Nieru transplantācija

Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

IEVADS

Nierestransplantācijair labākā izvēle hroniskas nieru slimības beigu stadijas ārstēšanai. Pašlaik antivielu izraisīta atgrūšana (AMR), ko raksturo donorspecifiskas antivielas (DSA) klātbūtne, kas ir vērsta pret cilvēka leikocītu antigēnu (HLA), ir kļuvusi par galveno hronisko nieru transplantāta bojājumu cēloni. lielā mērā ierobežo transplantāta ilgtermiņa izdzīvošanu. (1, 2). Tomēr esošās shēmas nav spējušas sasniegt daudzsološus rezultātus klīniskajā jomāAMR ārstēšana (1, 3, 4). Tādējādi ir steidzami jāidentificē iespējamie AMR biomarķieri un riska faktori pēc nieres transplantācijas, kas ir ļoti svarīgi ārstēšanai un pacientu rezultātiem.

Uzkrājošie pierādījumi liecina, ka iekaisuma apstākļos B šūnas var diferencēties antivielas izdalošos plazmasblastos un regulējošās B šūnās (Bregs), kas ir īpaša B šūnu apakškopa, kas izdala imūnsupresīvus citokīnus, īpaši interleikīnu (IL) -10. (1, 5–7). Tādējādi plazmasblasti ražo alloantivielas, kā rezultātā rodas AMR, savukārt Bregs demonstrē imūnregulācijas funkcijas un palīdz izraisīt imūno homeostāzi. Tādējādi ir ziņots, ka Bregs ir cieši saistīts ar rezistenci pret AMR pēc nieru transplantācijas (1, 8, 9).

Lai gan Breg apakškopu atšķirīgie virsmas marķieri cilvēkiem vēl nav identificēti (1), iepriekšējos pētījumos ir ziņots par četrām izplatītākajām Bregu apakšpopulācijām: atmiņas Bregs (mBregs), kas definētas ar CD19 plus CD24 plus CD27 plus (10), pārejas Bregs (10). tBregs) definēts ar CD19 plus CD24 plus CD38 plus (10, 11), IL-10-ražo atmiņas Bregs (IL-10 plus mBregs), kas definēts ar CD19 plus CD24 plus CD27 plus IL-10 plus (12) un IL{17}}producēšanapārejas Bregs (IL-10 plus tBregs), kas definēti ar CD19 plus CD24 plus CD38 plus IL-10 plus (13). Laguna-Goya et al. ziņoja, ka tBreg un IL-10 plus tBreg samazināšanās ir pozitīvi saistīta ar akūtu atgrūšanu pēc nieru transplantācijas (14). Tomēr Džou et al. ziņoja, ka mBregs, nevis tBregs, ievērojami samazinājās pieciem pacientiem ar akūtu atgrūšanu pēc aknu transplantācijas (10). Turklāt Shabir et al. ziņoja, ka tBregs nebija saistīts ar nieru allotransplantāta atgrūšanu trīs AMR pacientiem (15). Ņemot vērā šos pretrunīgos rezultātus, ir jāturpina precizēt, kurai Bregas apakšpopulācijai ir būtiska nozīme AMR pacientiem pēc nieru transplantācijas.

Šajā pētījumā tika salīdzinātas četru cirkulējošo Bregu apakšpopulāciju proporcijas starp veselām, stabilām (ST) un AMR grupām. Pēc tam tika noteikts B šūnu, IL-10 un kemokīnu bioloģiskā sadalījums veselu, ST un AMR pacientu nieru transplantātos. Turklāt tika pētīta četru cirkulējošo Bregu apakšpopulāciju dinamika ST pacientiem 90 dienas pēc operācijas. Šie pašreizējie rezultāti kopā ar tiem, par kuriem ziņots iepriekšējos pētījumos (1), liecina, ka cirkulējošās IL-10 plus mBregs un IL-10 plus tBregs ir vadošās Breg apakšpopulācijas, kas veicina AMR rezistenci.

Cistanche tubulosa pulverisnovēršnieru slimības, noklikšķiniet šeit, lai iegūtu paraugu

Atslēgvārdi:Brega fenotipēšana, nieru transplantācija, antivielu izraisīta atgrūšana, homeostāze, dinamiska

MATERIĀLI UN METODES

Pacienti un grupas

Visi pacienti pirms pētījuma sniedza parakstītu informētu piekrišanu. Šo pētījumu apstiprināja Džendžou Universitātes (2018-KY-72) Pirmās saistītās slimnīcas ētikas komiteja. Klīniskā pētījuma reģistrācijas numurs ir ChiCTR1900022501.

