ir LD veidošanās cēlonis vai sekas, ir pretrunīgi [47,48]. Interesanti, ka mūsu in vitro rezultāti parādīja, ka LD peroksidācijas farmakoloģiskā inhibīcija ar o-tokoferolu novērsa mtROS veidošanos un mitohondriju membrānas potenciāla anomālijas un mazināja mitohondriju samazināšanos, par ko liecina Tomm20 krāsošana SH-SY5Y šūnās, kas atbalsta domu, ka LD peroksidācijai ir nozīme. cēloņsakarība MPP izraisītā mitohondriju disfunkcijā un mtROS veidošanā. Tomēr ir iespējams, ka paaugstināts ROS sākotnēji paātrina LD veidošanos, un pēc tam LD izraisa turpmāku ROS veidošanos un saasina intracelulāro un mitohondriju ROS līmeni.

Šajā pētījumā mēs parādījām, ka pelēm ar MPTP izraisītu PD bija augsts LD uzkrāšanās līmenis, ko pavadīja palielināts DA neironu zudums, paātrināts ROS izraisīts stress un uzvedības deficīts. Ka ārstēšana novērsa LD toksicitāti in vitro un uzlaboja DA neironu zudumu un uzvedības deficītu PD peles modelī, un šīs sekas bija atkarīgas no autofagijas. Tāpēc ir saprātīgi secināt, ka Ka veicina autofagiju, un šī pastiprinātā autofagija samazina oksidētā LD uzkrāšanos, samazina mtROS veidošanos un mazina mitohondriju bojājumus DA neironos, kas veicina LD toksicitātes inhibīciju, tādējādi mazinot PD patoloģiju (att. . 9).

Finansējums

Šo pētījumu atbalstīja Ķīnas Nacionālā dabaszinātņu fonda (Nr. 81903587), Ķīnas Pēcdoktorantūras zinātnes fonda finansētā projekta (Nr. 2019M661807), Dzjansu provinces Dabaszinātņu fonda (Nr. BK20190120) un Nanjingas Ķīniešu medicīnas universitātes ķīniešu Materia Medica pirmās klases disciplīnas atklātais projekts (Nr. 2020YLXK006) un lielais zāļu jauninājumu projekts (Nr. 2018ZX09711001-003-007).

Šis raksts ir izvilkts no Redox Biology 41 (2021) 101911