Lamivudīns uzlabo kognitīvo samazināšanos SAMP8 pelēm: in vivo farmakoloģiskā novērtējuma un tīkla farmakoloģijas integrēšana

Abstrakts

Reversās transkriptāzes inhibitoriem, piemēram, lamivudīnam (3TC), ir svarīga lomapretnovecošanas, bet to ietekme uzneirodeģeneratīvas slimības, ko izraisa novecošanāsnav skaidrs, jo īpaši par funkcijāmnervu sistēma, piemēram, izziņa. Šajā pētījumā mēs ievadījām 3TC pelēm ar paātrinātu novecošanos 8 (SAMP8) ar kuņģa perfūziju (100 mg/kg) 4 nedēļas. Mūsu rezultāti parādīja, ka 3TC ievērojami uzlabojaSAMP8 peļu novecošanās statuss, jo īpaši kognitīvo spēju samazināšanās, kas novērtēta ar Morisa ūdens labirinta testu. Lai turpinātu pētīt molekulāros mehānismusuzlabojot novecošanās stāvokliSAMP8 pelēm ar 3TC, qPCR un audu krāsošanas metodes tika izmantotas, lai pētītu peļu smadzeņu audus (ti, hipokampu un garozu), savukārt tīkla farmakoloģijas analīze tika izmantota, lai izpētītu iespējamos 3TC mērķus. Rezultāti liecināja, ka gēnu mRNS līmeņi ir saistīti ar gari mijas elementu -1, 1. tipa interferona reakciju, ar novecošanos saistīto sekrēcijas fenotipu unAlcheimera slimībaSAMP8 peļu hipokampā un garozā tika palielināts, jonovecošanās, taču šo tendenci daļēji mainīja 3TC. Histoloģisko pētījumu rezultāti parādīja, ka 3TC samazināja hipokampu neironu nāvi, savukārt tīkla farmakoloģijas analīzes rezultāti liecināja, ka 3TC var ietekmēt vairākus ceļus, tostarp estrogēnu signālu un PI3K/Akt un neiroaktīvo ligandu-receptoru mijiedarbības signālu ceļus, ko esam pārbaudījuši in vitro eksperimentos. Šie atklājumi sniedz pierādījumus par 3TC terapeitisko potenciālu neirodeģeneratīvo slimību ārstēšanā.

ATSLĒGVĀRDInovecošanās, kognitīvās spējas, lamivudīns, long mijas elements-1, neirodeģeneratīvas slimības

Ķīniešu garšaugi Cistanche Effect OnReversās transkriptāzes inhibitori par pretnovecošanos

1|IEVADS

Līdz šim novecošanās un neirodeģeneratīvas slimības, piemēram,Alcheimera (AD) vai Parkinsona slimībaskas saistīti ar novecošanu, arvien pieaug globālo demogrāfisko izmaiņu dēļ.1,2 kognitīvā lejupslīde ir nopietns šķērslis ilgas un veselīgas dzīves sasniegšanai. Gadu desmitiem ilgi ir pieliktas ievērojamas pūles, lai meklētu medikamentus, ko var izmantot, lai ārstētu kognitīvo deģenerāciju ar novecošanu.3 Pēdējos gados gari mijas elements -1 (L1) ir ieguvis arvien lielāku uzmanību kā potenciāls jaunums. Mērķis novecošanās pētīšanai.4 L1 pieder pie visplašāko negaro terminālo atkārtoto retrotranspozonu saimes ar ~500,{10}} kopijām, kas veido ~17 procentus no cilvēka genoma. L1 gēns satur operonu ar diviem atvērtiem nolasīšanas kadriem (ORF1 un ORF2), kas abi ir nepieciešami retrotranspozīcijai.5–7 ORF1 kodē proteīnu (ORF1p) ar reversās transkriptāzes aktivitāti, ko var inhibēt nukleozīdu analogi, piemēram, lamivudīns (2'-3'-deoksi-3'-tiocitidīns, 3TC).8

