Karnovska fiksators novērš artefaktu parādīšanos kā vakuolāciju, kas rodas audu apstrādes rezultātā nierēs, kas apstrādātas ar antisense oligonukleotīdu Ⅰ

Anotācija: Antisense oligonukleotīds(ASO) terapija ir identificēta kā jauna ārstēšanas metodeneārstējamas slimības. Innieres, kas ārstētas ar ASO, vakuoli, papildus bazofīlajām granulām, bieži tiek novēroti proksimālajās kanāliņos. Dažos ziņojumos ir aprakstīts, ka šīs vakuoli, visticamāk, ir sekundāra parādība, ko izraisaASO ieguveaudu apstrādes laikā. Šajā pētījumā mēs salīdzinājām nieru morfoloģiju pēc fiksācijas ar Karnovska fiksatoru vai 4% paraformaldehīda fosfāta buferšķīdumu (PFA) ar 10% neitrāli buferētu formaldehīda šķīdumu (NBF). Tika pārbaudītas Sprague-Dawley žurku mātītes, kuras 1 vai 2 nedēļas četras reizes intravenozi ārstēja ar 50 mg/kg bloķētu nukleīnskābi, kas satur antisensu oligonukleotīdus (LNA-ASO). Mikroskopiski nierēs, kas fiksētas ar NBF, tika novērotas vakuolas un bazofīlās granulas proksimālajās kanāliņos. Bazofīlās granulas liecina par ASO uzkrāšanos. Turklāt dažās vakuolās bija arī vājas bazofīlas granulas, kas liecina, ka vakuoli bija saistīti ar ASO uzkrāšanos. Lai gan proksimālajās kanāliņos tika novērota mērena vakuolācija, lielākā daļa vakuolēto epitēlija bija negatīvi attiecībā uz nieru bojājuma molekulu-1 imūnhistoķīmiskas krāsošanas laikā. Paraugos, kas pakļauti Karnovska fiksācijai, vakuoli proksimālajās kanāliņos netika novēroti, lai gan tika novērotas bazofīlās granulas. Paraugos, kas pakļauti PFA fiksācijai, vakuoli un bazofīlās granulas tika novērotas proksimālajās kanāliņos, līdzīgi kā paraugos, kas pakļauti NBF fiksācijai. Kopumā mūsu atklājumi parādīja iespēju pārvērtēt vakuolāciju audu apstrādes laikā artefaktu dēļ, izmantojot parasto NBF fiksāciju. Karnovska fiksators tiek uzskatīts par noderīgu alternatīvu mākslīgo vakuolu atšķiršanai no patiesas nefrotoksicitātes. (DOI: 10,1293/tox.{11}}; J Toxicol Pathol 2021; 34: 367–371)

Atslēgvārdi:antisense oligonukleotīds, artefakts,Karnovska fiksators, vakuolācija, bazofīlā granula, nieres

Cistanche uztura bagātinātājs nieru funkcijas atbalsta papildinājums PhGs75% Ech 30% Act 12%

Nesen antisense oligonukleotīdu (ASO) terapijas tika izveidotas kā jaunas metodes neārstējamu slimību ārstēšanai1, 2. ASO ir īsi, sintētiski, vienpavedienu oligodeoksinukleotīdi, kas saistās ar ribonukleīnskābi un nomāc gēnu ekspresiju3.

