Kv1.3 inhibīcija mazina neiroiekaisumu, pārtraucot mikroglia kalcija signālu

KOPSAVILKUMS

Ir pierādīts, ka pēdējos 5 gados kālija kanāla KV1.3 inhibitori mazina neiroiekaisumus grauzēju modeļos išēmiska insulta, Alcheimera slimības, Parkinsona slimības un traumatisku smadzeņu traumu gadījumos. Sistēmiskā līmenī šīs labvēlīgās darbības ir saistītas ar mikrogliju aktivācijas samazināšanos un pro-iekaisuma citokīnu un slāpekļa oksīda ražošanas nomākšanu.

Tomēr molekulārie mehānismi KV1.3 blokatoru nomācošajai iedarbībai uz pro-iekaisuma mikroglia funkcijām nebija zināmi, līdz mūsu grupa nesen pierādīja, ka KV1.3 kanāli ne tikai regulē membrānas potenciālu, kā tas būtu sagaidāms no sprieguma atkarīga kālija kanāla. , bet arī spēlē izšķirošu lomu, ļaujot mikroglijām pretoties depolarizācijām, ko rada bīstamības signāls ATP, tādējādi regulējot kalcija pieplūdumu caur P2X4 receptoriem. Mēs šeit pārskatām KV1.3 lomu mikroglia signalizācijā un parādām, ka līdzīgi kā to lomai T šūnās, KV1.3 kanāli regulēja arī veikalā darbināmu kalcija pieplūdumu mikroglijā.

Kālija kanāls KV1.3 ir imūnās šūnās plaši ekspresēts jonu kanāls, kam ir svarīga loma šūnu membrānas potenciāla regulēšanā, šūnu migrācijā un imūno šūnu funkcijās. Jaunākie pētījumi liecina, ka savienojumi, kas inhibē kālija kanālu KV1.3, var palīdzēt uzlabot organisma imunitāti.

Imūnsistēmas regulēšana ir svarīga labas veselības uzturēšanas sastāvdaļa. Tomēr daudzas slimības, piemēram, autoimūnas slimības, vēzis un infekcijas slimības, izraisa imūnsistēmas disfunkciju. Tāpēc pētnieki ir meklējuši veidus, kā palielināt imunitāti. Jaunākie pētījumi liecina, ka kālija kanāla KV1.3 inhibitori var būt daudzsološs risinājums.

Imūnās šūnās kālija kanāls KV1.3 regulē membrānas potenciālu, tādējādi ietekmējot šūnu darbību. Pētījumā konstatēts, ka, inhibējot kālija kanālu KV1.3, bija iespējams samazināt T šūnu migrāciju un vēl vairāk novērst to uzbrukumu veselām šūnām, tādējādi pasargājot imūnsistēmu no nevajadzīgas iznīcināšanas.

Turklāt daži eksperimenti ir atklājuši, ka kālija kanāla KV1.3 inhibēšana var veicināt arī citus imūnsistēmas aspektus. Piemēram, pētījumi liecina, ka, nomācot šo kanālu, var uzlabot imūno šūnu kvalitāti un kvantitāti, tādējādi palielinot organisma izturību pret patogēniem un citiem ārējiem draudiem. Tāpēc kālija kanāla KV1.3 inhibīcija var būt efektīvs veids, kā uzlabot imunitāti.

Noslēgumā jāsaka, ka pašreizējais pētījums liecina, ka kālija kanāla KV1.3 inhibīcija var būt daudzsološa pieeja imūnsistēmas darbības uzlabošanai un ķermeņa vispārējās imunitātes palielināšanai. Bet, lai gan šie atklājumi ir daudzsološi, ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai noteiktu šīs pieejas lietošanas drošību un iespējamību. No šī viedokļa mums ir jāuzlabo imunitāte. Cistanche var ievērojami uzlabot imunitāti. Gaļas pelni satur dažādas bioloģiski aktīvas sastāvdaļas, piemēram, polisaharīdus, divas sēnes un Huang Li, kas var stimulēt imūnsistēmu. dažāda veida šūnas, palielinot to imūno aktivitāti.

Noklikšķiniet uz cistanche ieguvumiem veselībai

Ievads

Sprieguma atkarīgais kālija kanāls KV1.3 sākotnēji tika aprakstīts T šūnās [1] un pēc tam tika izmantots kā mērķis T-šūnu izraisītu autoimūnu slimību, piemēram, multiplās sklerozes, reimatoīdā artrīta un psoriāzes, ārstēšanai [2–4]. Pavisam nesen KV1.3 ir kļuvis par pievilcīgu farmakoloģisku mērķi, lai samazinātu tā saukto "neiroiekaisumu", modulējot mikroglia aktivāciju. Gan peles, gan žurku išēmiskā insulta modeļos mēs un citi ir pierādījuši, ka KV1.3 blokatori samazina infarkta zonu un uzlabo neiroloģisko deficītu [5,6]. Alcheimera slimības transgēnos peļu modeļos KV1.3 blokāde samazināja smadzeņu amiloīda slodzi, uzlaboja hipokampu neironu plastiskumu un uzlaboja uzvedības deficītu [7].

Līdzīgi vairākos Parkinsona slimības dzīvnieku modeļos mazas molekulas KV1.3 blokatora PAP-1 ievadīšana kavēja dopamīnerģisko neironu deģenerāciju un uzlaboja uzvedības rezultātus [8]. Ir arī pierādīts, ka KV1.3 inhibīcija vai ģenētiskā dzēšana uzlabo baltās vielas patoloģiju pēc traumatiskas smadzeņu traumas [9], pēcoperācijas kognitīvās samazināšanās [10] un starojuma izraisītas smadzeņu traumas [11]. Visos šajos neiroloģiskās slimības dzīvnieku modeļos tika novērota palielināta KV1.3 ekspresija uz ar patoloģiju saistītajām mikroglijām, un ārstēšana ar KV1.3 blokatoriem izraisīja samazinātu mikrogliju aktivāciju un samazinātu iekaisuma citokīnu līmeni dzīvnieku smadzenēs.

