Daudzi pētījumi ir apstiprinājuši, ka alerģiskas slimības ir ne tikai iedzimtas imūnsistēmas aktivizācijas rezultāts 2

Lūdzu sazinietiesoscar.xiao@wecistanche.comlai iegūtu vairāk informācijas

3. Diskusija

Atopiskā dermatīta (AD) patoģenēze nav pilnībā izprotama, bet slimību izraisa patoloģiska imūnglobulīna E (IgE) imūnreakcija ādas barjeras disfunkcijas gadījumā. Tostarp tuklo šūnas (MC) var izraisīt IgE izraisītas alerģiskas slimības, tostarp AD. Kad tuklo šūnas tiek aktivizētas, tās atbrīvo ar membrānu saistītās citoplazmas daļiņas, kā rezultātā tiek atbrīvotas dažādas molekulas. Šīm molekulām ir svarīga loma AD patoģenēzē un saimniekorganisma aizsardzībā [27]. Tā kā tuklo šūnu aktivācijas vai degranulācijas inhibēšana palīdz regulēt dažādas IgE izraisītas paaugstinātas jutības reakcijas, tuklo šūnas ir viens no ideāliem mērķiem pretalerģisko zāļu izpētē. Mūsu pētījumā tuklo šūnas tiek degranulētas, reaģējot uz savienojumu 48/80 un kalcija jonoforu A23187, un anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Mēs atklājām, ka atsauce efektīvi kavē tuklo šūnu degranulācijas efektu, parādot tās pretalerģisko reakciju. Turklāt intracelulārā kalcija palielināšanās un MAPK aktivācija tika kavēta ar atsauci. Turklāt tika samazināta arī DNCB izraisītā ādas tuklo šūnu infiltrācija un savienojuma 48/80 izraisītā skrāpēšanās. Tāpēc neferīna anti-atopiskā dermatīta mehānismam ir pavairojoša iedarbība uz keratinocītiem un tuklo šūnām.

La patogenia de la dermatitis atópica (DA) no se comprende por completo, pero la enfermedad está mediada por una respuesta inmunitaria anormal de la inmunoglobulina E (IgE) en la disfunción de la barrera cutánea. Entre ellos, los mastocitos (MC) pueden causar enfermedades alérgicas mediadas por IgE, incluida la EA. Cuando los mastocitos se activan, liberan sus partículas citoplásmicas unidas a la membrana, lo que lleva a la liberación de una variedad de moléculas. Estas moléculas juegan un papel importante en la patogénesis de la EA y la defensa del huésped [27]. Debido a que la inhibición de la activación o desgranulación de los mastocitos ayuda a regular varias reacciones de hipersensibilidad mediadas por IgE, los mastocitos son uno de los objetivos ideales para explorar fármacos antialérgicos. En nuestro estudio, los mastocitos se desgranulan en respuesta al compuesto 48/80 y al ionóforo de calcio A23187, y anti-DNP/IgE plus DNP/HSA. Encontramos que la referencia inhibió efectivamente el efecto de desgranulación de los mastocitos, mostrando su reacción antialérgica. Además, el aumento de calcio intracelular y la activación de MAPK fueron inhibidos por reference. Además, también se redujeron la infiltración de mastocitos en la piel causada por DNCB y el comportamiento de rascado causado por el compuesto 48/80. Por lo tanto, el mecanismo de la dermatitis antiatópica de la neferina tiene un efecto multiplicador sobre los queratinocitos y los mastocitos.