Toksikoloģiski ASO izraisīto toksicitāti iedala no hibridizācijas atkarīgā toksicitātē, kas ir saistīta ar ASO secību, un no hibridizācijas neatkarīgā toksicitātē, kas saistīta ar ķīmisko modifikāciju. No hibridizācijas neatkarīgu toksicitāti izraisa trīs galvenie mehānismi: 1) ASO uzkrāšanās, 2) pretiekaisuma iedarbība un 3) aptamēra saistīšanās efekti4. ASO uzkrāšanās galvenokārt tiek novērota aknās un nierēs, un pārmērīga uzkrāšanās izraisa šo orgānu disfunkciju5. Iekaisuma veicinošo efektu izraisa iedzimtas imūnsistēmas stimulēšana, saistoties ar Toll līdzīgiem receptoriem grauzējiem un pērtiķiem, vai alternatīvā komplementa ceļa aktivizēšana, inhibējot H faktoru ar ASO pērtiķiem6. Aptamēriskā saistīšanās efekts izraisa trombocītu aktivāciju un agregāciju/trombocitopēniju, lai piesaistītu trombocītiem specifisko receptoru7. Turklāt aptamēriskā saistīšanās ar intracelulāriem proteīniem hepatocītos tiek uzskatīta par vienu no hepatotoksicitātes cēloņiem8–10. Lai atklātu šo toksicitāti, pētnieki ir izstrādājuši vairākus neklīniskus testus; starp tiem histopatoloģiskā izmeklēšana ir viens no jutīgākajiem testiem, lai noteiktu ASO uzkrāšanos.

Histopatoloģiski ASO uzkrāšanās parasti tiek novērota kā bazofīlas granulas Kupfera šūnu citoplazmā aknās vai proksimālajās nieru kanāliņos. Ievērojama bazofīlo granulu uzkrāšanās ir saistīta ar palielinātu deģeneratīvu izmaiņu biežumu vai smagumu, ko parasti novēro kā vakuolāciju vai proksimālā kanāliņu epitēlija deģenerāciju/nekrozi nierēs4. Tikai bazofīlās granulas netiek uzskatītas par toksikoloģiski nozīmīgām11; tāpēc, lai novērtētu ar ASO saistītu toksicitāti, ir svarīgi atšķirt bazofīlo granulu uzkrāšanos no deģeneratīvām izmaiņām.

Vakuoli, kas bieži tiek novēroti ar ASO ārstētu cynomolgus pērtiķu nieru proksimālajās kanāliņos, satur bazofīlo materiālu un uzrāda tādu pašu vispārējo sadalījumu šūnās kā bazofīlās granulas11, 12. Daži ziņojumi liecina, ka fiksācijas process var ietekmēt ASO uzkrāšanās parādīšanās fagolizosomu nodalījumā5, 11. Turklāt Henry et al. un Engelhards aprakstīja, ka vakuoli proksimālajās kanāliņos, visticamāk, ir sekundāra parādība, ko izraisa ASO ekstrakcija apstrādes laikā, jo vakuolu nav paraformaldehīda/glutaraldehīda perfūzijas fiksētajās nierēs5, 11. Vakuoli proksimālajos kanāliņos pērtiķiem, kas ārstēti ar cynomolgus. Ar mipomersenu tika uzskatīts, ka tas varētu parādīties fiksācijas procesa laikā13.

Tādējādi, lai gan vakuolācija ASO apstrādes dēļ dažos gadījumos var būt artefakts, šī hipotēze nav skaidri pierādīta, un neviens ziņojums nav identificējis piemērotu fiksācijas metodi toksikoloģiskajam novērtējumam. Attiecīgi šajā pētījumā mēs salīdzinājām nieru morfoloģiju pēc fiksācijas ar Karnovska fiksatoru vai 4% paraformaldehīda fosfāta buferšķīdumu (PFA) ar 10% neitrāli buferētu formaldehīda šķīdumu (NBF). Turklāt mēs parādījām Karnovska fiksatora kā alternatīva fiksatora lietderību, lai novērstu artefaktu izraisītu vakuolāciju.

