Antioksidantu enzīmu, glutationa peroksidāzes, tiola peroksidāzes un katalāzes melanīnu atkrāsojošā darbība

Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Kjončans Džeons¹· Činhans Kims²· Uk Min Cho²· Ee Taek Hwang³· Hyung Seo Hwang⁴· Džiho Min¹

Abstrakts

Melanīns ir vissvarīgākais faktors, kas nosaka ādas krāsu. Tiek veikti daudzi pētījumi, lai skaistuma dēļ sadalītu jau saražotos melanīna savienojumus ādā. Šajā pētījumā tika pētīta trīs antioksidantu enzīmu, glutationa peroksidāzes (GPX), tiola peroksidāzes (TPX) un katalāzes, ietekme uz melanīna krāsas samazināšanos lizosomu frakcijā. Melanīna šķīdumu apstrādāja ar fermentiem un ūdeņraža peroksīdu, pēc tam reaģēja 48 stundas. GPX un TPX atkrāsoja melanīnu, un starp tiem GPX bija efektīvāks, bet katalāze nebija efektīva. GPX arī kavēja melanīna veidošanos B16F10 melanomas šūnās. GPX, kas atrodas gandrīz visos mikroorganismos, ir svarīga loma šūnu aizsardzības mehānismā ar reaktīvām skābekļa sugām. Turklāt tas nebija citotoksisks, bet bija ievērojami efektīvs melanīna krāsas atkrāsošanā. Tāpēc bioloģiskajā un mikrobioloģiskajā jomā tā izmantošanas iespēja ādas balināšanas kosmētikā ir augsta.

Atslēgas vārdi Melanīns · Glutationa peroksidāze (GPX) · Tiola peroksidāze (TPX) · Katalāze · B16F10 · Lizosoma

Cistanche ir ādu balinoša sastāvdaļa.

Ievads

Tīra seja ir viens no būtiskākajiem skaistuma elementiem mūsdienu cilvēkiem, īpaši aziāti ir sajūsmā par baltu ādu. Melanīna savienojums ir vissvarīgākais faktors, kas nosaka ādas krāsu. Tas atšķiras no eumelanīna ar melnu vai brūnu krāsu un feomelanīnu, kas rada rozā līdz sarkanu nokrāsu [1]. Melanīna savienojums tiek sintezēts tirozīna oksidācijas rezultātā melanocītu šūnās, kas atrodas epidermas bazālajā slānī; un šī pigmenta galvenā loma ādā ir aizsargāt dermu, bloķējot kaitīgo ultravioleto starojumu [2, 3]. Tomēr, ja ādā ir pārāk daudz melanīna savienojumu, tas padara ādu tumšu un netīru, kā arī var izraisīt hiperpigmentāciju, piemēram, melasmu [4].

Ir veikti daudzi pētījumi saistībā ar ādas kopšanas kosmētiku, kas atrisina šīs problēmas, taču lielākajai daļai pašlaik izstrādāto ādu balinošo kosmētikas līdzekļu ir funkcija, kas kavē melanīna sintēzi, izmantojot vairākus mehānismus, piemēram, bloķējot tirozīna oksidāciju vai UV starus, kas var veicināt. melanīna sintēze [5]. Lai šie produkti būtu efektīvi, ir nepieciešams ilgs laiks, un tie nav efektīvi specifiskiem simptomiem, piemēram, hiperpigmentācijai [6]. Pašlaik tipiska jau izgatavota melanīna noņemšanas metode ir lāzerterapija [7]. Ja tiks izstrādāti materiāli, kas var atrisināt šīs problēmas bez šādām procedūrām, tie būs ļoti noderīgi bioloģijas un kosmētikas jomā.