Šķiet, ka ar slimību saistītā paaugstinātā KV1.3 ekspresija izpaužas cilvēkiem, jo ​​spēcīga KV 1.3 ekspresija ir konstatēta arī pēcnāves cilvēka smadzenēs uz mikroglijām infarkta apgabalos pēc išēmiska insulta [5,12], uz mikroglijām, kas ieskauj amiloidālās plāksnes Alcheimera slimības gadījumā [ 7, 13], kā arī uz mikrogliju prefrontālajā garozā un substantia nigra Parkinsona slimības gadījumā [8]. Kopumā šie iepriecinošie atklājumi cilvēku un dzīvnieku modeļos stingri norāda uz mikroglia KV1.3 kanālus kā terapeitisku mērķi, lai samazinātu kaitīgas iekaisuma reakcijas smadzenēs. Bet kā darbojas KV1.3 bloķētāji? Kā ar spriegumu saistīta kālija kanāla bloķēšana mikroglijā un, iespējams, arī smadzenēs infiltrējošie monocītu atvasinātie makrofāgi samazina iekaisuma citokīnu veidošanos un iekaisuma izraisītos audu bojājumus?

KV1.3 blokatoru ietekme uz mikroglia funkciju

Ir pierādīts, ka kultivētas jaundzimušo peļu un žurku mikroglijas, kā arī akūti izolētas mikroglijas no peles smadzenēm vai audos izdrukātas mikroglijas no žurku smadzenēm, izmantojot veselas šūnas plākstera skavas, izsaka KV1.3 strāvas, kas ievērojami palielinās pēc stimulācijas in vitro vai in vivo intracerebroventrikulāra injekcija ar TLR-4 ligandu lipopolisaharīdu (LPS) [14–18]. Stimulēšana ar gramnegatīvo šūnu sienas komponentu LPS tiek plaši izmantota, lai izraisītu "klasiski" aktivizētu "M1- līdzīgu" mikrogliju stāvokli, kas imitē vispārēju iekaisumu, kas varētu būt saistīts ar bakteriālu infekciju [19, 20]. Neiroimunoloģijas jomā LPS stimulēto mikrogliju ideālā gadījumā vajadzētu saukt par M(LPS) mikrogliju, pamatojoties uz stimulu, ko izmanto polarizācijas ierosināšanai, lai izvairītos no M1/M2 terminoloģijas lietošanas, kas tiek uzskatīta par pārāk vienkāršotu [21], bet plaši izmantota tās terapeitiskās iedarbības dēļ. pievilcību.

Pēc stimulācijas ar LPS palielinātu KV1.3 ekspresiju var novērot mRNS līmenī un proteīna līmenī, izmantojot Western blotēšanu, imūnhistoķīmiju un palielinātu strāvas blīvumu, ko mēra ar veselas šūnas plākstera skavu [15–18]. Līdzīgs, bet nedaudz mazāk intensīvs Kv1.3 ekspresijas pieaugums rodas, ja kultivētās jaundzimušo mikroglijas tiek stimulētas ar oligomēru amiloīdu- (AO) vai -sinukleīnu [7,8], diviem proteīniem, kas Alcheimera vai Parkinsona slimības gadījumā ir nepareizi salocīti un agregēti, un kuras bieži izmanto, lai izveidotu ar attiecīgo slimību saistīto mikrogliju reakciju in vitro modeli.

Šāda veida in vitro sistēmās KV1.3 inhibīcija vai ģenētiskā dzēšana samazina vairāku iekaisuma mediatoru ekspresiju un veidošanos, ko mēra 24- vai 48- stundās pēc mikroglia aktivācijas. Apmēram pirms 20 gadiem Lyanne Schlichter laboratorija ziņoja, ka KV1.3 inhibitori nomāc forbolestera stimulētu elpošanas uzliesmojumu [22] un NO veidošanos kultivētās jaundzimušo žurku mikroglijās, tādējādi samazinot mikrogliju izraisīto neironu nogalināšanu transwell kultūras sistēmā [16].

Jaunākā mūsu laboratorijas pētījumā [17], kurā salīdzināja KV1.3 un KCa3.1 blokatoru ietekmi ar plaši izmantoto mikroglia inhibitoru minociklīnu uz diferenciāli polarizētu jaundzimušo peļu mikrogliju, mēs novērojām, ka Kv1.3 inhibīcija samazināja ekspresiju un veidošanos. pro-iekaisuma citokīnu IL-1 un TNF- 24 un 28 stundās un novērsa ar iekaisumu saistīto enzīmu ciklooksigenāzes2 (COX-2) un inducējamās slāpekļa oksīda sintāzes (iNOS) regulēšanu. Pēdējais efekts, iespējams, bija atbildīgs par samazinātu NO veidošanos, kas novērota mikroglijās, kas tika ārstētas ar KV1.3 inhibitoriem 24 un 48 stundas pēc LPS stimulācijas. Līdzīgi kā iepriekšējā darbā, mēs arī novērojām, ka KV1.3 inhibitori novērš mikrogliju izraisītu neironu nogalināšanu organotipiskās hipokampu šķēlumu kultūrās 3 dienas pēc mikrogliju aktivizēšanas vai nu ar 1-stundu hipoksijas/glikēmijas, lai modelētu išēmisku insultu [5] vai apstrādājot ar oligomēru amiloīdu, lai modelētu mikroglia aktivāciju AD [7].