Šie pacienti tika iedalīti trīs grupās: (1) veseli kontroles grupa (veselīgi, n=9): veseli nieru donori vecumā no 18 līdz 55 gadiem (bez slimības), kas sastāv no saņēmēju brāļiem un māsām un laulātajiem; (2) recipienti ar stabilu transplantāta funkciju grupu (ST, n=25): pacienti vecumā no 18 līdz 55 gadiem, kuru nieru darbība novērošanas laikā bija stabila (bez infekcijas vai atgrūšanas pirms un pēc nieres transplantācijas). periods (lielāks par vai vienāds ar 6 mēnešiem); (3) recipienti ar AMR grupa (AMR, n=18): pacienti vecumā no 18 līdz 55 gadiem, kuriem diagnosticēta AMR. Nieru transplantāti saņēmējiem ar ST un AMR tika iegūti novesels nieru donorss. Diferenciāldiagnozi starp ST un AMR grupām apstiprināja divi nieru patologi saskaņā ar Banff 2017 konsensu (3, 16).

Perifēro asiņu, nieru audu un šūnu paraugi

Perifēro asiņu paraugi no veselās grupas tika savākti pirms operācijas un 1, 7 un 14 dienas pēc operācijas. Paraugi, kas iegūti no ST grupas, tika savākti pirms operācijas un 1, 7, 14, 30 un 90 dienas pēc operācijas. Paraugi, kas iegūti no AMR grupas, tika savākti, kad notika atgrūšana (pirms AMR pretatgrūšanas terapijas). Perifēro asiņu mononukleārās šūnas (PBMC) tika izolētas no

5 ml asiņu ar Ficoll-Paque gradienta centrifugēšanu un konservētas ar 10% dimetilsulfoksīdu (Solarbio Inc., Pekina, Ķīna) šķidrā slāpeklī.

Galvenie adatas nieru biopsijas paraugi, kas iegūti no veselās grupas, tika savākti pirms operācijas, lai veiktu donora nieru biopsiju nulles laikā. Galvenie adatas nieru biopsijas paraugi, kas iegūti no ST grupas, tika savākti 90 dienas pēc operācijas pēc tam, kad to nieru darbība stabilizējās protokola biopsijas dēļ. Ņemot vērā otrās punkcijas nieru darbības traucējumus, visi AMR pacienti atteicās no galvenās adatas nieru biopsijas pēc AMR pretatgrūšanas terapijas. Tādējādi adatas nieru biopsijas paraugi no AMR grupas tika savākti tikai tad, kad notika atgrūšana (pirms AMR pretatgrūšanas terapijas). Kopumā trīs veseli donori, deviņi ST pacienti un deviņi AMR pacienti sniedza parakstītu informētu piekrišanu pirms galvenās adatas nieru biopsijas. Atlikušie seši veselie donori, 16 ST pacienti un deviņi AMR pacienti atteicās no galvenās adatas nieru biopsijas, jo baidījās no lielas asiņošanas saistībā ar biopsiju. Atsevišķas šūnas tika izolētas no trīs veselu donoru, trīs ST pacientu un trīs AMR pacientu pamata adatas nieru biopsijas paraugiem, apvienojot mehānisko disociāciju ar ekstracelulārās matricas fermentatīvo degradāciju, kas uztur audu strukturālo integritāti (Multi Tissue Disociation Kit 1; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Vācija). Nieru šūnas tika konservētas ar 10% dimetilsulfoksīdu (Solarbio Inc., Pekina, Ķīna) šķidrā slāpeklī, un atlikušie adatas nieru biopsijas paraugi tika iestrādāti parafīnā 4 grādu temperatūrā.

Plūsmas citometrija

Šūnas, kas uzglabātas šķidrā slāpeklī, 3 minūtes ātri atkausēja ūdens vannā, kas iestatīta uz 37 grādiem. Kopā 2–3 × 106 PBMC tika inkubēti ar Roswell Park Memorial Institute 1640 atšķaidīšanas šūnu stimulācijas kokteili (500 ×), kas sastāvēja no PMA (forbola 12-miristāta 13-acetāta), kalcija jonofors (ionomicīns) un proteīnu transporta inhibitori Brefeldin A un Monensin (eBioscience, Sandjego, Kalifornija), 37 grādu temperatūrā ar 5 procentiem CO2 5 stundas. Atmirušās šūnas tika izslēgtas, krāsojot ar 7-aminoaktinomicīnu D (Thermo Fisher Scientific, Pitsburgh, PA, ASV), un Bregs virsmas marķieri tika iekrāsoti ar fluorohromu iezīmētām antivielām (Brilliant Violet 421™ CDery19™ anti-humancoverythrin. (PE)/Cy7 pret cilvēka CD24, Alexa FluorR647 pret cilvēka CD27, Alexa FluorR488

pret cilvēka CD38 un Brilliant Violet 510™ pret cilvēka CD45; atbilstošās izotipa kontroles: Brilliant Violet 421™ pele

IgG1 k izotipa kontrole, PE/Cy7 peles IgG2a k izotipa kontrole, Alexa FluorR647 peles IgG1 k izotipa kontrole, Alexa FluorR488 peles IgG1 k izotipa kontrole un izcili violeta