Iepriekšējos pētījumos mēs mēģinājām atrast veidu, kā atkrāsot jau saražotos melanīna savienojumus. Ir bijuši pētījumu ziņojumi par lizosomu un melanīna korelāciju. Ļoti iespējams, ka diferencēti keratinocīti īpaši noārda ārējās melanosomas atbilstoši autofagijas pamatfunkcijām, kas kontrolē šūnu organellu daudzumu, vai noņem bojātos organellus, piemēram, peroksisomu [8]. Autofagiskais ceļš no citoplazmas līdz lizosomām spēlē nozīmīgu lomu melanosomu degradācijā cilvēka epidermalkeratinocītos [9]. Šie dati liecina, ka lizosomu specifiskie enzīmi veicina melanīna noārdīšanos. Iepriekš mēs konstatējām enzīma melanīna krāsas samazināšanas aktivitāti lizosomu frakcijā, kompleksā, kas satur hidrolizātus, lai sadalītu atkritumu materiālus un šūnu atliekas peroksisomās un lizosomās [10, 11]. Šajā dokumentā tika pētīta trīs atlasīto enzīmu, glutationa peroksidāzes, tiola peroksidāzes, katalāzes, ietekme lizosomu frakcijā, lai samazinātu melanīna krāsu. Šīs peroksidāzes aizsargā pret šūnu bojājumiem, ko izraisa reaktīvās skābekļa sugas (ROS), un tās atrodas visos eikariotos [12].

Reaktīvās skābekļa sugas (ROS) veidojas kā dabisks blakusprodukts normālam skābekļa metabolismam šūnās, un tās var palielināt vides stresa dēļ. Ļoti ģenerēta ROS var bojāt šūnas. ROS kaitīgā ietekme uz šūnu ir šāda [12, 13]: DNS vai RNS bojājums, polinepiesātināto taukskābju oksidēšanās lipīdos, aminoskābju oksidēšanās olbaltumvielās un specifisku enzīmu oksidatīvā dezaktivācija, oksidējot kofaktorus. Šūnas neitralizē. ROS ar antioksidācijas sistēmu, lai novērstu šādus audu bojājumus. Šajā sistēmā metabolisma radītais superoksīda anjons ir ļoti postošs; lai gan superoksīda dismutāze (SOD) to pārvērš ūdeņraža peroksīdā, ūdeņraža peroksīds joprojām ir reaktīvs. Katalāze ūdeņraža peroksīdu pārveido par H2O un patērē glutationisulfīda (GSSG) ražošanā no glutationa, izmantojot GPX katalīzi. TPX darbojas līdzīgi kā GPX [13].

Šajā pētījumā tika pētīta trīs antioksidantu enzīmu, GPX, TPX un katalāzes, melanīna atkrāsošanas efekts. Tā rezultātā GPX un TPX efektīvi samazināja melanīna krāsu. Starp tiem GPX nebija citotoksicitātes pie optimālās melanīna atkrāsošanas aktivitātes koncentrācijas, un tas efektīvi inhibēja melanīna sintēzi. Tāpēc tas sniedz pierādījumus, ka GPX spēlē nozīmīgu lomu lizosomu frakcijas melanīna atkrāsošanas mehānismā, ne tikai antioksidantu aktivitātē, un piedāvā jauna balinoša kosmētikas līdzekļa potenciālu kā vienotu enzīmu.

Materiāli un metodes

Peroksidāzes un peroksidāzes aktivitātes tests

Trīs peroksidāžu (glutationa peroksidāzes, tiola peroksidāzes un katalāzes) koncentrācija tika noteikta ar testa komplektu (Peroxidase assay kit, D2PD-100, QuantiChromTM), kas iegādāts no Bioassay Systems. Glutationa peroksidāze 2 (GPX2, NBP1-78,824, Novus) un tiola peroksidāze (TPX,NBP1-78,805, Novus) tika iegādātas no Novus un Catalase (9001-05-2, Sigma-Aldrich). ) tika iegādāts no Sigma-Aldrich.

