Zema parakvāta koncentrācija izraisa ārpusšūnu signālu regulētās kināzes 1/2, proteīna kināzes B un C-Jun N-termināla kināzes 1/2 aktivizēšanos: C-Jun N-termināla kināzes loma parakvāta izraisītā šūnu nāvē

Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com

Mireia Niso-Santano, Hosē M. Morans, Lurdesa Garsija-Rubio, Ana Gomeza-Martina, Rosa A. Gonzaleza-Polo, Germāns Solers § un Hosē M. Fuentess

Abstract:

Parakvāts ir herbicīds, kas var izraisīt parkinsonismu, jo tam ir pierādīta neirotoksicitāte un tā spēcīgā strukturālā līdzība ar 1-metil-4-fenilpiridīniju (MPP plus), plaši pazīstamu neirotoksīnu, kas izraisa līdzīgu klīnisko sindromu. uzParkinsona slimība(PD). Tomēr šobrīd ļoti maz ir zināms par signalizācijas ceļiem, ko jebkurā šūnu sistēmā aktivizē parakvāts. Šajā pētījumā mēs esam pētījuši parakvāta ietekmi uz ārpusšūnu signālu regulētajām kināzēm 1 un 2 (ERK1/2), c-Jun N-termināla kināzi (JNK) un proteīnkināzes B (PKB) aktivāciju E18 šūnās. Zemas parakvāta koncentrācijas stimulēja ļoti agrīnu ERK1/2, JNK1/2 un PKB fosforilācijas pieaugumu. Fosfatidilinozīta 3-kināzes (PI-3K) inhibitori wortmannin un LY 294002 (2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H{{ 19}}benzopirāns-4-viens) kavēja agrīnu parakvāta izraisītu PKB fosforilācijas pieaugumu. Turklāt agrīna parakvāta izraisīta ERK1/2 aktivācijas palielināšanās bija jutīga pret mitogēnu aktivēto proteīnkināzes kināzes 1 (MEK1) inhibitoru PD 98059 (2#-amino-3#-metoksiflavonu), savukārt JNK1/2 atbildes reakcijas bija bloķē JNK1/2 inhibitors SP 600125 (antra[1-9-cd]pirazol-6(2H)-ons). Iepriekšēja apstrāde ar wortmannin, LY 294002 vai PD 98059 neietekmēja parakvāta šūnu nāvi E18 šūnās. Turpretim SP 600125 ievērojami samazināja parakvāta izraisītu šūnu nāvi E18 šūnās. Noslēgumā mēs esam parādījuši, ka zemas parakvāta koncentrācijas stimulē spēcīgu ļoti agrīnu ERK1 / 2, JNK1 / 2 un PKB fosforilācijas pieaugumu E18 šūnās. Turklāt iesniegtie dati liecina, ka JNK1 / 2 ceļa kavēšana aizsargā E18 šūnas no parakvāta izraisītas šūnu nāves un apstiprina faktu, ka JNK1 / 2 agrīnas aktivācijas kavēšana var būt potenciāla stratēģija PD ārstēšanā. Atslēgas vārdi: parakvāts; zemas koncentrācijas; JNK; šūnu nāve; Parkinsons.