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

Audos atrodamo tuklo šūnu citoplazma ir piepildīta ar lielām, blīvām iepriekš izveidotu iekaisuma mediatoru daļiņām[28]. Šo mediatoru atbrīvošanas procesu no sekrēcijas granulām tuklo šūnās sauc par degranulāciju. Tā kā tuklo šūnu degranulācijas inhibēšana var regulēt dažādas IgE izraisītas paaugstinātas jutības reakcijas, tuklo šūnas ir viens no ideāliem mērķiem antialerģisko zāļu izpētei [29, 30]. Mūsu rezultāti liecina, ka atsaucei ir ļoti laba ietekme uz tuklo šūnu degranulāciju neatkarīgi no antigēna, receptoru stimulatora vai jonofora izmantošanas. Tas parāda, ka atsauce ir potenciāls pretalerģijas līdzeklis (2. attēls).

Kā MC aktivācijas indikatorus var izmantot visas iepriekš uzglabātās granulas, tikko sintezētos mediatorus un pat granulas un to sastāvdaļas [31]. Turklāt standarta metode ir intracelulārās Ca4t koncentrācijas mērīšana. Lielākā daļa MC sekrēciju stimulējošu līdzekļu (piemēram, antigēns, savienojums 48/80), kas parasti tika izmantoti laboratorijā, izraisīja intracelulārā Ca2 plus koncentrācijas palielināšanos. Faktiski intracelulārā Ca2 plus koncentrācijas palielināšanās var izraisīt arī MC degranulāciju. Parasti intracelulārā Ca4t palielināšanos izraisa, aktivizējot MC ar tādiem savienojumiem kā tapsigargīns (īpaši bloķē Sarco/endoplazmas Ca2 plus ATPāzi, SERCA) sūkņus un jonoforus (ti, jonomicīnu un A23187) [32,33]. Tāpēc Ca2t atkarīgā MC aktivācijā Ca2t pieplūduma mērīšana tiek uzskatīta arī par metodi MC aktivācijas apstākļu noteikšanai. MC pētījumos Fura{15}} plaši izmanto intracelulāro Ca2 plus izmaiņu noteikšanai. Eksperimentos mēs atklājām, ka aktivēto tuklo šūnu fluorescences intensitāte tika ievērojami nomākta pēc apstrādes ar atsauci (3. attēls). Iepriekšējie ziņojumi norādīja, ka intracelulārās Ca4t koncentrācijas pieaugums bija saskaņā ar histamīna izdalīšanos [34]. Tāpēc mēs secinām, ka atsauces apstrāde kavēs arī histamīna izdalīšanos. Lai apstiprinātu šo hipotēzi, ir nepieciešami turpmāki eksperimenti.

Mastu šūnām ir ievērojami atšķirīgi funkcionālie rezultāti.cistanche dosage redditTie ietver degranulāciju, arahidonskābes prekursoru veidošanos, ķemotaksi un citokīnu veidošanos, un tie visi zināmā mērā ir atkarīgi no kalcija signāliem neatkarīgi no stimulatoriem [32]Aktivētā MC atbrīvo citokīnus, kas ir galvenie alerģiju un iekaisuma slimību mediatori. 35]. Citokīnu ražošana aktivēto tuklo šūnu ietekmē ir citokīnu gēnu transkripcijas indukcijas rezultāts šajās šūnās. Tuklo šūnu stimulēšana izraisa NF-kB un AP-1 aktivāciju un daudzu citokīnu veidošanos [36]. MAPK kaskādes signalizācijas ceļiem ir būtiska loma citokīnu ekspresijas regulēšanā. Šo ceļu aktivizēšana ar PKC aktivāciju ar PI izraisa dažādu gēnu aktivāciju, tostarp iekaisuma citokīnu gēnus, piemēram, IL-1, IL-6 un TNF [37]. Mūsu nesenie pētījumi ir parādījuši, ka atsauce var inhibēt citokīnus, kas izdalās, aktivizējot keratinocītus. Tajā pašā laikā mēs arī atklājām, ka MAPK aktivizēšana tiks kavēta arī atsauces apstrāde [18]. Mūsu pašreizējā pētījumā mēs parādījām, ka atsauce var arī samazināt citokīnu ekspresiju, inhibējot MAPK aktivāciju tuklo šūnās (4. un 5. attēls). NFkB aktivācija ir samazināta arī MAPK aktivācijas inhibīcijas dēļ (6. attēls).