Aktīvais L1 var sintezēt cDNS ārpus hromatīna un pēc tam atkārtoti ievietot to genomā, ko katalizē ORF1p, galu galā mainot citu gēnu ekspresiju un izraisot slimības, kas saistītas ar genoma nestabilitāti.9,10 Saimnieks parasti inhibē L1 transponējamo aktivitāti, izmantojot virkni. regulējumu, piemēram, epiģenētiskās modifikācijas un saimniekorganisma ierobežojošo faktoru regulēšanu.11,12 L1 transponēšana parasti notiek tikai dīgļu vai vēža šūnās, savukārt jaunākie pētījumi liecina, ka L1 ir ļoti aktīvs arī centrālajā nervu sistēmā vai novecojošās šūnās. L1 pamatā esošie neironu mehānismi ir neskaidri.13 Pētījumi ir parādījuši, ka faktori (piemēram, TREX1, RB1 un FOXA1), kas saistīti ar L1 novērošanas mehānismu, ir disfunkcionāli šūnu novecošanās laikā, kā rezultātā L1 aktivizējas. TREX1 ir 3' eksonukleāze, kas degradē svešas invāzijas DNS, un tās zudums ir saistīts ar citoplazmas L1 cDNS uzkrāšanos.14 Ir pierādīts, ka RB1 saistās ar atkārtotiem elementiem, tostarp L1 elementiem, un veicina to heterohromatinizāciju.15 Un FOXA1 ir paaugstināti regulēts novecojošās šūnās13 un saistīts ar L1 5' UTR centrālo reģionu. Aktivētais L1 vēl vairāk aktivizē I tipa interferona (IFN-I) reakciju, kas izraisa iekaisumu, izmantojot reversās transkripcijas cDNS, un saglabā ar novecošanos saistīto sekrēcijas fenotipu (SASP). Tāpēc L1 kā svarīgu faktoru novecošanās izraisītā aseptiskā iekaisumā tiek uzskatīts par svarīgu mērķi ar novecošanu saistītu slimību ārstēšanā. Vecāka gadagājuma pelēm, kas ārstētas ar 3TC, iekaisuma faktoru uzkrāšanās uzlabojas, kavējot L1 ekstracelulāro transkripciju muskuļu un citos audos.16 Līdz šim pētījumi par reversās transkriptāzes inhibitoru ietekmi uz nervu sistēmas funkcijām ir reti. Pēdējā laikā mirušu pacientu ar AD smadzenēs ir atrasti tūkstošiem genoma cDNS (gencDNS) variantu, kas radušies raksturīgu RNS splicēšanas variantu atkārtotas ievietošanas genomā rezultātā.17 Šī parādība tiek uzskatīta par svarīgu AD cēloni. Faktori, kas izraisa gencDNS veidošanos, ir transkripcija, DNS iznīcināšana, reversā transkriptāze un novecošana.

Pētījumi ir parādījuši, ka gencDNS veidošanās process tiek bloķēts, izmantojot nukleozīdu reversās transkriptāzes inhibitorus Ķīnas kāmju olnīcu (CHO) šūnu līnijās ar endogēnu reversās transkriptāzes aktivitāti.19 Turklāt AIDS pacienti, kas vecāki par 65 gadiem un lietojuši reversās transkriptāzes inhibitorus. ilgu laiku reti attīstījās AD.20 Tāpēc mēs domājam, ka 3TC kā reversās transkriptāzes inhibitors var būt potenciāls medikaments novecošanas izraisītu kognitīvo traucējumu un neirodeģeneratīvo slimību ārstēšanai. Tika parādīts, ka novecošanās paātrinātām 8 (SAMP8) pelēm, kas ir paraugs cilvēka novecošanās un ar vecumu saistītu slimību izpētei, piemīt daudzas pazīmes, kas, kā zināms, rodas neirodeģeneratīvo slimību agrīnās stadijās, piemēram, paaugstināts oksidatīvais stress, neiroiekaisumi un kognitīvās spējas. samazināsies.21 Tāpēc šajā pētījumā SAMP8 peles tika izvēlētas kā ideāls dzīvnieku modelis novecošanas izraisītām neirodeģeneratīvām slimībām. Mēs koncentrējāmies uz 3TC kognitīvo ietekmi uz priekšlaicīgas novecošanas pelēm un ar novecošanu saistītajiem molekulārajiem ceļiem, sniedzot pierādījumus par reversās transkriptāzes inhibitoru lomu novecošanās izraisītu neirodeģeneratīvu slimību ārstēšanā. Tālāk mēs izmantojām tīkla farmakoloģijas metodi, lai prognozētu 3TC mērķus, izveidotu tīklus un analizētu ar 3TC saistītās bioloģiskās funkcijas un ceļus.