Zāles pret Parkinsona slimību:cistanche

IEVADS

Parkinsona slimība (PD)ir neirodeģeneratīvs traucējums, kam raksturīga dopamīnerģisko neironu nāve subkonstantijas nigras kopā ar intracitoplazmas ieslēgumiem, kas pazīstami kā Lewy ķermeņi (Olanow un Tatton, 1999). Tikai 5–10 procentiem PD pacientu ir šīs slimības ģimenes forma ar autosomāli dominējošu mantojuma veidu (Gasser, 2001). Ģenētiskie faktori ir svarīgi gados jauniem pacientiem, taču tiem, visticamāk, nav lielas nozīmes biežāk sastopamajā sporādiskā PD. Turpretim epidemioloģiskie pētījumi norāda uz vairākiem vides faktoriem, kas palielina PD attīstības risku.Parkinsona slimība). Tie ietvēra pesticīdus, herbicīdus, rūpnieciskās ķīmiskās vielas, lauksaimniecību un dzīvošanu lauku vidē (Cory-Slechta et al., 2005; Gasser, 2001; Landrigan et al., 2005; Tanner un BenShlomo, 1999). Pārliecinošākais arguments vides faktora atbalstam PD ir saistīts ar MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-) bioloģiskās ietekmes atklāšanu. tetrarhi-dropiridīns). Šis centrālās nervu sistēmas toksīns rada sindromu, kas gan klīniski, gan anatomiski ir līdzīgs PD (Kopin un Markey, 1988; Langston et al., 1983). Šajā ziņā plaši izmantotais herbicīds parakvāts (1,1#-dimetil-4,4#-bipiridīnijs) ir ierosināts kā iespējamais riska faktors, pamatojoties gan uz tā strukturālo homoloģiju ar MPPþ, aktīvo MPTP metabolītu. Tanner un Langston, 1990), kā arī ziņojumi par parkinsonismu, kas korelē ar aģenta iedarbību (Hertzman et al., 1990; Hubble et al., 1993; Jimenez-Jimenezet al., 1992; Liou et al., 1997; Wang et al. al., 1992). Tomēr, lai gan signalizācijas ceļi, kas saistīti ar MPPþ šūnu nāvi, ir labi zināmi (Halvorsen et al., 2002; Gomez-Santos et al., 2002; Gonzalez-Polo et al., 2003), ļoti maz ir zināms par aktivizētajiem signalizācijas ceļiem. parakvāts (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) Jebkurā gadījumā nav pētījumu par agrīniem notikumiem, kas novēroti pēc zemas parakvāta koncentrācijas iedarbības.

Vairāki stimuli, tostarp MPPþ un parakvāts, var aktivizēt virkni intracelulāro signalizācijas kaskāžu, kas ir cieši saistītas gan ar šūnu nāvi, gan šūnu izdzīvošanas ceļiem. Piemēram, MPPþ (Gomez-Santos et al., 2002; Halvorsen et al., 2002) aktivizē mitogēnu aktivētās proteīnkināzes (MAPK) saimes un proteīna kināzes B (PKB) locekļus. TheMAPK ģimenes locekļus aktivizē MPPþ vai parakvāts, tostarp ārpusšūnu signālu regulētās kināzes 1 un 2 (ERK1/2), c-Jun N-termināla kināzes (JNK1 un JNK2) un p38 MAPK. Ir vispāratzīts, ka ERK1/2 un PKB aktivācija veicina šūnu izdzīvošanu, aktivizējot anti-apoptotiskos signalizācijas ceļus, turpretim JNK1/2 un p38 MAPK aktivācija ir saistīta ar neironu šūnu nāvi (Harper un LoGrasso, 2001; Shin et al., 2001; Xia et al., 1995) . Fosfatidilinozīta 3-kināzes (PI-3K)/PKB ceļa aktivizēšana ir saistīta ar neironu izdzīvošanu (Shin et al., 2001). Jo īpaši JNK1/2 ceļa aktivizēšanai var būt izšķiroša nozīme MPP un parakvātu toksicitātē (Cassarino et al., 2000; Halvorsen et al., 2002; Peng et al., 2004) un līdz ar to arī šūnu procesos, kas tiek ietekmēti PD(Parkinsona slimība).

Herb cistanche: Anti-Parkinsona slimība

MATERIĀLI UN METODES

Šūnu līnija un kultūra.

Šajā pētījumā tika izmantoti spontāni iemūžināti žurku smadzeņu neiroblasti, E18 šūnas. Šūnu līnija E18 tika iegūta, spontāni iemūžinot no 18-dienu vecu augļa žurku smadzeņu garozas kultūrām, un to laipni nodrošināja Dr. A. Munoz (Instituto de InvestigacionesBiome´dicas, CSIC, Madride, Spānija) . E18 šūnas pārstāv primitīvus neiroblastus, kas ekspresē NF 68 un primitīvo neironu marķieri nestinu, bet tiem trūkst astrocītu marķiera, glia fibrilārā skābā proteīna. Pēc daļējas diferenciācijas indukcijas ar dibutiril-cAMP, šūnas ekspresē papildu neironu marķierus, piemēram, NF 145, NF 220 un neironam specifisko enolāzi (Mun˜oz, personīgā komunikācija). Šūnas tika audzētas Hanks' F-12 (Hyclone, Brevieres, Francija) un papildinātas ar 10% FCS (Hyclone), streptomicīnu (100 mg/ml) un penicilīnu (100 V/ml). Šūnas tika iesētas 5 3 10 5 °C temperatūrā 75-cm2 audu kultūras kolbā (TPP, Trasadingen, Šveice) un inkubētas 37 C temperatūrā 5% CO2/95% gaisa atmosfērā. Kultūras tika pasētas reizi nedēļā ar tripsīnu, izmantojot tripsīna-EDTA šķīdumu (Hyclone).