Šajā testa komplektā tiek izmantots H2O2 un elektronu donora krāsviela, kas peroksidāzes laikā veido resorufīnu. Pārbaude tika veikta istabas temperatūrā (RT), un krāsas intensitāte tika mērīta pie 570 nm. Peroksidāzes tika reaģētas ar elektronu donoru krāsvielu ar 0, 6% ūdeņraža peroksīdu 10 minūtes RT. Pēc reakcijas tika pievienots apturēšanas reaģents, un parauga absorbcija tika mērīta ar mikroplates spektrofotometriju. Aktivitāte tika aprēķināta šādi:

Peroksidāzes aktivitāte=RSAMPLE −RBLANK × [Resorufin](𝜇M) × Reakcijas tilpums(𝜇L)RRESORUFIN −RH2 O t(min) Parauga tilpums(𝜇L)

(U/L). Viena vienība (U) fermenta katalizēs 1 μmol resorufīna veidošanos minūtē testa apstākļos. Šeit RSAMPLE, RBLANK, RRESORUFIN un RH2O ir attiecīgi parauga, parauga tukšā parauga, resorufīna un ūdens absorbcija; un n ir parauga atšķaidīšanas koeficients. [Resorufin] šim testam ir 50 μM. Reakcijas tilpums ir 100 μL, un parauga tilpums šajā pētījumā ir 10 μL.

Melanīna atkrāsošana ar glutationa peroksidāzes (GPX), tiola peroksidāzes (TPX) un katalāzes palīdzību

Melanīna šķīdums satur {{0}},1 mM PBS (fosfātu buferšķīdums, pH: 7,0) un melanīna pulveri (Synthetic, Sigma), kas iegūts, oksidējot tirozīnu ar ūdeņraža peroksīdu. Melanīna saturs tika mērīts ar absorbciju pie 450 nm. Lai noteiktu melanīna koncentrāciju, no autentiskā sintētiskā melanīna standarta (R2=0.999, dati nav parādīti) tika sagatavota standarta līkne.

Lai pārbaudītu melanīna krāsas samazināšanos, 100 ppm melanīna šķīdums, kas satur (50 līdz 1000) μU/L peroksidāzes (GPX, TPX, katalāze) ar 1 mM ūdeņraža peroksīdu, tika reaģēts RT un mērīts katru dienu. Melanīna atkrāsošanās vērtība tika noteikta, no sākotnējās vērtības atņemot melanīna koncentrāciju pēc reakcijas.

Cistanche kavē melanīna sintēzi.

Šūnu kultūra

B16F10 peļu melanomas šūnas (KCLB 80008) tika iegādātas no Korean Cell Line Bank (KCLB, Seula, Koreja). Šūnas tika kultivētas Dulbecco modificētajā ērgļa barotnē (DMEM), kas satur 4500 mg/l glikozes, 4 mM l-glutamīna, 1 mM nātrija piruvāta, kam tika pievienoti 10 procenti liellopu augļa seruma (FBS), 20 mM HEPES, 1 procents penicilīna, un šūnas tika inkubētas mitros apstākļos, kas satur 5 procentus CO2 37 grādu temperatūrā. Barotne tika apmainīta ik pēc 2 dienām (d), un šūnas tika novāktas, izmantojot tripsīna / EDTA šķīdumu.

Šūnu dzīvotspējas tests (MTT tests)

Glutationa peroksidāzes toksiskā iedarbība uz B16F10 melanomas šūnām tika apstiprināta ar MTT testu — vispārīgu metodi, ko izmanto, lai noteiktu parauga ietekmi uz pielipušās šūnas dzīvotspēju. Šajā testā izmanto 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīdu (MTT), ko mitohondriāli var reducēt par formazānu. enzīms dzīvotspējīgās šūnās. 3 × 103 šūnas tika iesētas katrā iedobē 96-iedobes plāksnē un inkubētas 24 stundas. Tad katrai iedobei pievienoja paraugu un inkubēja 72 stundas. Pēc tam barotne tika nomainīta uz tādu, kas satur 0, 5 mg / ml MTT, un inkubēta 2 stundas. Pēc tam tika noņemts MTT krāsvielu reaģents, un radītais formazāns tika izšķīdināts ar DMSO 30 minūtes. Visbeidzot, formazāna koncentrācijas tika mērītas pie 570 nm, izmantojot mikroplates spektrofotometriju. Šūnu dzīvotspēja tika aprēķināta šādi: šūnu dzīvotspēja (procenti)=(Paraugs – tukšais)/(Akontrole – tukšais)*100.