Cistanche var novērst novecošanos

Vairākos pētījumos ir ziņots, ka dažādi citokīni AD pacientiem ir paaugstināti, izraisot ādas barjeras disfunkciju, tostarp citokīni, ko izdala keratinocīti un Th{0}}atvasinātie citokīni [38,39]. Turklāt tiek ziņots, ka šie izdalītie citokīni var arī pazemināt saspringto savienojumu (T]) proteīnu un terminālo diferenciācijas gēnu, tostarp filaggrīna (FLG), loricrin (LOR) un involukrīna (IVL) ekspresiju [39,40 ](Pro)filagrin ekspresija ir samazināta AD gadījumā un ir apgriezti saistīta ar MC triptāzi un IL-6[41]. IL-1 veicina hronisku iekaisumu pelēm ar traucētu ādas barjeru [35]. Iepriekšējā pētījumā tika ziņots, ka FLG, IVL un LOR izpausmes tika samazinātas pēc DNCB uzklāšanas uz NC / Nga peļu muguras ādas [42, 43]. Šajā pētījumā FLG, IVL un LOR izpausmes bija ievērojami samazinātas kontroles grupas muguras ādā, kas norādīja, ka epidermas barjera ir bojāta. Atsauces ievadīšana ievērojami atjaunoja samazinātās FLG, IVL un LOR izpausmes pēc DNCB ārstēšanas, savukārt atsauces ievadīšana nedaudz palielināja IVL un LOR izpausmes salīdzinājumā ar kontroles grupu (8. attēls). Ir zināms, ka savienojums 48/80 ir efektīvs ādas tuklo šūnu aktivators. Ādas reakcija, ko stimulē savienojums 48/80, var izraisīt skrāpējumus, atbrīvojot histamīnu no tuklo šūnām [44]. Histamīnam, kas izdalās no aktivētām tuklo šūnām, ir svarīga loma asinsvadu caurlaidības palielināšanā, ko izraisa savienojums 48/80. Cilvēka niezes laikā tiek ņemts vērā arī histamīns, kas izdalīts no tuklo šūnām ar dažādu stimulu palīdzību. būt par svarīgu starpnieku. Tāpēc tuklo šūnu degranulācijas kavēšana ir svarīgs solis, lai regulētu histamīna izdalīšanos skrāpēšanas laikā. Šajā pētījuma savienojumā 48/80 izraisīja efektīvu ādas tuklo šūnu aktivāciju. Tomēr pirmapstrāde ar atsauci ievērojami samazināja tuklo šūnu degranulācijas līmeni (2. attēls).cistanche ekstrakta priekšrocībasŠie rezultāti liecina, ka atsauces pretskrāpējumu uzvedības efekts var būt saistīts ar asinsvadu caurlaidības samazināšanos, regulējot tuklo šūnu degranulāciju (9. attēls).

Kopumā ir konstatēts, ka AD pacienti cieš no ādas barjeras disfunkcijas, ādas iekaisuma vai abiem, tāpēc ir grūti atrast piemērotas ārstēšanas metodes. Tādēļ parasti ieteicama kombinētā terapija. Mūsu nesenie pētījumi ir pierādījuši, ka tiem nekad nav imūnmodulējošas funkcijas un barjeras labošanas spējas. Tāpēc svarīga atsauces īpašība AD ārstēšanā nākotnē ir ādas funkcijas uzturēšana un ādas mitrināšanas un barjeras atjaunošanas uzlabošana. Atsauce var arī samazināt skrāpējumus, ko izraisa alergēni un kairinātāji. Turklāt atopiskais gājiens ir ar parādību saistīta slimība, kas notiek un progresē soli pa solim. Atopiskais dermatīts bieži tiek novērots zīdaiņa vecumā. Pārtikas alerģija bieži rodas pēc 1-2gadu vecuma. Alerģisks rinīts bieži var sākties pirms un pēc skolas. Astmas simptomi parādās dažādos laikos, bet lielākā daļa no tiem ir pēc alerģiskā rinīta. Pēc bērnības atopiskais dermatīts un noteiktas pārtikas alerģijas var uzlaboties vai izzust. Alerģisko rinītu un astmu nav viegli izārstēt[45,46]. Tāpēc tās ir blakusslimību parādības. Dabiskiem produktiem, tostarp atsaucēm, ir blakusslimību terapeitiskais potenciāls, un to efektivitāti saistīto slimību gadījumā ir vērts pētīt nākotnē.