Šūnu apstrāde.

Saplūstošās šūnas (~ 80 procenti) 75-cm2 audu kultūras kolbās tika tripsizētas un iesētas audu kultūras trauciņos ar koncentrāciju 5 3104 šūnas/cm2. Divdesmit četras stundas vēlāk barotne tika aspirēta un aizstāta ar tikai svaigu barotni vai barotni, kas satur norādītās parakvāta koncentrācijas. Turpmākajos eksperimentos tika izmantotas dažādas kināzes inhibitoru koncentrācijas (LY 294002, wortmannin, SP 600125 un PD(Parkinsona slimība)98059, visi no Tocris, Bristole, Apvienotā Karaliste) tika pievienoti 30 minūtes pirms parakvāta iedarbības. Tā kā kināzes inhibitori tika izšķīdināti dimetilsulfoksīdā, kontroles tika veiktas ar augstāko izmantoto koncentrāciju (0,2 tilp. procenti). Dimetilsulfoksīda pievienošana neietekmēja kontroles plākšņu dzīvotspējas vērtības.

Šūnu dzīvotspējas tests.

Šūnu dzīvotspēja tika noteikta ar kolorimetrisko MTT testu (Mosmann, 1983). Dzīvotspējīgās šūnās mitohondriju enzīms sukcināta dehidrogenāze var metabolizēt MTT formāzāna krāsā, kas absorbē gaismu pie 570 nm. Šiem eksperimentiem tika izmantotas 24-iedobes testa plāksnes. Katras apstrādes beigās katrai platei pievienoja 100 l MTT, kas sagatavots 5 mg/ml koncentrācijā PBS. Pēc 3 stundu ilgas inkubācijas barotne tika dekantēta un formazāna nogulsnes tika izšķīdinātas ar skābu izopropanolu (0, 04–0, 1 N HCl absolūtā izopropanolā). Pārveidotās krāsvielas absorbcija tika mērīta pie viļņa garuma 570 nm ar fona atņemšanu pie 630–690 nm. Neapstrādāto kultūru absorbcija tika iestatīta uz 100 procentiem.

Lai apstiprinātu ar MTT testu iegūtos rezultātus, šūnu nāve tika novērtēta arī, mērot citozoliskā enzīma laktātdehidrogenāzes (LDH) izdalīšanos barotnē, izmantojot kolorimetrisko LDH testa komplektu (Roche, Indianapolis, IN) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. . LDH noplūde tika definēta kā LDH aktivitātes attiecība barotnē pret kopējo aktivitāti vienā iedobē (3100). Salīdzināmi dati tika iegūti, izmantojot abas metodes.

Šūnu ekstraktu sagatavošana un Western blot analīze.

Pēc eksperimentālās apstrādes šūnas (kultivētas 60-mm trauciņos) divas reizes noskaloja ar aukstu PBS un noņēma, sagriežot metāllūžņos, un pēc tam centrifugēja ar 900 3 g 5 minūtes 4 C temperatūrā. Šūnas tika lizētas buferšķīdumā. kas satur 50 mM HEPES, pH 7,5, 300 mMNaCl, 1 procentu Triton X-100, 2 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 25 mM NaF, 1 mMNa3VO4 un proteāzes inhibitoru kokteili (Sigma, Sentluisa, MO). Šūnas centrifugēja pie 13,000 3 g 5 minūtes 4 C temperatūrā. Supernatanti tika uzglabāti 80 C temperatūrā līdz analīzei ar Western blot. Olbaltumvielu koncentrācija tika mērīta saskaņā ar Bredfordu (1976), izmantojot BSA kā standartu.