Papildus AO inducētās mikroglia aktivācijas samazināšanai, parādību, ko var skaidri parādīt, krāsojot mikrogliju CD11b vai Iba-1 un novērtējot fluorescences intensitāti, ir konstatēts, ka KV1.3 inhibitors PAP-1 arī novērš O-inducēts, mikrogliju izraisīts ilgtermiņa potenciācijas (LPT) traucējums hipokampu šķēlēs un samazināt A O izraisītu IL-1, TNF- un NO veidošanos kultivētās peles mikroglijās [7], ļoti līdzīgi līdz tam, kas tika konstatēts KV1.3 inhibitoriem ar LPS stimulētu mikrogliju [17,18]. Eksperimentos, kuros kultivētas jaundzimušo peļu mikroglijas no savvaļas tipa un KV1.3-/- pelēm tika stimulētas ar agregātu -sinukleīnu (SynAgg), kas aktivizē mikrogliju, saistoties ar rakstu atpazīšanas receptoriem TLR2 un CD36 [23], abiem farmakoloģiskajiem KV1. 3 inhibīcija ar PAP-1 un kanāla ģenētiska dzēšana izraisīja IL-1, IL-6, IL-12 un TNF ražošanas samazināšanos un novērsa NLRP3 iekaisuma proteīna augšupregulāciju 24 gados. stundas pēc mikroglia stimulācijas [8]. Un otrādi, pārmērīga KV 1.3 ekspresija mikroglia šūnu līnijā palielināja SynAgginducēto IL-1, TNF-, IL-6 un IL-12 ekspresiju vai sekrēciju 24 stundas pēc stimulācijas [8].

Dažādi citu grupu pētījumi apstiprināja, ka KV1.3 blokatori samazina pro-iekaisuma mikroglia funkcijas, ja tiek izmantoti līdzīgi stimuli vai stimuli, kas saistīti ar citām iekaisuma patoloģijām. Piemēram, kultivētām žurku mikroglijām, kas aktivizētas ar HIV Tat proteīnu vai glikoproteīnu 120 (gp120), lai simulētu ar HIV{5}}saistītus neirokognitīvos traucējumus, tika konstatēts, ka KV1.3 inhibīcija vai notriekšana ar siRNS samazina IL-1 , TNF- un NO ražošana un nomākta neirotoksicitāte [24,25]. Izmantojot kultivētās mikroglijas išēmiskā insulta un skābekļa/glikozes atņemšanas modeli Ma et al. ziņoja, ka KV1.3 inhibīcija mainīja mikroglia fenotipu no pro-iekaisuma M1-līdzīga uz M2-līdzīgu reakciju un samazināja NLRP3 iekaisuma aktivāciju [5,6], līdzīgi kā iepriekš aprakstītajos pētījumos. Parkinsona slimības modeļos [8].

Izmantojot svaigi izolētas CD11b plus šūnas, kas sastāv gan no CNS infiltrējošiem makrofāgiem, gan smadzenēs dzīvojošiem mikroglijiem no peļu smadzenēm, kas tika sistēmiski apstrādātas ar LPS KV1.3 bloķējošā peptīda ShK-223 klātbūtnē un bez tā, Rangaraju un citi. apstiprināja, ka KV 1.3 inhibīcija samazina iekaisuma citokīnu, piemēram, IL-1, ekspresiju, bet parādīja, ka KV1.3 inhibīcija arī samazināja TAP1 ekspresiju un novērsa EHD1 regulēšanu CD11b plus CD45 zemā mikroglijā, mērot ar plūsmas citometriju [26]. Gan TAP1, gan EDH1 ir proteīni, kas ir iesaistīti MHC I klases montāžā un pārvietošanā uz šūnu virsmu. Tāpēc autori pēc tam pētīja ārstēšanas ar ShK-223 ietekmi uz MHC klases-1 ekspresiju uz akūti izolētu mikrogliju un, pamatojoties uz samazinātu MHC ekspresiju, izvirzīja hipotēzi, ka LPS izraisīta antigēnu prezentācijas spējas palielināšanās. microglia ir no KV 1.{22}}atkarīgi procesi, kas liecina, ka KV1.3 inhibīcija var samazināt antigēna prezentāciju CD8 un citotoksiskām T šūnām.

Turpmākajā svērtajā koekspresijas tīkla analīzē, kas tika izmantota mikroglia transkriptomiskām datu kopām no neiroinflammatoriskās un neirodeģeneratīvās slimības peles modeļiem, tā pati grupa identificēja KV1.3 kā daļu no iekaisuma gēna paraksta, kas ietvēra arī Tlr2, Ptgs2, Il12b, Il1b, CD44, NFκB, Stat1 un RelA [27]. KV1.3 blokāde ar ShK-223 var novirzīt šo pro-iekaisuma pazīmi uz tādu, kurā ir palielināta pretiekaisuma gēnu ekspresija ar slimību saistītās mikroglijās. Interesanti šajā kontekstā ir tas, ka citos pētījumos ir ziņots, ka Kv1.3 inhibitori vēl vairāk palielina kultivēto mikrogliju migrāciju, kas stimulēta ar pretiekaisuma citokīniem IL-4 un IL-10 [28] un lai neietekmētu mikropērlīšu mikroglia fagocitozi [26] vai pat palielinātu amiloīda fagocitozi [7].

Kopumā tādējādi ir pietiekami daudz pierādījumu tam, ka mikroglija ekspresē KV1.3 un ka KV1.3 blokatori nomāc iekaisuma, neirotoksiskas mikroglijas funkcijas un var pat novirzīt mikrogliju pret neiroprotektīvāku fenotipu. Mēs šeit galvenokārt koncentrējāmies uz to datu apkopošanu, kas iegūti ar kultivētām mikroglia vai šķēles kultūrām, jo ​​šajās redukcionistiskajās sistēmās nav šaubu, ka nokauts, notriekts vai farmakoloģiskā blokāde iedarbojas tieši, inhibējot mikroglia KV1.3 kanālus, nevis netieši, ietekmējot. KV1.3 kanāli T šūnās, B šūnās, dendritiskajās šūnās vai monocītos, kas visi ekspresē KV1.3 [29], un tādējādi varētu veicināt KV1.3 blokatoru ietekmi vai ar KV1.3-/- iegūto atradi in vivo. pelēm. Tomēr mēs vēlamies šeit norādīt, ka papildus daudziem pētījumiem, kas parāda KV1.3 ekspresiju uz mikroglia grauzējiem un cilvēkiem, izmantojot imūnhistoķīmiju, Kettenmann laboratorija un mūsu grupa ir vairākkārt parādījuši, ka palielināta KV1.3 ekspresija uz aktivētās mikroglia nav tikai audu kultūras parādība un ka Kv1.3 strāvas var reģistrēt no mikroglia akūtās šķēlēs [30, 31] un no akūti izolētām mikroglijām no 5xFAD peļu smadzenēm [7] vai no infarkta zonas pēc vidējās smadzeņu artērijas oklūzijas [5, 12], išēmiska insulta modelis.