Četras nedēļas vecas Sprague-Dawley žurku mātītes tika iegādātas no Charles River Laboratories Japan Inc. (Kanagawa, Japāna) un aklimatizētas laboratorijas apstākļos. Dzīvnieki tika turēti kontrolētos apstākļos (12-stundu gaismas/tumsas cikls, temperatūra 23 ± 2 grādi, relatīvais mitrums 50 ± 25%), un tiem tika atļauta brīva piekļuve standarta komerciālai diētai (autoklāvēts CR-LPF; Oriental Yeast Co., Ltd., Tokija, Japāna) un krāna ūdeni. Divdesmit dzīvnieki tika iedalīti šādās četrās grupās (pa pieciem dzīvniekiem katrā): 1-nedēļas ar fizioloģisko šķīdumu apstrādātā grupa (kontroles- 1W), 2-nedēļas ar fizioloģisko šķīdumu apstrādātā grupa (kontroles{101} {14}}W), 1-nedēļas bloķētā nukleīnskābi, kas satur antisense oligonukleotīdu (LNA-ASO) apstrādātā grupa (ASO-1W), un 2-nedēļas LNA ASO apstrādātā grupa (ASO-2W). Dzīvnieki bija 5 nedēļas veci brīdī, kad tika uzsākta 50 mg/kg LNA-ASO ievadīšana. LNA-ASO tika ievadīts intravenozi kopā četras reizes saskaņā ar šādu shēmu: 1., 4., 8. un 11. diena ASO-2W grupā; un 1., 2., 3. un 4. diena ASO-1W grupā. Dzīvnieki kontroles-1W un ASO-1W grupā tika nogalināti 7. dienā. Dzīvnieki kontroles-2W un ASO-2W grupās tika nogalināti dienā. 14. Katrā terminālajā autopsijā tika paņemti asins paraugi klīniskai patoloģijai no vēdera dobās vēnas dziļā anestēzijā ar izoflurānu. Pēc asins paraugu ņemšanas visas žurkas tika eitanāzētas, veicot atasiņošanu, nekavējoties pārgriežot vēdera aortu. Ķermeņa ārējā virsma, krūšu kurvja un vēdera dobumi un iekšējie orgāni tika makroskopiski pārbaudīti, un kreisās nieres tika izņemtas un apstrādātas mikroskopiskai izmeklēšanai. Visas procedūras tika veiktas saskaņā ar Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation eksperimentālo dzīvnieku barošanas un uzglabāšanas noteikumiem un dzīvnieku eksperimentiem.

Seruma paraugi tika iegūti, centrifugējot asins paraugus 4 grādu temperatūrā. Seruma bioķīmiskā analīze tika veikta, izmantojot TBA-2000FR instrumentu (Canon Medical Systems Corporation, Tochigi, Japāna), lai novērtētu urīnvielas slāpekļa (BUN) un kreatinīna (CRE) līmeni asinīs.

Nieres tika fiksētas, izmantojot trīs fiksācijas šķīdumus šādi: pēc nieres šķērsvirziena sadalīšanas trīs segmentos, vidējā daļa, ieskaitot nieru iegurni, tika fiksēta 10% NBF 5 dienas; galvaskausa daļa tika fiksēta Karnovska fiksatorā (Muto Pure Chemicals Co., Ltd., Tokija, Japāna); un astes daļa tika fiksēta 4% PFA 17 stundas 4 grādu temperatūrā un pēc tam ievietota 10% NBF uz 24 stundām. Katrs fiksētais paraugs tika dehidrēts un iestrādāts parafīnā. Audu sekcijas tika sagatavotas hematoksilīna un eozīna (H&E) krāsošanai. Imūnhistoķīmiskā krāsošana tika veikta, izmantojot antivielas, kuru mērķis ir nieru bojājuma molekula-1 (KIM-1; R&D Systems Inc., Mineapolis, MN, ASV; atšķaidījums 1:300) un ar lizosomu saistīto membrānas proteīnu 2 (LAMP{{). 13}}; Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ASV, atšķaidījums 1:1000) pēc antigēna iegūšanas (citrāta buferšķīdums, pH 6,0, karsēts 10 minūtes vai karsēts zem spiediena 20 minūtes). Kā sekundārā antiviela tika izmantota Histofine Simple Stain Rat MAX PO (Nichirei Biosciences Inc., Tokija, Japāna).

Wecistanche atbalsta dienests:

E-pasts:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel.:+86 15292862950

Iegādājieties sīkāku informāciju par specifikācijām:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-veikals