Vienāds daudzums olbaltumvielu (10 LG katrā stāvoklī) tika izšķīdināts 12% SDS gēla elektroforēzē un pārnests uz PVDF membrānām saskaņā ar tradicionālajām daļēji modificētajām metodēm (Fuentes et al., 2000). Īsumā, olbaltumvielas tika pārnestas (250 mA 60 minūtes) uz PVDF membrānām, izmantojot Mini Trans-Blot Cell aparātu (Bio-Rad, Hercules, CA). Imūndetekcijas procedūra ietver membrānas pārvietošanu un bloķēšanu (60 min istabas temperatūrā) ar TTBS (10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl un 0,2 procenti Tween-20), kas satur 10 % beztauku žāvēta piena. Pēc tam membrānas 60 minūtes inkubēja istabas temperatūrā ar trušu poliklonālajām primārajām antivielām (visas no Cell Signalling, Beverly, MA, atšķaidītas 1:1000) TTBS þ 10% beztauku žāvētā pienā vai 5% BSA. Pēc mazgāšanas (divus 5-min. periodus ar TTBS) membrānas inkubēja (60 minūtes istabas temperatūrā) ar peroksidāzi konjugētām anti-truša sekundārajām antivielām (1:5000 TTBS ar 10% beztauku žāvētu pienu). Pēc mazgāšanas (divus 5-min periodus un vienu 10-min periodu) saistīto antivielu noteikšana tika vizualizēta ar hemiluminiscenci, izmantojot ECL-plus reaģentu (Amersham Biosciences, Orsay, Francija), un analizēta ar Quantity. Viena programmatūra (Bio-Rad). Aktīna saturs tika analizēts kā kontrole, izmantojot truša poliklonālo antivielu (no Sigma), kas atšķaidīta 1:2500 TTBS ar 10 procentiem beztauku žāvēta piena).

Statistiskā analīze.

Katrs eksperiments tika atkārtots vismaz trīs reizes ar apmierinošu korelāciju starp atsevišķu eksperimentu rezultātiem. Parādītie dati ir reprezentatīva eksperimenta dati; katra grupa bija vidēji trīs līdz četri kultūras ēdieni. Visi dati ir izteikti kā vidējais ± SEM. Rezultāti tika analizēti ar ANOVA. P vērtības, kas mazākas par 0,05, tika uzskatītas par nozīmīgām.

Anti-Parkinsona slimība:Cistanche ekstrakts

REZULTĀTI

Parakvāta citotoksiskā iedarbība E18 šūnās

Kā ziņots iepriekš (Cappelletti et al., 1998; Chun et al., 2001; Gonzalez-Polo et al., 2004), vairākas šūnu līnijas ir jutīgas pret parakvāta toksiskajām īpašībām. Parakvāta iedarbība izraisīja no devas atkarīgu šūnu dzīvotspējas samazināšanos. (1. att.) Šajā pētījumā E18 šūnas, kas 24 stundas apstrādātas ar 25 lM parakvātu, uzrādīja šūnu dzīvotspējas zudumu par 50 procentiem. Šūnu dzīvotspēja tika novērtēta, mērot transformāciju uz MTT formazāna krāsā, kas absorbē gaismu pie 570 nm. Šo testu plaši izmanto, lai uzraudzītu šūnu nāvi vairākās šūnu līnijās, tostarp E18 šūnās (Donaire et al., 2005; Garcia-Roman et al., 2001), un dažādus apvainojumus, tostarp parakvātu (Chun et al., 2001; Gonzalez). -Polo et al., 2004).

Parakvāta izraisīta ERK1/2 aktivizēšana E18 šūnās

ERK1/2 aktivācijas palielināšanās E18 šūnās, kas apstrādātas ar parakvātu, tika uzraudzīta ar Western blot metodi, izmantojot fosfospecifisku ERK1/2 (Thr202/Tyr204) antivielu. E18neuroblastu šūnu ekspozīcija ar 25 lM parakvātu izraisīja ievērojamu ERK1/2 (44/42 kDa) fosforilācijas (Thr202/Tyr204) statusa pieaugumu (2.A attēls). Maksimālais fosforilācijas pieaugums notika pēc 5 minūtēm, pēc tam fosforilācijas līmenis lēnām pazeminās līdz gandrīz bazālajam līmenim. Turklāt parakvāta izraisītā ERK1/2 fosforilēšanās palielināšanās nebija atkarīga no koncentrācijas (2.B att.). Iepriekšēja apstrāde ar theMEK1 inhibitoru, PD(Parkinsona slimība)98059 (50 lM; Dudley et al., 1995) pilnībā inhibēja parakvāta izraisītu ERK1/2 fosforilācijas pieaugumu (3. att.).