4. Materiāli un metodes

4.1.Žurku bazofīlās leikēmijas šūnas

Žurku bazofīlās leikēmijas šūnas (RBL-2H3) bija dāvana no TLHwang, Chang Gung University, Taoyuan, Taivāna. RBL-2H3 šūnas ir gļotādas tuklo šūnas, ko izmanto, lai pētītu antigēnu vai kalcija jonoforu izraisītu degranulāciju, intracelulāro Ca4t un signālu pārraidi [29]. Šūnas tika kultivētas EMEM, kas satur 10 procentus FBS, ar penicilīnu un streptomicīnu pie 37 grādiem, 5 procentiem CO2. Iscove modificētā Dulbecco barotne (IM) un liellopu augļa serums (FBS) tika iegādāti no Thermo Fisher Scientific (GIBCOTM, Ņujorka, NY, ASV).

4.2.MTT tests

Mērīšanai izmanto 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazolija bromīda (MTT) testu. šūnu vielmaiņas aktivitāte. RBL-2H3 šūnas tika iesētas 24-iedobes kultūras plāksnē ar 5 × 10 plus/iedobi. Pēc 24 stundu ilgas ārstēšanas ar zālēm tika pievienots 30 μL MTI katrā iedobē un ievietots 37 grādu šūnu inkubatorā uz 2-4 h, pēc tam purpursarkanie formazāna kristāli tika izšķīdināti ar DMSO. ELISA lasītājs tika izmantots, lai izmērītu absorbcijas intensitāti pie viļņa garuma 550 nm kā šūnu dzīvotspējas testu.

4.3. Intracelulārā Ca2 plus līmeņa mērīšana

[Ca2t] Man tika mērīts ar fura-2, kā aprakstīts iepriekš[47].RBL-2H3 šūnas tika atkārtoti suspendētas IMDM, kas satur 5 uM Fura 2-AM un 1,2 mM CaClz 37 grādu temperatūrā. 30 min. Pēc Fura{11}} ielādes keratinocīti tika granulēti un atkārtoti suspendēti svaigā DMEM. Alikvota daļa (2 ml) tika pārnesta uz maisīto kiveti, kas satur 1,2 mM CaClz. Fura-2-Ca fluorescence tika pārbaudīta pie ierosmes viļņa garumiem 340 un 380 nm (emisijas viļņa garums, 505 nm) ar LS{{19Elmer. }} spektrofluorometrs (PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Dati tika reģistrēti ar 5 sekunžu intervālu[47].