cistanche hindi valodā

Melanīna satura noteikšana

3 × 105 B16F10 šūnas tika iesētas katrā iedobē 6-iedobes plāksnē un inkubētas 24 stundas, lai tās pieliptu. Katras iedobes barotne tika apmainīta ar tādu, kas satur dažādu enzīmu koncentrāciju un 10 nM -MSH, pēc tam inkubēja 72 stundas. Pēc tam visas iedobes nomazgāja ar DPBS buferšķīdumu un savāca, izmantojot 0, 5% tripsīna/EDTA šķīdumu. Centrifugējot iegūtās šūnu granulas tika lizētas ar 200 μL 1 N NaOH, kas satur 10 procentus DMSO, 1 stundu 80 grādu temperatūrā. Visbeidzot, lizētā melanīna saturs tika mērīts ar absorbciju pie 450 nm. Fermenta melanīna ražošanas inhibīcijas efektivitāte tika noteikta, salīdzinot ar pozitīvo kontroli, izmantojot 100 mg/ml arbutīna.

Rezultāti

Glutationa peroksidāzes (GPX), tiola peroksidāzes (TPX) un katalāzes peroksidāzes aktivitāte

Šis pētījums ir paplašināts pētījums par lizosomu frakciju apstrādes pielietojumu melanīna savienojumu atkrāsošanai in vitro un in vivo. Iepriekšējā pētījumā mēs atklājām, ka lizosomu frakcija, kas izolēta no Hela šūnām, S. cerevisiae, vistas olām, samazina melanīna krāsu unmelanīna atkrāsošanas efektivitāte bija saistīta ar lizosomu frakcijas, kas nav saistīta ar membrānu, peroksidāzes aktivitāti, ieskaitot lizosomas un peroksisomas. Lai apstiprinātu peroksidāžu melanīna krāsu samazināšanas efektu, tika atlasītas trīs peroksidāzes: glutationa peroksidāze (GPX), tiola peroksidāze (TPX) un katalāze. Šiem fermentiem ir svarīga loma oksidatīvā stresa mazināšanā, ko izraisa reaktīvās skābekļa sugas šūnās [14].

Šo enzīmu aktivitāte tika noteikta ar testa komplektu (Peroxidase assay kit, D2PD-100, QuantiChrom™). Šīs metodes pamatā bija elektronu donoru krāsas oksidēšana, kas peroksidāzes reakcijas laikā veido rozā krāsu [15]. Peroksidāzes aktivitāte tika izteikta, izmantojot šādas vienības: 1 vienība=1 U=1 µmol resorufīna veidošanās minūtē testa apstākļos. 1. tabulā ir apkopota trīs peroksidāžu, GPX, TPX un katalāzes, aktivitāte un koncentrācija.

Glutationa peroksidāzes (GPX), tiola peroksidāzes (TPX) un katalāzes melanīna atkrāsošanas aktivitāte