Parakvāta izraisīta PKB aktivizēšana E18 šūnās

PKB aktivācija E18 šūnās tika noteikta ar Western blot metodi, izmantojot fosfospecifisku (Ser473) antivielu. E18 šūnu stimulēšana ar 25 lM parakvātu izraisīja ievērojamu PKB fosforilācijas pieaugumu (4.A attēls). Šis pieaugums notiek pēc 20 minūtēm, kas ir salīdzināms ar ERK1/2 fosforilēšanos pēc tam, kad fosforilācijas līmenis lēnām samazinājās līdz gandrīz bazālajam līmenim (4. att.). Turklāt parakvāta izraisītā PKB fosforilēšanās palielināšanās bija atkarīga no koncentrācijas, un maksimums bija 25 lM parakvāta (4.A attēls). Tā kā PI-3K ir nepieciešams PKB aktivācijai, PI-3K loma parakvāta izraisītā PKB aktivācijā E18 šūnās tika pētīta, izmantojot PI-3K inhibitorus wortmannin un LY 294002.

Parakvāta izraisītā PKB fosforilēšanās palielināšanās tika pilnībā bloķēta pēc E18 šūnu pirmapstrādes (30 min) ar 100 nM wortmannin un 30 lM LY 294002 (5. attēls). Šie novērojumi parāda, ka no PI-3K atkarīgs ceļš veicina parakvāta izraisītu PKB fosforilācijas pieaugumu E18 šūnās.

Parakvāta izraisīta JNK1/2 aktivizēšana E18 šūnās

Iepriekšējie pētījumi liecina, ka parakvāts aktivizē JNK1/2 neironos (Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) un noneuronal šūnās (Bennett et al., 2001; Cheng et al., 2003). Tomēr izmantotās koncentrācijas lielā mērā ir augstākas nekā šajā darbā izmantotās. Turklāt laiki, kas atlasīti, lai vizualizētu JNK1/2 aktivizāciju, ir arī garāki. JNK1/2 aktivācija E18 šūnās tika noteikta ar Western blot metodi, izmantojot fosfospecifisku JNK (Thr183/Tyr185) antivielu. E18 šūnu stimulēšana ar 25 lM parakvātu izraisīja ievērojamu un agrīnu JNK (46/54 kDa) fosforilācijas pieaugumu (6.A attēls). Šis pieaugums bija maksimālais pēc 5 minūtēm, pēc kurām fosforilācijas līmenis samazinājās līdz bāzes līmenim (6. att.). Tomēr parakvatmediētais JNK1/2 fosforilācijas pieaugums nebija atkarīgs no koncentrācijas (6.B att.). Ar parakvātu saistītais JNK1/2 fosforilācijas pieaugums bija jutīgs pret JNK1/2 inhibitoru SP 600125 (10 lM; 7. att.; Bennett et al., 2001). Visbeidzot, parakvāts (25 lM) nestimulē izmērāmu p38 MAPK fosforilācijas pieaugumu E18 šūnās tajā pašā laika gaitā (dati nav parādīti). Šie eksperimenti tika veikti, izmantojot fosfospecifisku p38 MAPK (Thr180/Tyr182) antivielu.