Signalizācijas ceļi, ko ietekmē KV1.3 inhibīcija vai modulējoša Kv1.3 ekspresija

Pētījumi par signalizācijas ceļiem (1. attēls), kurus ietekmē KV1.3 blokatori, lai pēc 24 vai 48 stundām panāktu šo labvēlīgo pro-iekaisuma mikroglia funkciju samazināšanos, ir snieguši nedaudz pretrunīgus rezultātus, kas liecina, ka KV1.3 blokatoru iedarbība ir atkarīga. par stimulu un varbūt sugām. Kamēr Fordyce et al. ziņoja, ka KV1.3 blokatori neietekmē p38MAPK fosforilēšanos ar LPS ārstētām jaundzimušo žurku mikroglijām [16], vairākos citos pētījumos ar peles mikrogliju ir konstatēts, ka KV1.3 blokatori spēcīgi samazina p38MAPK fosforilāciju, kā arī NF-κB aktivāciju pēc stimulācijas ar LPS, AO, SynAgg vai HIV-1 glikoproteīns 120 [7,8,24]. Ir pierādīts, ka mikroglia šūnu līnijā BV2 KV1.3 regulē arī STAT1 S727 fosforilāciju [26]. Interesanti, vai KV1.3 blokatori inhibē NFAT translokāciju, viens no vislabāk pētītajiem KV1.3 blokatoru efektiem T šūnās [2,32,33] līdz šim nav pētīts mikroglijā.

Šķiet, ka KV1.3 ekspresijas palielināšanās pēc mikroglia stimulēšanas ar LPS, AO vai SynAgg ietver daudzas no tām pašām signalizācijas kaskādēm, kuras ietekmē KV1.3 inhibīcija, un KV1.3 blokatori parasti novērš Kv1.3 ekspresijas palielināšanos. KV1.3 promotors satur vairākas NF-κB un SP1 saistīšanās vietas un NF-κB vai p38MAPK inhibitorus neatkarīgi samazina SynAgg stimulēto Kv1.3 augšupregulāciju mikroglijā [8], parādot, ka gan p38MAPK, gan klasiskie NF-κB ceļi. mediē KV1.3 transkripcijas regulējumu (1. attēls). Src ģimenes kināze Fyn darbojas pirms NF-κB transkripcijas faktora, regulējot tās komponenta p65 [34] kodoltranslokāciju un fosforilējot PKC izoformu PKCδ. Sarkar et al. ziņoja, ka Fyn knockout samazina gan LPS, gan SynAgg izraisīto KV1.3 strāvas blīvuma palielināšanos kultivētās mikroglijās, un šo efektu var atdarināt, apstrādājot mikrogliju ar Fyn inhibitoru saracatinibu vai PKCδ deficītu, kas liecina, ka Fyn / PKCδ kināzes signalizācija kaskāde ir iesaistīta KV1.3 regulēšanas starpniecībā, reaģējot uz iekaisuma stimuliem [8]. Kā parādīts Duolink tuvuma ligācijas testā, Fyn tieši mijiedarbojas ar Kv1.3 un fosforilē kanālu pie Y135, lai palielinātu tā aktivitāti.

Kv1.3 regulē membrānas potenciālu un pretojas depolarizācijai

Neskatoties uz iepriekš aprakstīto labi dokumentēto KV1.3 blokatoru uzlabojošo iedarbību uz neiroiekaisumiem in vivo un uz mikroglia signālu kaskādēm un iekaisuma mediatoru ekspresiju un sekrēciju in vitro, fundamentālie molekulārie mehānismi, kā KV1.3 blokatori ietekmē mikroglia funkcijas, ilgi nebija skaidri. Daudzi pētnieki, tostarp mūsu laboratorija, vienkārši pieņēma, ka KV1.3 veic to pašu funkciju mikroglijā, ko tas pilda T šūnās, proti, regulē membrānas potenciālu un kalcija pieplūdumu [29, 32, 33].

T šūnās KV1.3 inhibīcija izraisa membrānas depolarizāciju un samazina kalcija pieplūdumu caur kalcija izdalīšanās aktivētajiem kalcija kanāliem (CRAC) pēc T šūnu receptoru stimulācijas [33, 35, 36]. Kalcija pieplūdums pa CRAC kanāliem ir ļoti nepieciešams kalcija/kalmodulīna atkarīgā transkripcijas faktora NFAT [29] defosforilācijai un tai sekojošai kodoltranslokācijai, kas izraisa citokīna IL-2 transkripciju [29,33]. IL-2 tiek atbrīvots no aktivētām T šūnām sintēzes laikā un stimulē T šūnu klonu paplašināšanos autokrīnā un parakrīnā veidā. Inhibējot līdzsvarojošo kālija izplūdi, kas nepieciešama, lai uzturētu kalcija pieplūdumu pa CRAC kanāliem, KV1.3 blokatori traucē T šūnu aktivāciju, novērš NFAT defosforilāciju un kodola translokāciju [32], kas samazina T šūnu proliferāciju un samazina iekaisuma citokīnu veidošanos un sekrēciju pēc 48 stundām. [5,33,35,36].