2|EKSPERIMENTĀLĀ IEDAĻA 2.1. |

Dzīvnieki Tjaņdzjiņas Tradicionālās ķīniešu medicīnas universitātes nodrošinātās 44-nedēļas tēviņu SAMP8 un radniecīgās normālas novecošanās paātrinātās peles-R1 (SAMR1) peles tika izmantotas pēc 1-nedēļas aklimatizācijas perioda. Dzīvnieku eksperimentālo protokolu apstiprināja Šaņdunas provinces slimnīcas Dzīvnieku ētikas komiteja, un tas tika veikts, pamatojoties uz Nacionālo veselības institūtu (NIH) rokasgrāmatu par laboratorijas dzīvnieku aprūpi un lietošanu. Peles tika turētas autoklāvos sprostos, un tām tika dota sterila barība un ūdens. Peļu ķermeņa svars tika reģistrēts katru dienu. Šajā pētījumā veikto eksperimentu plūsmas diagramma ir parādīta 1.A attēlā. Pēc eksperimentu pabeigšanas peles tika eutanizētas, ieelpojot dietilēteri.

2.2|3TC sagatavošana un ārstēšana

Narkotikas tika svaigi pagatavotas katra eksperimenta dienā. 3TC, kas iegādāts no MCE (Šanhaja, Ķīna), tika izšķīdināts DMSO līdz galīgajai koncentrācijai 2 mmol/L. Pēc tam izejas šķīdumu atšķaidīja līdz darba koncentrācijai, izmantojot dzeramo ūdeni ar DMSO galīgo koncentrāciju mazāku par 0,1 procentiem. Tika izveidotas trīs peļu grupas: kontroles grupa, kas apstrādāta ar nesēja šķīdumu (dzeramo ūdeni), testa grupa, kas apstrādāta ar 3TC, un SAMR1 grupa, kas saņēma nesēju, ko izmantoja kā citu kontroles grupu novecošanai. Testa grupa iekšķīgi saņēma 3TC devā 100 mg/kg dienā. Visas peles tika barotas ar intragastrālu ievadīšanu 4 nedēļas (1B attēls).

1. ATTĒLS Eksperimentālais dizains un 3TC ietekme uz relatīvā svara zuduma uzlabošanu novecošanās un novecošanas vērtēšanas punktu skaita dēļ. (A) Farmakoloģisko eksperimentu shēma, lai izpētītu 3TC ietekmi uz SAMP8 peļu kognitīvajām spējām. (B) Shematisks dzīvnieku eksperimentu grafika attēlojums. (C) Konceptuālā darbplūsma zāļu un mērķa mijiedarbības prognozēšanai, izmantojot Pharmmapper, kurā no kreisās puses uz labo parādīta 3TC molekulārā struktūra, 3TC 3D strukturālā diagramma un farmakofora modelis, kas prognozēts ar 3TC saistīšanos ar estrogēna receptoru ar visaugstāko normalizēto līmeni. fit rādītāji. (D) ķermeņa svara augšanas modelis katrā peļu grupā. (E) Izmaiņas vērtēšanas rādītājos pirms un pēc 3TC ārstēšanas. SAMR1 plus Vehicle: 44-nedēļu vecas SAMR1 peles, kas apstrādātas ar nesēju 4 nedēļas. SAMP8 plus Vehicle: 44-nedēļu vecas SAMP8 peles, kas apstrādātas ar transportlīdzekli 4 nedēļas. SAMP8 plus 3TC: 44-nedēļu vecas SAMP8 peles, kas apstrādātas ar 3TC 4 nedēļas. Studenta t-tests: *p < 0.05, **p < 0,01 un ***p < 0,001. ns: nav statistiskas nozīmes. Melnās zvaigznītes ir salīdzinājums ar SAMR1 plus transportlīdzekļu grupu. Sarkanās zvaigznītes ir salīdzinājums ar SAMP8 plus transportlīdzekļu grupu. Zilā līnija apzīmē SAMP8 plus 3TC grupu 44 un 48 nedēļu vecumā.