4.4. Kvantitatīvā polimēru ķēdes reakcija (qPCR)

RBL{{0}}H3 šūnas tika stādītas 3,5 cm kultivēšanas traukā. Pēc tam, kad šūnas pieauga līdz 90 procentiem, šūnas tika audzētas statiskā stāvoklī 24 stundas. Pēc tam, kad šūnas tika iepriekš apstrādātas ar atsauci 20 minūtes, tās tika stimulētas ar TNF-a / IFN-y attiecīgi 1 vai 24 stundas. Šūnas tika nokasītas, centrifugētas (16,000 × g, 10 min, 4 grādi), un supernatants tika ekstrahēts. RNS tika attīrīta, izmantojot kopējo RNS izolācijas komplektu (GeneDirex@, Vegas, NV, ASV). Saskaņā ar skripta cDNS sintēzes komplekta (BIO-RAD) darbības procedūru reaģenti tika pievienoti kārtībā un darbojās saskaņā ar norādītajiem nosacījumiem, lai pārveidotu RNS par cDNS. Turklāt tika izmantots PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix (Applied BiosystemsTM). Kopā tika pievienoti 7,5 ul ddH20, 2 ul cDNS, 0,25 μLof priekšējie un reversie praimeri un 10 ul SYBR GREEN un vienmērīgi sajaukti. Praimeru sekvences ir parādītas 1. un 2. tabulā. Pēc tam RNS tika kvantitatīvi noteikta, izmantojot ABI StepOnePlusTM reāllaika PCR sistēmu.

4.5. Western Blot tests

Western blotēšana tiek izmantota, lai analizētu dažādu proteīnu izmaiņas šūnās. RBL{{0}}H3 šūnas tika iesētas 3,5 cm kultivēšanas traukā. Pēc tam, kad šūnas pieauga līdz 90 procentiem un bija badā 24 stundas, tās tika iepriekš apstrādātas ar atsauci 20 minūtes un pēc tam stimulētas ar TNF-a vai IFN-y attiecīgi 30 minūtes vai 1 stundu. Pēc nokasīšanas tie tika pulverizēti ar ultraskaņu un centrifugēti (13 200 apgr./min., 10 min, 4 grādi). Pēc centrifugēšanas tika ņemts supernatants un proteīns tika kvantificēts ar Pierce proteīna testa komplektu (Pierce, Rockford, IL, ASV). Tam tika veikta elektroforēze uz 10% SDS-poliakrilamīda gēla un pēc tam elektroporēta ar PVDF membrānu. Pēc pārnešanas pabeigšanas PVDF membrānu ievietoja TBS-T (Tris-buferētais sāls šķīdums/0,05 procenti tween 20) šķīdumā, kas satur 5 procentus vājpiena pulvera, un krata 1 stundu, lai izvairītos no nespecifiskas saistīšanās. Pēc tam TBS-T tika izmantots, lai mazgātu 3 reizes, katru reizi 10 minūtes. Pēc tam tika pievienotas primārās antivielas (atšķaidījums 1:1000) un novietotas 4 grādos uz nakti un pēc tam 3 reizes mazgātas ar TBS-T ik pēc 10 minūtēm. Pēc sekundāro antivielu (atšķaidīta 1:1000) pievienošanas 1 stundu PVDF membrāna tika mazgāta 3 reizes ar TBS-T katru reizi 10 minūtes. Visbeidzot, tika pievienots attīstītājs, un membrāna tika ievietota ķīmiskās luminiscences ekstrakcijas sistēmā (BIOSTEP Celvin) fotografēšanai.