Šūnu dzīvotspējas mērīšana pēc E18 šūnu apstrādes ar parakvāta un kināzes inhibitoriem

Parādījuši, ka parakvāts visos gadījumos rada agrīnu aktivāciju ERK1/2, PKB un JNK1/2 E18 šūnās, mēs pēc tam noteicām šo kināzes ceļu ātrās aktivācijas lomu šūnu nāvē, ko izraisa zemas parakvāta koncentrācijas, izmantojot farmakoloģisku specifisku. inhibitori. Kā parādīts 1. attēlā, E18 šūnu pakļaušana 25 lM parakvātam izraisīja būtisku šūnu dzīvotspējas samazināšanos (apmēram par 50 procentiem). Lai izpētītu ERK1/2, PKB un JNK1/2 lomu parakvāta izraisītā šūnu nāvē, E18 šūnas tika iepriekš inkubētas 30 minūtes ar šādiem kināzes inhibitoriem: PD.(Parkinsona slimība)98059 (50lM; MEK1/2 inhibitors), LY 294002 (30lM; PI-3K inhibitors), wortmannīns (100nM; PI-3K inhibitors) un SP 600125 (10lM; JNK1/2 inhibitors). Kā parādīts 8. attēlā (un tas ir apkopots 1. tabulā), wortmannin, LY 294002 un PD 98059 būtiski neietekmēja šūnu dzīvotspējas zudumu, ko izraisīja 25 lM parakvāts.

DISKUSIJA

Nesen dažādi pētījumi ir palielinājuši interesi par iespēju, ka vides neirotoksīni, piemēram, pesticīdi, var būt saistīti ar neģenētiskas PD attīstību.(Parkinsona slimība)(Cory Slechta et al., 2005; Landrigan et al., 2005; Norris et al., 2004; Ritz and Yu, 2000; Sherer et al., 2001). PQ ir viens no iespējamiem herbicīdiem, kas ir iesaistīts PD, jo ir līdzīga ķīmiskā struktūra ar MPPþ un cieša korelācija starp slimības sastopamību un PQ daudzumu (Lanska, 1997; Liou et al., 1997; Ritz un Yu, 2000). Tomēr neironu toksicitātes mehānisms, kas rodas, nepietiekami pakļaujot zemam parakvāta līmenim, nav noteikts. Jebkurā gadījumā iepriekšējos darbus neinteresē agrīnais process, kas liecina pēc parakvāta ekspozīcijas. Šī pētījuma galvenais atklājums ir tāds, ka mēs esam parādījuši, ka E18 neiroblastu šūnas, kas pakļautas zemām paraquatrapid koncentrācijām, palielināja parasti antiapoptotisko signālu ceļu PI-3K/PKB un MEK ERK aktivēto fosforilāciju, kā arī parasti proapoptotisko JNK1/. 2 MAPK. Turpretim parakvāts nestimulē no laika vai koncentrācijas atkarīgu izmērāmu p38 MAPK fosforilācijas pieaugumu. Kā norādīts iepriekš, mēs izmantojām zemu parakvāta koncentrāciju. Ir apspriesta fakta, vai parakvāts var iekļūt smadzenēs, jo tā ir uzlādēta molekula, nozīme. Tomēr nesenie atklājumi (Shimizu et al., 2001) atklāja, ka parakvāts var izmantot neitrālu aminoskābju sūkni, lai iekļūtu smadzenēs. Šajā darbā sniegtie atklājumi liecina, ka šūnā ir nepieciešama tikai zema parakvāta koncentrācija, lai ātri stimulētu vairākus signālu ceļus, tostarp NK, kas iesaistīti šūnu nāves procesos. Šīs agrīnās aktivizēšanas zemās parakvāta koncentrācijas dēļ šajā darbā tiek ierosinātas pirmo reizi.