2,3|Vērtēšanas punktu sistēma

Novecošanās pakāpe pelēm tika novērtēta, izmantojot iepriekš aprakstīto vērtēšanas punktu sistēmu.22 Katrai punktu kategorijai ir pieci līmeņi, sākot no 0 līdz 4, un augstākais atzīmes rādītājs norāda uz dzīvnieka novecošanās augstāko pakāpi. . Katras kategorijas punktus atsevišķi novērtēja četri pieredzējuši eksperimentētāji, kuri bija akli pret ārstēšanas apstākļiem (papildu tabula S1).

.2.4|Morisa ūdens labirinta tests

Morisa ūdens labirinta pētījumi tika veikti saskaņā ar Morisa protokolu, ieskaitot orientācijas navigācijas eksperimentu un zondes izmēģinājumus.23 Ūdens labirints bija apļveida baseins (120 cm diametrā, kas aprīkots ar platformu 10 cm diametrā) un piepildīts ar ūdeni 25 ° C temperatūrā. ± 1 grāds. Peles tika apmācītas vienas minūtes laikā atrast platformu zem ūdens virsmas. Ja pele platformu neatrada 60 s laikā, tā tika novadīta uz platformu un tai ļāva tur palikt 20 s. Katra no pelēm tika apmācīta piecas reizes dienā, katru atdalot viena no otras par 15 minūtēm. Katrā izmēģinājumā sākuma pozīcija bija atšķirīga, pseidogadījuma secībā. Sestajā testa dienā platforma tika noņemta un dzīvnieks iekļuva ūdens labirintā no punkta, kas bija pretējs labirinta kvadrantam, kur treniņa laikā atradās platforma, un labirintu varēja izpētīt 60 sekundes. Peldēšanas ceļu un laiku, ko peles pavadīja, meklējot labirintu, ierakstīja videokamera un analizēja, izmantojot EthoVision XT (Noldus Software). Katrā grupā bija vismaz astoņi dzīvnieki.

2,5|RNS ekstrakcija un kvantitatīvā PCR

Kopējā RNS tika ekstrahēta no peļu hipokampu un kortikālajiem audiem pēc apstrādes, izmantojot TRIzol reaģentu (Invitrogen) saskaņā ar ražotāja protokolu. Katrs RNS paraugs (1 ug) tika reversi transkribēts, lai ģenerētu cDNS, izmantojot cDNS reversās transkripcijas komplektu (Takara), un pēc tam PCR pastiprināts, izmantojot TaKaRa Taq komplektu (Takara). Primer komplekti ir aprakstīti S2 papildu tabulā.

2,6|Audu sagatavošana

Dzīvnieki tika anestēzēti ar dietilēteri, un viņu smadzenes tika savāktas pēc transkardiālās perfūzijas ar fosfātu buferšķīdumu (PBS) un 4 procentu paraformaldehīda šķīdumu. Smadzeņu audi tika noņemti un fiksēti paraformaldehīdā vairāk nekā 2 dienas. Fiksētās smadzenes tika iestrādātas parafīnā, un hipokampu audi tika sadalīti 5 μm biezumā.

2,7|Hematoksilīna un eozīna (H & E) krāsošana

Smadzeņu morfoloģija tika analizēta, izmantojot hematoksilīna un eozīna (H & E) krāsošanas metodes. Hipokampu audu parafīna sekcijas tika attīrītas un dehidrētas ar spirta gradientu ar vairāku koncentrāciju sēriju. HE krāsošana tika veikta, izmantojot H & E krāsošanas komplektu (Solarbio) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Pēc iegremdēšanas etanolā un ksilolā sekcijas tika uzstādītas ar sveķiem un novērotas gaismas mikroskopā (Olympus).