Tomēr tas nekad nav pārbaudīts mikroglijās, kas atšķirībā no T šūnām izsaka arī iekšējo taisngriezi Kir2.1 [17,37,38] un divu poru kālija kanālu THIK-1 (K2P 13.1) [39], vai KV1.3 blokatoriem būtu tāda pati molekulārā iedarbība, vai arī KV1.3 lomu pārņemtu šie citi kālija kanāli. Nesenā pētījumā mūsu grupa attiecīgi pievērsās šim jautājumam, vispirms atkārtoti pārbaudot KV1.3 fundamentālo nozīmi miera membrānas potenciāla uzturēšanā un pretestībā depolarizācijai [40]. Kā gaidīts, pārmērīga KV1.3 ekspresija CHO šūnās samazināja šo šūnu parasti ļoti depolarizēto miera membrānas potenciālu no –20 mV līdz –50 mV, savukārt KV1.3 inhibīcija ar ShK-223 depolarizētu mikrogliju, kas pēc būtības saglabā vairāk hiperpolarizēts miera membrānas potenciāls, kas mūsu rokās bija vidēji ap –90 mV nediferencētās mikroglijās, kas galvenokārt ekspresē Kir2.1, un aptuveni –65 mV LPS stimulētajā mikroglijā, kas izsaka lielāku KV1.3 un zemāku Kir2.1 strāvas blīvumu [40].

Lai gan KV1.3 tādējādi noteikti veicina miera membrānas potenciāla regulēšanu mikroglijā (2. attēls), mēs uzskatām, ka tā svarīgākā loma un iemesls, kāpēc Kv1.3 ekspresija palielinās aktivētajā mikroglijā, ir kanāla spēja kompensēt ekstrēmas un ilgstošas. membrānas depolarizācija, kas potenciāli var negatīvi ietekmēt mikroglia veselību un fizioloģiju, kā atklāj pašreizējie injekcijas eksperimenti. Lai gan strāvas 25 pA injekcijas nespēj depolarizēt KV 1.3, kas ekspresē mikrogliju virs –30 mV, ja nav blokatoru, mikroglija, kas iepriekš apstrādāta ar KV 1.3 blokatoriem, depolarizējas līdz potenciālam plus 50 mV, reaģējot uz tām pašām 25 pA strāvas injekcijām [40] , kas liecina, ka KV1.3 var "saspiest" membrānas potenciālu tuvu kanāla aktivizācijas sliekšņa potenciālam, lai novērstu pārmērīgu membrānas depolarizāciju (2. attēls).

Situācija mikroglia fizioloģijā, kur šī spēja ir svarīga, ir tad, kad mikroglijas tiek pakļautas ārpusšūnu ATP iedarbībai, kas ir bīstamības signāls, kas var sasniegt koncentrāciju augstā mikromolārā diapazonā, jo no bojātiem neironiem izdalās citozola ATP vai ATP saturošas sinaptiskās pūslīši [41], kas aktivizē P2X receptoru kanālus, izraisot intensīvu depolarizāciju [42]. Pašreizējie skavu eksperimenti, kas veikti ar nediferencētām un LPS stimulētām mikroglijām, parādīja, ka akūta 100 μM ATP iedarbība, kas no P2X receptoriem, kas izteikta mikroglijā, galvenokārt aktivizē P2X4, izraisa izteiktākas depolarizācijas nediferencētā mikroglijā, neskatoties uz to vairāk. hiperpolarizēts miera membrānas potenciāls nekā KV1.3 augstā LPS stimulētajā mikroglijā, kas nedepolarizējās virs –40 mV. KV1.3 blokatori vājināja šo spēju pretoties ATP izraisītām depolarizācijām un mikrogliju depolarizēšanai to klātbūtnē [40].

KV1.3 modulē P2X4 receptoru izraisītu kalcija pieplūdumu mikroglijā

Kalcija attēlveidošanas eksperimenti atklāja, ka šī KV1.3 kanālu spēja pretoties ATP izraisītām P2X4- mediētām depolarizācijām uzlabo Ca2 plus iekļūšanu mikroglijā caur P2X4 receptoriem, kas stimulēti ar 100 μM ATP [40]. Piemēram, mēs novērojām, ka KV1.3 blokatori ShK-223 un PAP-1 samazināja ATP izraisīto Ca2 plus pieplūdumu caur P2X4 receptoriem LPS diferencētās mikroglijās, kas pauž augstu KV1.3 strāvas blīvumu, un daudz vairāk spēcīgāk nekā nestimulētā mikroglijā, lai gan LPS stimulācija samazina P2X4 receptoru ekspresiju kultivētās mikroglijās. Turpretim KV1.3 blokāde neietekmēja ATP izraisītos kalcija pārejas posmus IL-4 stimulētajās mikroglijās, kas ekspresē ļoti zemu KV1.3 līmeni. Interesanti, ka, lai gan LPS arī palielina KV1.3 un samazina P2X4 ekspresiju uz mikroglijām in vivo, gan KV1.3, gan P2X4 ekspresija palielinās paralēli išēmiska insulta gadījumā, kā liecina mūsu laboratorija par akūti izolētu mikrogliju no peļu infarkta smadzeņu puslodes. pakļauti išēmiskam insultam un citām grupām uz grauzēju un cilvēka mikroglijām, izmantojot imūnhistoķīmiju vai qPCR [5, 12, 43–46]. Tas liek domāt, ka pēc išēmiska insulta KV1.3 varētu spēcīgāk nekā in vitro regulēt sarežģītāko purinerģisko mikroglia kalcija signālu pārraidi, ko ierosina bīstamības signāls ATP. ATP un citi neironu atkritumi infarkta skartajā smadzeņu zonā aktivizē mikrogliju, kas pēc tam nepārtraukti ražo un atbrīvo vairāk iekaisuma mediatoru 24 līdz 72 stundu laikā un tādējādi bojā un nogalina vairāk neironu pusmbrā, izraisot infarkta iekaisuma paplašināšanos.

Paaugstināta KV1.3 ekspresija, kas tiek novērota uz mikroglia infarkta robežās 2–5 dienu laikā [5], iespējams, ļauj aktivizētai mikroglijai uzturēt spēcīgākus kalcija signālus caur palielinātu P2X4 receptoru skaitu un tādējādi ražot vairāk iekaisuma mediatoru, bojājot vairāk neironu. un aktivizējot vairāk mikrogliju. Šī hipotēze atbilstu konstatējumam, ka KV1.3 bloķētājs PAP-1 samazināja mikrogliju aktivāciju un IL-1 un IFN- līmeni smadzenēs, izraisot aptuveni par 40 procentiem mazākas infarkta zonas un uzlabojot neiroloģisko deficītu. rezultāti gan peles, gan žurku išēmiskā insulta modeļos [5]. Depolarizējot mikrogliju Kv1.3 blokatori samazina kalcija pieplūdumu caur P2X4 receptoriem, ko izraisa ATP, kas atbrīvots no bojātiem neironiem, un tādējādi mazina turpmāku kalcija atkarīgo NLRP3 iekaisuma aktivāciju, NF-κB un citus transkripcijas faktorus, kas samazina iekaisuma mediatoru veidošanos (1. un samazināta patoloģija.