Parakvāta izraisīto PKB vai ERK1/2 fosforilācijas līmeņu izmaiņu izpētei ir veltīta maz uzmanības (Cheng et al., 2003; Peng et al., 2004). Jebkurā gadījumā iepriekšējos ziņojumos (Peng et al., 2004) ir izmantota salīdzinoši augsta parakvāta koncentrācija (400 lM), mērot ERK fosforilācijas pakāpi pēc 12–18 stundu ilgas iedarbības. Šajos laikos viņi nenovēroja p-ERK līmeņa izmaiņas. Savā darbā mēs konstatējām agrīnu (5–10 min) un svarīgu ERK1/2 aktivizāciju (2.A att.). Šī aktivizēšana lēnām samazinās līdz pamata līmenim. Mūsu apstākļos fosforilētā ERK1 / 2 līmenis (pēc 12–18 stundām) ir tāds pats kā kontrolē, norādot, ka šis ceļš šajos laikos nav aktīvs (dati nav parādīti), kā aprakstījis Peng et al. (2004). Šī aktivizēšana nav atkarīga no koncentrācijas, kas norāda uz rezultātu, ka tiek iegūta un uzturēta spēcīga ERK stimulācija ar ļoti zemām parakvāta koncentrācijām. Fosforilētā PKB līmeņa izmaiņas joprojām nav aprakstītas pēc parakvāta iedarbības. 4. attēlā parādīts, ka rezultāti ir atkarīgi no laika un koncentrācijas, parādot maksimālo efektu pēc 20-min ekspozīcijas ar 25 lM parakvātu. Tas nozīmē, ka agrīnā parakvāta izraisītā PKB fosforilēšanās palielināšanās ir salīdzināma ar ERK1 / 2 novēroto. Šie dati atklāj gan PKB, gan ERK izdzīvošanas ceļu fosforilācijas aktivizēšanas agrīnu palielināšanos. Nav datu par PKB vai ERK agrīnu aktivāciju parakvāta izraisītas šūnu nāves gadījumā. Tomēr iepriekšējie pētījumi (Halvorsen et al., 2002) apraksta līdzīgu agrīnu abu ceļu palielināšanos neiroblastomas SH-SY5Y šūnās, kas pakļautas MPPþ iedarbībai. Šajā gadījumā fosforilācijas līmenis nesamazinās uz bazālo līmeni. Šie dati ir īpaši interesanti sakarā ar iepriekš saistīto līdzīgo struktūru starp parakvātu un MPPþ, kas norāda uz atšķirīgu šūnu mehānismu sākumu, kas saistīts ar abu molekulu iedarbību.

Lielāka uzmanība ir pievērsta JNK1 / 2 ceļa lomai signālu starpniecībā, kas veicina parakvāta izraisītu šūnu nāvi. Šajā pētījumā mēs parādījām, ka zemas parakvāta koncentrācijas (25 lM) izraisīja ievērojamu fosforilētā JNK1/2 pieaugumu (6. att.). Kā tas notiek PKBor ERK1/2, šī aktivizēšana ir atkarīga no laika ar ļoti agru sākumu (5 min) un ar lēnu atgriešanos pie pamata līmeņa. Iepriekšējie darbi (Cheng et al., 2003; Chun et al., 2001; Peng et al., 2004) liecina par vēlu (12–18 h) JNK1/2 ceļa aktivāciju, ko jebkurā gadījumā rada salīdzinoši augsta parakvāta koncentrācija (no 400 lM). [Peng et al., 2004] līdz 800lM [Chunet al., 2001]). Mūsu apstākļos JNK1/2 fosforilācijas pakāpe norādītajos laikos ir salīdzināma ar kontroli. Kopumā šie rezultāti pirmo reizi norāda, ka šūnu pakļaušana ļoti zemai parakvāta koncentrācijai izraisa agrīnu PKB, ERK1/2 un JNK1/2 ceļu aktivāciju.

Noskaidrojot, ka parakvāts izraisa agrīnu PKB, ERK1/2 un JNK1/2 aktivāciju E18 šūnās, mēs pētījām šo proteīnkināzes ceļu lomu parakvāta izraisītā šūnu nāvē, izmantojot vairākus farmakoloģiskus inhibitorus. Šūnu dzīvotspēja tika uzraudzīta, mērot transformāciju uz MTT formazāna krāsā, kas absorbē gaismu pie 570 nm. MTT tests ir izmantots, lai precīzi izmērītu neironu bojājumus pēc dažādiem apvainojumiem, tostarp MPPþ vai parakvāta (Gonzalez Polo et al., 2003, 2004; Schmuck et al., 2002; Sheng et al., 2002; Storch et al., 2004 ), un tā ir visbiežāk izmantotā metode šūnu nāves noteikšanai. Kā parādīts 8. attēlā, pirmapstrāde ar selektīvo JNK1/2 inhibitoru SP 600125 ievērojami samazināja parakvāta izraisīto šūnu nāvi. Šī SP 600125 koncentrācija pilnībā bloķēja parakvāta izraisītu JNK1/2 aktivāciju (7. att.). Šie dati liecina, ka JNK1 / 2 ceļa agrīnas aktivācijas kavēšana aizsargā šūnas no parakvāta izraisītas šūnu nāves. Šie dati saskan ar iepriekšējiem pētījumiem (Chun et al., 2001; Peng et al., 2004), kas ir parādījuši, ka JNK1/2 ir iesaistīts neironu šūnu nāvē, ko izraisa parakvāts. Tomēr šajos pētījumos parakvāta koncentrācija ir no 15 līdz 30 reizēm lielāka nekā šajā pētījumā izmantotā. Mēs arī parādām, ka zemas parakvāta koncentrācijas var izraisīt ne tikai šī ceļa aktivāciju, bet arī agrīnu aktivāciju. Aizsardzība, kas novērota ar SP600125, arī norāda, ka JNK1 / 2 ceļš ir iesaistīts parakvāta izraisītā šūnu nāvē. Turklāt JNK1/2 inhibīcija ir izstrādāta kā potenciāla stratēģija PD ārstēšanā(Parkinsona slimība)vairākos modeļos gan in vivo, gan in vitro (Wang et al., 2004).