2,8|Nissl krāsošana

Nissl krāsošanas (Biyuntian) metode tika izmantota, lai noteiktu neironu bojājumus hipokampu audu daļās. Sekcijas tika inkubētas ar Nissl traipu 30 minūtes un mazgātas ar 95% etanolu. Iekrāsotās šūnas tika skaitītas un fotografētas gaismas mikroskopā (Olympus). Šūnas tika skaitītas trīs nejauši izvēlētos nepārklājošos laukos katrā hipokampu audu slaidā ar izdzīvošanas indeksu, kas definēts kā izdzīvojušo neironu skaits / kopējais neironu skaits.

2,9|TUNEL krāsošana

Hipokampu audu sekcijas tika inkubētas ar proteināzes K šķīdumu 15 minūtes, kam sekoja inkubācija ar TUNEL reakcijas maisījumu (Beyotime). Pēc trīs reizes mazgāšanas ar PBS, sekcijas tika uzstādītas ar montāžas šķīdumu, kas satur kodolkrāsu DAPI, un tika novērotas, izmantojot parasto fluorescences mikroskopu vai konfokālo lāzera fluorescences mikroskopu.

2,10|3TC mērķa datu bāzes izveide

3TC mērķa datu bāze tika izveidota, pamatojoties uz divām datu bāzēm. Pirmkārt, potenciālie 3TC mērķi tika identificēti, izmantojot apgriezto farmakodinamisko gēnu karti, kuras pamatā ir Pharmmapper datubāze (//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/results/20081 6062539.html). Visas ķīmiskās sastāvdaļas Chembiodraw pārveidoja formātā “.mol2” un augšupielādēja Pharmmapper datubāzē (1. C attēls). Molekulas ar normalizēto piemērotības rādītāju, kas pārsniedz 4.{7}}, tika identificētas kā potenciālie 3TC mērķi. Otrkārt, datubāze ChEMBL (https://www.ebi.ac.uk/chembl/compound_re port_card/CHEMBL141/) tika izmantota, lai noskaidrotu mērķu vai savienojumu bioloģiskās aktivitātes. Proteīni, kas pārbaudīti kā iegūti no Homo sapiens, tika identificēti kā potenciālie 3TC mērķi.

2,11|Mērķa proteīnu mijiedarbības analīze un tīkla izveide

The target proteins screened were integrated for the protein-protein interaction (PPI) analysis using String 9.1 (http://string-db.org/) with the protein network interaction diagrams generated. Protein interactions with a confidence score >Pēc dublikātu novēršanas izstrādātajā iestatījumā tika atlasīti 0.4.

Lai vispusīgi izpētītu 3TC molekulāros mehānismus, PPI tīkli tika izveidoti, izmantojot programmatūras Cytoscape versiju 3.6.0.(http://www.cytoscape.org/). Mezglu pakāpju analīze tika veikta ar Centiscape 2.2 (http://apps.cytoscape.org/apps/centiscape), lai tīklos pārbaudītu centrmezglu gēnus ar tuvuma centralitātes vērtību, starpcentralitātes vērtību un pakāpes centralitātes vērtību, kas iestatīta uz {{6 }}.2, 450 un 50, attiecīgi.

2,12|3TC signalizācijas ceļu bagātināšana un pārbaude

Gēnu ontoloģijas (GO) bagātināšanas analīze ar bioloģiskajiem procesiem, šūnu komponentiem un potenciālo mērķu molekulārajām funkcijām tika veikta bioloģisko funkciju anotācijai, pamatojoties uz DAVID bioinformātikas datubāzi (//david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp). KEGG vielmaiņas ceļi tika anotēti, pamatojoties uz Kioto enciklopēdijas gēnu un genomu (KEGG) datubāzēm, izmantojot tiešsaistes KEGG automātisko anotāciju serveri (http://www.genome.jp/kegg/)