510™ peles IgG1 k izotipa kontrole; Biolegenda, Sandjego, Kalifornija,

ASV) 30 minūtes 4 grādos, aizsargājot no gaismas. Intracelulārai krāsošanai šūnas tika iekrāsotas ar antivielām, kas vērstas pret Bregs intracelulārajiem citokīniem (PE anti-cilvēka IL-10; atbilstošās izotipa kontroles: PE Rat IgG1 k Isotype Control; Biolegend, Sandjego, CA, ASV). 30 minūtes istabas temperatūrā, aizsargājot no gaismas. Marķētās šūnas tika analizētas, izmantojot BD Biosciences Canto II instrumentu (BD Biosciences, ASV). Pavisam limfocītu vārtos tika iegūti 100,000 notikumi. Datu analīze tika veikta, izmantojot FlowJo programmatūru (Tree Star, San Carlos, CA, ASV).

Imūnhistoķīmija

Immunohistochemistry staining of CD19, IL-10, and C-X-C motif chemokine 13 (CXCL13) in kidney tissues was performed, respectively. Brieflfly, 4 mm sections obtained from formalin-fifixed, paraffifin-embedded kidney tissue samples were incubated with 1:500-diluted anti-CD19, 1:1000-diluted antiCXCL13 (rabbit anti-human; Abcam, Cambridge, UK), and 1:500-diluted anti-IL-10 (rabbit anti-human; Absin, Shanghai, China) primary antibodies overnight at 4°C, followed by Horseradish Peroxidase-conjugated 1:20,000-diluted goat antirabbit secondary antibody (Abcam, Cambridge, UK) for 1 h at room temperature and then 3,3′-diaminobenzidine for another 10 min. DAPI appears in blue. Immunohistochemistry images were acquired with an Aperio ScanScope AT Turbo (Aperio, Vista, CA). Numbers of CD19, IL-10, and CXCL13 positivities were scored as follows: 0 positivity, score = zero; 1–5 positivities, score = one; 6–10 positivities, score = two; 11–20 positivities, score = three; >20 pozitīvi, rezultāts=četri

Statistiskā analīze

Ligzdotajā gadījuma kontroles pētījumā uztvērēja darbības raksturlielumu (ROC) līknes analīze tika veikta ar MedCalc v18.11.3. Pārējās statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot IBM SPSS 21.0. Parasti sadalīti mērījumu dati ar dispersijas viendabīgumu tika izteikti kā vidējā ± standarta novirze (x ± s) un analizēti ar neatkarīgas izlases t-testu (starp grupu salīdzinājumiem) vai vienvirziena dispersijas analīzi (starp grupu salīdzinājumiem). Mērījumu dati, kuriem nebija normāls sadalījums vai dispersijas viendabīgums, tika izteikti mediānā ar interkvartiļu diapazonu (IQR) un analizēti ar Mann-Whitney U testu (starp grupu salīdzinājumiem) vai Kruskal-Wallis testu (starp grupu salīdzinājumiem). Skaitīšanas dati pēc vajadzības tika analizēti ar c2 testu, koriģētu c2 testu vai Fišera precīzu testu. Vienvirziena atkārtotu mērījumu dispersijas analīze

tika izmantots dažādos laika punktos. P vērtības<0.05 were="" considered="" statistically="">

REZULTĀTI

Pacientu sākotnējās īpašības

Šajā pētījumā kopumā tika iekļauti deviņi veseli donori, 25 ST pacienti un 18 AMR pacienti. Kā parādīts 1. tabulā, saņēmēju dzimums, vecums, ķermeņa masas indekss (ĶMI), sākotnējā nefropātija, HLA neatbilstība, CNI, siltās išēmijas laiks un aukstās išēmijas laiks neatšķīrās ne grupās, ne grupās (P > 0.05, visiem). Tomēr gan anti-I, gan anti-II klases DSA pozitivitātes biežums AMR grupā bija ievērojami augstāks, salīdzinot ar ST grupā (P < 0.001="" anti-grupai).="" -i="" klases="" dsa,="" p="">< 0,001;="" p="0,001" pret="" ii="" klases="" dsa).="" turklāt,="" salīdzinot="" ar="" st="" pacientiem,="" amr="" pacientiem="" bija="" ievērojami="" augstāki="" rādītāji="" attiecībā="" uz="" tubulītu="" (t),="" intersticiālu="" iekaisumu="" (i)="" un="" peritubulāru="" kapilāru="" (ptc)="" (p="0.012" attiecībā="" uz="" t;="" p="">< 0,001="" attiecībā="" uz="" i="" un="" ptc="" ),="" saskaņā="" ar="" banfa="" klasifikāciju="" (normāls,="" rezultāts="0;" viegls,="" vērtējums="1;" vidēji,="" vērtējums="2;" smags,="" vērtējums="3)" (3,="" 16)="" (="" papildu="" 1.="" un="" 2.="">

cistanche ehinakozīdspriekš cukura diabēts