4.6. Dinitrohlorbenzols (2,4-Dinitrohlorben2ēns, DNCB) Atopiskajam dermatītam līdzīgs ādas iekaisums pelēm

Pirmkārt, peles tika sadalītas četrās grupās: kontroles grupa, DNCB grupa (negatīvā grupa), atsauces grupa (3 mg/kg un 10 mg/kg) ar DNCB grupu un deksametazons (0,2 mg/kg) ar DNCB grupu. DNCB grupa (pozitīvā grupa). Deksametazons ir kortikosteroīdu hormons, kas var samazināt pietūkumu un alerģiskas reakcijas. Šajā in vivo eksperimentā gan atsauces, gan deksametazons tika izšķīdināts DMSO, savukārt DNCB tika izšķīdināts 75% etanolā ar ultraskaņas šoku. Pirmo ievadīja ar intraperitoneālu injekciju, bet otrajam 100 ul tika uzklāta uz muguras ādas un 20 μL tika uzlikta labajā ausī. Trīs dienas pirms eksperimenta peles tika anestēzijas un aizmugures apmatojums tika noņemts, un peles aizmugurējās pēdas aizmugurē tika iestrādāts neliels mērīšanas magnēts (SCT-MAG-TF).Cistanče ČingishhansPēc trīs dienu atpūtas tika apstiprināts, ka peles ir labā fiziskajā stāvoklī un āda muguras depilācijas zonā ir normāla, un eksperiments tika sākts. Eksperimenta laikā tika uzņemtas fotogrāfijas, lai fiksētu ādas izskata izmaiņas. Pirmais posms ({{0}} dienas) bija alerģiskā atopiskā dermatīta periods. Pēc pamatvērtību noteikšanas pelēm DNCB grupā, atsauces (3 un 10 mg/kg) un DNCB eksperimentālajā grupā, kā arī deksametazona 0,2 mg/kg un DNCB eksperimentālajā grupā, 1 procents DNCB tika vienmērīgi uzklāts uz muguras ādas un labā auss. Piektajā dienā zāļu atsauce un deksametazons tika injicēti intraperitoneāli. Otrais posms (no 5. līdz 14. dienai) bija atopiskā dermatīta atkārtota ierosināšana.cistanche dzīves pagarināšanaTrīs eksperimentālajās grupās 0,5 procenti DNCB tika vienmērīgi uzsmērēti uz peļu muguras ādas un labās auss. Nākamajā dienā tika uzņemti un reģistrēti ādas fizioloģiskās vērtības un attēli. Pēc tam, kad peles 15. dienā tika eitanāzētas ar pārmērīgu oglekļa dioksīda (CO2) daudzumu, muguras ādas audi tika noņemti turpmākai eksperimentālai analīzei.

4.7. Savienojums 48/80-BALB/c pelēm izraisīta skrāpēšanās

Ādas apmatojums peles aizmugurē tika nogriezts un intrakutāni tika injicēts 20 μL savienojuma 48/80 šķīduma. Tā vietā kontroles peles saņēma sāls šķīduma injekcijas. Uzreiz pēc injekcijas dzīvnieks tika ievietots novērošanas būrī (diametrs 11 cm, MicroAct, Neuroscience, Tokija, Japāna), un peles skrāpēšanas uzvedība tika automātiski un objektīvi noteikta un novērtēta. Skrāpējumu darbība tika mērīta 60 minūtes. MicroAct izmanto šādus analīzes parametrus, lai noteiktu viļņus, kas atbilst peļu nepārtrauktai skrāpējumiem: slieksnis, 0,05 V; notikumu atstarpe,0,05 s; minimālais ilgums,0,25 s; maksimālā frekvence, 30 Hz; minimālā frekvence, 5Hz. 4.8. Statistiskā analīze

Statistiskajai analīzei tika izmantota programmatūra Sigma-Plot (versija 10.0).cistanche nzDati ir izteikti kā vidējais ± SEM, ar (*) un (#) kā piezīmes. Datu statistiskā nozīmība tika analizēta, izmantojot nesapārotus, divpusējus Studenta t-tests.p vērtības, kas ir mazākas par 0.05 un 0,01 tika uzskatītas par nozīmīgiem.

5. Secinājumi

Šajā pētījumā mēs noskaidrojām, ka atsauce efektīvi kavē tuklo šūnu degranulāciju un samazina pro-iekaisuma citokīnu ekspresiju, kas var samazināt atopiskajam dermatītam līdzīgus simptomus, atjaunot ādas barjeru un samazināt ādas skrāpējumus. Mēs arī esam pierādījuši, ka atsauce var ne tikai iedarboties uz ādas keratinocītiem, bet arī ietekmēt tuklo šūnu aktivāciju. Tam ir lielākas pielietošanas iespējas alerģisku un iekaisīgu ādas slimību gadījumā.

Šis raksts ir izvilkts no Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 10994. https://doi.org/10.3390/ijms222010994 https://www.mdpi.com/journal/ijms