Kādus citus kalcija pieplūdes ceļus mikroglijās regulē KV1.3?

Lai gan KV1.3 blokāde nepārprotami samazināja ATP izraisītu kalcija pieplūdumu caur P2X4 receptoriem [40] un tādējādi ir svarīgs šī kalcija pieplūduma ceļa regulators mikroglijā (2. attēls), šī nav vienīgā KV1.3 vai ATP atkarīgā kalcija signālu pārraide. process mikroglijā. Papildus P2X receptoru kanāliem mikroglija ekspresē arī metabotropos P2Y purinerģiskos receptorus, kas pēc ATP vai UTP aktivācijas var izraisīt kalcija izdalīšanos no iekšējiem krājumiem [47] un aktivizēt noliktavā darbināmu Ca2 plus ievadi (SOCE) pēc salīdzinoši mazo intracelulāro kalcija krājumu izsīkšanas. mikroglijā [38]. Tāpēc noteikti ir iespējams, ka papildu SOCE veicināja ATP izraisītos Ca2 plus signālus, kurus mēs bijām attēlojuši, un ka daži no KV1.3 blokatora efektiem tika veicināti, papildus samazinot SOCE.

Tā ir ļoti iespējama hipotēze, jo "klasiskais" molekulārais mehānisms KV1.3 blokatoriem T šūnās ir SOCE samazināšana caur CRAC kanāliem pēc T šūnu receptoru aktivācijas un pēc tam samazināta transkripcijas faktora aktivācija un citokīnu ražošana un izdalīšanās [29,33, 36,48]. Ir vairākkārt ziņots, ka žurku un peļu mikroglija uzrāda straumes ar biofizikālām īpašībām, kas raksturīgas CRAC strāvām [49, 50] un izsaka CRAC kanālu, Orai un STIM molekulāros komponentus [51, 52]. Ir arī pierādījumi, ka Orai1, STIM1 un STIM2 ģenētiskā dzēšana samazina CRAC strāvu un/vai SOCE un inhibē migrāciju un fagocitozi kultivētās peles mikroglijās [52], savukārt mazmolekulārajam CRAC kanālu blokatoram CM-EX-137 ir. nesen tika ziņots, ka tas samazina mikroglia aktivāciju un bojājuma lielumu traumatiska smadzeņu traumas peles modelī [53].

KV1.3 kanālu bloķēšana mazina veikalā darbināmu kalcija iekļūšanu LPS stimulētajā mikroglijā

Kā turpinājuma eksperiments mūsu iepriekšējam dokumentam par KV1.3 lomu P2X4 izraisītā kalcija pieplūduma regulēšanā, mēs šeit īpaši uzdevām jautājumu, vai KV1.3 bloķētājs ShK-223 arī samazinātu SOCE LPS diferencētajā mikroglijā. , tas pats stimulācijas stāvoklis, kurā mēs bijām novērojuši augstāko KV1.3 strāvas blīvumu un lielāko KV1.3 inhibīcijas ietekmi uz ATP inducēto kalcija signālu [40]. Izmantojot ratiometrisko kalcija indikatoru Fura-2, lai izsekotu brīvā intracelulārā kalcija koncentrācijas ([Ca2 plus ]i) izmaiņām, mēs atklājām, ka LPS diferencētajiem mikroglijiem miera citosola kalcija koncentrācija [Ca2 plus ] I svārstījās no 60 nM līdz 370 nM, vidēji 150 ± 8,8 nM (n=50; 3.a, c, g attēls), kas atbilst iepriekšējam ziņojumam [54]. Lai izraisītu SOCE, intracelulārie kalcija krājumi vispirms tika izsmelti ar tapsigargīnu (Tg), endoplazmatiskā tīkla Ca2 plus -ATPāzes bloķētāju, ko lietoja nomināli Ca2 plus nesaturošā vannas šķīdumā.

Removal of extracellular calcium produced a roughly 25 nM decrease in [Ca2+] I (Figure 3a) indicating the presence of a calcium influx at rest. Subsequent application of Tg (1 μM) elicited small amplitude (>25 nM) asinhrons [Ca2 plus ] I paaugstinājums pasīvās kalcija mobilizācijas dēļ no veikaliem. Kalcija pievienošana vannas šķīdumam izraisīja strauju [Ca2 plus] I paaugstināšanos virs SOCE izraisītā miera līmeņa. SOCE izraisīto [Ca2 plus ] I pāreju lielums ("maksimālais SOCE"), ko mēra kā starpību starp [Ca2 plus ] I līmeni Ca2 plus nesaturošā vannas šķīdumā un maksimālo [Ca2 plus ] I paaugstināšanos pēc kalcija atkārtotas pievienošanas ievērojami starp atsevišķām šūnām ar maksimālo SOCE sadalījumu, kas parāda maksimumu pie 120 nM un asti līdz 1800 nM (1.b attēls). Šo SOCE stipruma neviendabīgumu, iespējams, izraisa miera membrānas potenciāla izmaiņas, kas nodrošina kalcija ievadīšanas dzinējspēku SOCE laikā. Ir konstatēts, ka ar LPS diferencētu mikrogliju miera stāvoklī esošais membrānas potenciāls atsevišķās šūnās svārstās no –90 mV līdz –40 mV [40, 55] un tādējādi varētu izskaidrot novērotās atšķirības SOCE.