cistanche neiroprotektīvais efekts

Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka gan PKB, gan ERK ceļi ir iesaistīti neironu izdzīvošanā (Guyton et al., 1996; Shin et al., 2001). Šajā pētījumā mēs esam parādījuši, ka zemas parakvāta koncentrācijas rada un agri stimulē gan PKB, gan ERK ceļus. Šie novērojumi liecina, ka parakvāta izraisīta PKB un ERK aktivācija var būt iesaistīta šūnu aizsardzībā pret parakvāta izraisītu šūnu nāvi. Lai izpētītu šo iespēju, mēs izmantojām strukturāli nesaistītus PI-3K inhibitorus wortmannin un LY 294002 un ERK1/2 inhibitoru PD.(Parkinsona slimība)98059. Interesanti, ka gan PKB, gan ERK inhibīcija nemainīja šūnu dzīvotspēju parakvāta klātbūtnē, kas liecina, ka mūsu apstākļos palielināta PKB un ERK aktivācija nav būtiska izdzīvošanai parakvāta izraisītas šūnu nāves gadījumā E18 šūnās.

Ir labi zināms, ka parakvāta neirotoksicitātes mehānisms, cita starpā, ir saistīts ar oksidatīvo stresu (Gonzalez-Polo et al., 2004; Mollace et al., 2003). Šajā ziņā nesen tika aprakstīts ļoti ātrs citozola oksidatīvais stress agrīnos apoptotiskos notikumos, kas saistīti ar parakvāta izraisītu šūnu nāvi (Gonzalez-Polo et al., 2004). Tā kā oksidatīvais stress aktivizē MAPK ģimenes locekļus (piemēram, ERK1/2 un JNK1/2) un PKB (Kamata un Hirata, 1999), šo agrīno ERK1/2, JNK1/2 un PKB aktivāciju var saistīt ar ātro oksidatīvo. stresa izraisīts pēc parakvāta ekspozīcijas.

Rezumējot, mūsu rezultāti pirmo reizi parāda, ka zemas parakvāta koncentrācijas stimulē ļoti agrīnu un spēcīgu PKB, ERK1/2 un JNK1/2 fosforilācijas pieaugumu E18 šūnās. Turklāt mēs esam parādījuši, ka JNK1 / 2 ceļa agrīnas aktivācijas kavēšana aizsargā E18 šūnas no parakvāta izraisītas šūnu nāves. Šis rezultāts norāda uz dažu agrīnu notikumu esamību (kā ātra JNK1 / 2 aktivācija), kuriem ir būtiska loma šūnu nāvē, ko izraisa zemas parakvāta koncentrācijas. Šis rezultāts arī paver jaunu un aizraujošu līniju parakvāta toksicitātes izpētē un tās iespējamās ietekmes uz PD attīstību(Parkinsona slimība).

PIEZĪME: Cistancheir tradicionāls ķīniešu augs, kas iedarbojas uz neironiem un smadzeņu šūnām. cistanche ir pazīstams arī kā tuksneša žeņšeņs, tas ir potenciāls līdzeklis neiro slimību ārstēšanai, piemēram,Parkinsona slimībapamatojoties uz mūsdienu farmakoloģisko pētījumu