2,13|3TC saistīšana ar prognozētajiem mērķiem

Savienojuma 3TC SDF struktūras faili tika iegūti Pubchem vietnē (//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/). SDF fails tika pārveidots par PDB failu, izmantojot programmatūru OpenBabel2.3.2, un receptoru proteīni ADRB2 (PDBID: 3KJ6), AKT1 (PDBID: 4EKL) un EGFR (PDBID: 6S9C) tika iegūti no Protein Data Bank datu bāzes (www.wwpdb). .org). PYMOL2.3.4 programmatūra tika izmantota, lai noņemtu ūdeni un ligandus no receptoru proteīniem. Docking pētījums tika veikts, izmantojot AutoDock Vina (1.1.2), kas ir Scripps izstrādāta atvērtā koda molekulārās dokstacijas programmatūra. Programmatūra Tools tika izmantota, lai modificētu četrus receptoru proteīnus, un Grid Box komanda Grid programmā tika izmantota, lai atvērtu Grid Option rīku, lai analizētu katru receptoru proteīnu. Režģa atstatums tika iestatīts uz 1, un kabatas centrs tika iestatīts kā saistīšanas vietas centrs.

2,14|Šūnu kultūra un ārstēšana

Peļu hipokampu neironu šūnu līnijas HT22 tika iegādātas no Shanghai Cell Biotechnology Company. HT22 šūnas tika kultivētas DMEM, kas papildināts ar 10% liellopu augļa serumu (FBS). Šūnas tika iesētas 6-iedobju plāksnēs 1 dienu pirms eksperimentālās apstrādes. Šūnu novecošanos izraisīja formaldehīds (FA), kas iegādāts no Sigma-Aldrich, kā aprakstīts iepriekš.24 HT22 šūnas tika sadalītas trīs grupās, ieskaitot FA grupu, kas 24 stundas apstrādāta ar 30 µmol/L FA, FA/3TC grupa tika apstrādāta gan ar 30 µmol/L FA un 50 µmol/L 3TC, un kontroles grupa tika kultivēta bez FA vai 3TC.

2,15|Imunofluorescence un mikroskopija

Barotne tika noņemta, un šūnas tika fiksētas, izmantojot 2 procentu paraformaldehīda šķīdumu 1 stundu istabas temperatūrā. Imunofluorescences eksperiments tika veikts, kā aprakstīts iepriekš.25 Šajā pētījumā izmantotās antivielas ietvēra anti LINE-1 ORF1p antivielu (1:1000; Sigma-Aldrich) ar Alexa Fluor 594 sekundāro antivielu (1:1000; Invitrogen). . Šūnas tika inkubētas ar DAPI (1:500 atšķaidījums; Thermo Fisher Scientific) 1 minūti, lai marķētu kodolus. Pēc antifluorescences dzēšanas stiprinājuma līdzekļa pievienošanas šūnas tika novērotas, izmantojot konfokālo mikroskopu (Nikon). 2,16|Western blot analīze

EGFR, p-AKT1 (Active Akt1: fosforilēts pie S473) un ADRB2 ekspresijas tika mērītas ar Western blot analīzi. Kopējais proteīns tika savākts no šūnām pēc dažādām apstrādēm. Western blot tika veikts, kā aprakstīts iepriekš.26 Šajā pētījumā izmantotās antivielas ietvēra anti-EGFR antivielu (1:500; Sigma-Aldrich), anti-pAKT1 antivielu (1:1000; Sigma-Aldrich) un anti-ADRB2 antivielu (1:200; Sigma-Aldrich) ar anti-trušu sekundāro antivielu (1:1000; Invitrogen). Pēc mazgāšanas bloti tika izstrādāti ar ECL Western blotting noteikšanas sistēmu (Amersham, Aylesbury, UK).

2,17|Datu analīze un statistika

Katrs eksperiments tika atkārtots vismaz trīs reizes un tika uzskatīts par derīgu ar līdzīgiem rezultātiem. Rezultāti tika parādīti kā vidējā ± standarta novirze (SD). Būtiskā atšķirība tika noteikta ar Stjudenta t-testu ar p < 0.05.

Jautājiet vairāk:

E-pasts:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950