Iepriekšējā pētījumā tika ziņots, ka miera [Ca2 plus] I paaugstināšanās bija saistīta ar ārējo stimulu, piemēram, P2Y receptoru agonista UTP vai komplementa faktora 5a, samazinātu spēju izraisīt [Ca2 plus] I pārejas procesus LPS aktivētajā mikroglijā [54]. Tā kā mūsu pētījumā gan miera [Ca2 plus]i līmenis, gan maksimālās SOCE vērtības atsevišķās šūnās atšķīrās, mēs pētījām, vai miera [Ca2 plus]i svārstības var būt par iemeslu SOCE maksimālo vērtību neviendabīgumam. Maksimālo SOCE vērtību attēlošana attiecībā pret miera [Ca2 plus] I atklāja pozitīvu korelāciju starp maksimālo SOCE un miera [Ca2 plus] I (3.c attēls). Sadalot datus divās grupās ar maksimālo SOCE robežvērtību 600 nM, attiecības starp miera [Ca2 plus] I un maksimālo SOCE katrā grupā bija spēcīgākas nekā visā populācijā, norādot uz vismaz divu šūnu klātbūtni. populācijas, kas atšķiras gan pēc SOCE lieluma, gan korelācijas stipruma starp miera stāvoklī esošu [Ca2 plus ] I un maksimālo SOCE. Tādējādi ar LPS apstrādāto šūnu populācijā miera [Ca2 plus]i līmeņa paaugstināšanās nav cēloņsakarības saistīta ar aktivēto mikrogliju samazinātu spēju reaģēt uz ārējiem stimuliem ar [Ca 2 plus ] I pārejošu, kā tika ieteikts iepriekš. autors: Hofmans et al. Mūsu dati liecina, ka kopīga ietekme, piemēram, membrānas potenciāla līmenis, ko kontrolē dažādi kanāli, tostarp KV1.3, Kir2.1 un THIK-1, var būt atbildīga par pozitīvo korelāciju starp miera stāvoklī [Ca2 plus] I un mūsu pētījumā novērotā maksimālā SOCE. Piemēram, hiperpolarizējošu kanālu pārmērīga ekspresija vai funkcionāla regulēšana varētu hiperpolarizēt membrānu un palielināt dzinējspēku gan kalcija ievadīšanai caur konstitutīvi aktīviem kalcija caurlaidīgiem kanāliem, piemēram, metaboliski aktivizētiem pārejoša receptoru potenciāla (TRP) kanāliem, gan ar veikalu darbināmiem kanāliem, kas aktivizēti pēc veikala izsīkuma. piemēram, CRAC kanāli.

Pre-incubation of cells with the KV1.3 inhibitor ShK-223 did not significantly affect resting [Ca2+] I (Figure 3d,g), but eliminated peak SOCE responses larger than 300 nM and shifted the maximum of the distribution of peak SOCE values from 130 nM (Figure 3b, control) to 70 nM (Figure 3e, ShK223). The difference between the values of peak SOCE in control cells and cells preincubated with ShK-223 was significant (Figure 3h). The relationship between resting [Ca2+] I and peak SOCE still displayed a mild positive correlation (figure 3f). Taken together, our data indicate that similarly to T lymphocytes, blockade of KV1.3 channels significantly reduces SOCE in LPS differentiated microglia. The extent of the inhibition varied among cells with a greater effect on cells expressing large magnitude (>300 nM) SOCE. Joprojām ir jānosaka specifiskās īpašības šūnām ar augstu un zemu SOCE maksimumu.

Fizioloģiskos apstākļos SOCE var tikt aktivizēts pēc tam, lai pēc tam ar G-proteīnu saistīto P2Y receptoru aktivizēšanas izraisītu krājumu samazināšanos, un tas veicina kombinēto [Ca2 plus] I paaugstināšanos P2Y un P2X receptoru aktivācijas laikā, ko izraisa parastie purīnerģiskie agonisti, piemēram, ATP. SOCE lielums ievērojami atšķiras starp LPS diferencētajām šūnām, kas var būt no veikalu darbināmu kanālu un kanālu, kas kontrolē membrānas potenciālu, piemēram, KV1.3, diferenciālās ekspresijas unikālās kombinācijas. Maksimālā SOCE samazināšana ar ShK-223 norāda, ka KV1.3 kanāli ir spēcīgi SOCE regulatori un atklāj papildu mehānismu, ar kura palīdzību KV1.3 blokatori vājina kalcija signālu pārraidi un sekojošās funkcionālās reakcijas (piemēram, citokīnu veidošanos) pēc kalcija atkarīgas transkripcijas. faktoru aktivācija mikroglijā.

Secinājumi

Lai gan noteikti ir sarežģīti noskaidrot ietekmi uz perifērās imūnsistēmas šūnām, jo ​​īpaši uz atmiņas T šūnām un monocītu izcelsmes makrofāgiem, kas ietekmē KV1.3 blokatoru labvēlīgo ietekmi uz iekaisumu CNS, tomēr skaidrs, ka KV1.3 ir svarīga loma membrānas potenciāla regulēšanā, depolarizācijas novēršanā un kalcija signalizācijas notikumu kontrolē, kas pēc tam izraisa mikroglia aktivāciju un iekaisuma mediatoru veidošanos. Mēs vēlētos ieteikt, ka no terapeitiskā viedokļa, iespējams, ir vēlams inhibēt KV1.3 vairākos imūnsistēmas šūnu tipos. Tomēr intelektuāli būtu ļoti apmierinoši un noderīgi terapijas izstrādei, lai noskaidrotu, kas ir galvenais KV1.3 inhibitoru mērķis šūnās un vai ārstniecības līdzekļiem ir jābūt smadzenēm caurlaidīgiem, lai tiem būtu optimāla uzlabojoša iedarbība CNS slimību gadījumā. Ideālā gadījumā šie jautājumi būtu jārisina farmakoloģiski, pārbaudot smadzenēs iekļūstošas ​​mazas molekulas blakus perifēriski ierobežotiem peptīdu KV1.3 inhibitoriem vai anti-KV1.3 antivielām [58,59] Alcheimera un Parkinsona slimības dzīvnieku modeļos. Turklāt būtu ļoti informatīvi salīdzināt nosacītās KV1.3 dzēšanas ietekmi mikroglijās, no monocītiem atvasinātos makrofāgos un dažādās T šūnu apakšgrupās ar narkotiku ārstēšanas ietekmi, lai iegūtu detalizētāku izpratni par KV1.3 lomu neiroiekaisumā. un KV1.3 inhibitoru šūnu mērķis. Tomēr mēs uzskatām, ka šūnu līmenī KV1.3 galvenā loma vienmēr būs tā, kas vispirms tika aprakstīta T šūnās, proti, membrānas potenciāla un kalcija pieplūduma regulēšana un sekojoša no kalcija atkarīgo transkripcijas faktoru aktivizēšana. Tas, kas dažkārt šajā ziņā netiek pietiekami uzsvērts, ir tas, ka KV1.3 biofizikālās īpašības, piemēram, tā pusaktivācijas spriegums un relatīvi lēna inaktivācija [60, 61], lieliski "kvalificē" kanālu, lai tas pretotos membrānas depolarizācijai un tādējādi iespējotu KV1. .3, lai ne tikai regulētu SOCE, kā tas tika aprakstīts pirms 30 gadiem T šūnās, bet arī ar P2X receptoru izraisītu kalcija pieplūdumu.

Izpaušanas paziņojums

Autori neziņoja par potenciālu interešu konfliktu.

Finansējums

Šo darbu atbalstīja Nacionālā neiroloģisko slimību un insulta institūta balva NS100294 (HW) un UC Deivisas Medicīnas skolas pētniecības partnerības stipendija (AFF).

Atsauces

[1] DeCoursey TE, Chandy KG, Gupta S u.c. Sprieguma K plus kanāli cilvēka T limfocītos: nozīme mitoģenēzē? Daba. 1984;307(5950):465–468.

[2] Beeton C, Wulff H, Standifer NE u.c. Kv1.3 kanāli ir terapeitisks mērķis T šūnu izraisītām autoimūnām slimībām. Proc Natl Acad Sci USA. 2006; 103 (46): 17414–17419.

[3] Tarcha EJ, Chi V, Munoz-Elias EJ u.c. Noturīgas farmakoloģiskas reakcijas no peptīda ShK-186, specifiska Kv1.3 kanāla inhibitora, kas nomāc autoimūno slimību T šūnu mediatorus. J Pharmacol Exp Ther. 2012;342(3):642–653.

[4] Chandy KG, Norton RS. Kv1.3 kanālu peptīdu blokatori T šūnās kā ārstniecības līdzekļi autoimūnām slimībām. Curr Opin Chem Biol. 2017;38:97–107.

[5] Chen YJ, Nguyen HM, Maezawa I u.c. Kālija kanāla Kv1.3 inhibīcija samazina infarktu un iekaisumu išēmiska insulta gadījumā. Ann Clin Transl Neirol. 2018;5(2):147–161.

[6] Ma DC, Zhang NN, Zhang YN u.c. Kv1.3 kanālu blokāde mazina smadzeņu išēmijas/reperfūzijas bojājumus, pārveidojot M1/M2 fenotipus un apdraudot NLRP3 iekaisuma aktivāciju mikroglijā. Exp Neirol. 2020;332:113399.

[7] Maezawa I, Nguyen HM, Di Lucente J u.c. Kv1.3 inhibīcija kā potenciāla uz mikrogliju vērsta Alcheimera slimības terapija: koncepcijas preklīniskais pierādījums. Smadzenes. 2018;141(2):596–612.

[8] Sarkar S, Nguyen HM, Malovic E u.c. Kv1.3 modulē neiroiekaisumu un neirodeģenerāciju Parkinsona slimības gadījumā. J Clin Invest. 2020; 130 (8): 4195–4212.

[9] Reeves TM, Trimmer PA, Colley BS u.c. Mērķēšana uz Kv1.3 kanāliem, lai samazinātu baltās vielas patoloģiju pēc traumatiskas smadzeņu traumas. Exp Neirol. 2016;283(PtA):188–203.

[10] Lai IK, Valdearcos M, Morioka K u.c. Kv1.3 kālija kanālu bloķēšana novērš pēcoperācijas neiroiekaisumus un izziņas pasliktināšanos, nemazinot brūču dzīšanu pelēm. Br J Anaesth. 2020; 125 (3): 298–307.

[11] Peng Y, Lu K, Li Z u.c. Kv1.3 kanālu bloķēšana uzlabo starojuma izraisītu smadzeņu traumu. Neiro onkols. 2014;16(4):528–539.

[12] Chen YJ, Nguyen HM, Maezawa I u.c. Kālija kanāls KCa3.1 ir farmakoloģisks mērķis neiroiekaisumam, kas saistīts ar išēmiju/reperfūzijas insultu. J Cereb Blood Flow Metab. 2016; 36 (12): 2146–2161.

[13] Rangaraju S, Gearing M, Jin LW u.c. Kālija kanālu Kv1.3 ļoti ekspresē mikroglija cilvēka Alcheimera slimībā. J Alcheimera Dis. 2015; 44 (3): 797–808.

[14] Norenberg W, Gebicke-Haerter PJ, Illes P. Iekaisuma stimuli inducē jaunu K plus ārēju strāvu kultivētās žurku mikroglijās. Neurosci Lett. 1992; 147 (2): 171–174.

[15] Kotecha SA, Schlichter LC. Kv1.5 uz Kv1.3 slēdzis endogēnajā hipokampu mikroglijā un loma proliferācijā. J Neirosci. 1999;19(24):10680–10693. [16] Fordyce CB, Jagasia R, Zhu X u.c. Microglia Kv1.3 kanāli veicina to spēju nogalināt neironus. J Neirosci. 2005;25(31):7139–7149.

[17] Nguyen HM, Grossinger EM, Horiuchi M u.c. Diferenciālā Kv1.3, KCa3.1 un Kir2.1 izteiksme "klasiski" un "alternatīvi" aktivētās mikroglijās. Glia. 2017;65(1):106–121.

For more information:1950477648nn@gmail.com