Lai apstiprinātu peroksidāžu melanīna atkrāsošanas efektu, 100 ppm melanīna šķīdums tika apstrādāts ar 1 mM ūdeņraža peroksīdu un katras peroksidāzes koncentrāciju (50 līdz 1000) µU/L. Paraugi tika reaģēti 2 dienas RT, pēc tam salīdzināti ar sākotnējo koncentrāciju. 1. attēlā parādīts melanīna samazinājums pēc 48 stundām. 1. attēlā parādīti pierādījumi tam, ka TPX un GPX ir melanīna atkrāsošanas aktivitāte. Katalāze neietekmēja melanīna krāsas samazināšanos (1.a attēls). TPX bija efektīvs melanīna savienojumu atkrāsošanā, un efektivitāte bija vislabākā, ja to apstrādāja ar koncentrāciju 1 µU/mL (1.b attēls). GPX bija arī melanīna krāsas samazināšanas aktivitāte, kas bija vislabākā koncentrācijā 0,2 µU/mL, un pakāpeniski samazinājās pie augstākām koncentrācijām (1.c att.). Šī vērtība ir par 175 procentiem uzlabota melanīna krāsas samazināšanās, salīdzinot ar kontroli, kas apstrādāta tikai ar ūdeņraža peroksīdu. GPX bija efektīvāks koncentrācijas un peroksidāzes aktivitātes ziņā, salīdzinot ar TPX. 0,2 µU/mL GPX un 1 mM ūdeņraža peroksīda apstrāde līdzmelanīna šķīdums atkrāsoja 13 procentus no 100 ppm melanīna 4 dienas (att.2). Tomēr ne GPX, ne TPX neuzrādīja nekādu krāsu samazināšanas efektu, ja nebija ūdeņraža peroksīda (dati nav parādīti).

1. tabula Specifiski dati par fermentiem, glutationa peroksidāzi 2, tiola peroksidāzi un katalāzi

Glutationa peroksidāzes (GPX) un H2O2 ietekme uz B16F10 šūnu dzīvotspēju

GPX ietekme uz B16F10 melanomas šūnu dzīvotspēju tika apstiprināta ar MTT testu pirms melanīna sintēzes inhibīcijas testa. Lai atrastu pareizo ūdeņraža peroksīda koncentrāciju ārstēšanai, citotoksicitāte tika novērtēta, apstrādājot ar ūdeņraža peroksīdu 72 stundas dažādās koncentrācijās. Koncentrācijā 0,1 mM H2O2 nebija šūnu toksicitātes šūnām 72 stundas, savukārt koncentrācijā virs 1 mM tika novērota liela toksicitāte. (3.a att.). Pēc tam GPX ietekme uz šūnu izdzīvošanu tika novērtēta 0,1 mM ūdeņraža peroksīda klātbūtnē, kas nebija citotoksisks. GPX nebija citotoksicitātes pret B16F10 šūnām zem koncentrācijas 0,5 μU/mL, kas bija efektīva melanīna atkrāsošanas pētījumos (3.b attēls).

1. attRelatīvā melanīna krāsas samazināšanās salīdzinājumā ar apstrādi tikai ar ūdeņraža peroksīdu.

Glutationa peroksidāzes (GPX) un H2O2 ietekme uz melanīna sintēzi B16F10 melanomas šūnās

Mēs pētījām GPX, kas bija visefektīvākā melanīna atkrāsošanā, ietekmi uz melanīna sintēzi melanocītos. 4. attēlā parādīts melanīna saturs B16F10melanomas šūnās, kas apstrādātas ar katru paraugu 72 stundas. Ārstēšana ar 0,05 μU/mL GPX un 0,1 mM H2O2 izraisīja vislielāko melanoģenēzes inhibīciju par 43 procentiem, salīdzinot ar kontroli (tikai apstrāde ar -MSH). Tas bija par 153 procentiem augstāks nekā pozitīvā kontrole (ārstēšana ar Arbutīnu un -MSH) un par 22 procentiem augstāka nekā ūdeņraža peroksīds bez enzīma, savukārt GPX ārstēšana neuzrādīja dramatisku melanīna samazināšanos bez ūdeņraža peroksīda, un arī atbalsta šo viedokli. (dati nav parādīti). Rezultātā GPX inhibēja melanīna savienojumu veidošanos, bet GPX ūdeņraža peroksidetāns vairāk ietekmēja melanīna sintēzi šūnās.

Diskusija

Šajā pētījumā mūsu pētnieki atklāja optimālo koncentrāciju un GPX, TPX un katalāzes, antioksidantu enzīmu, kas samazina oksidatīvo stresu šūnās, koncentrāciju un ietekmi uz melanīna savienojumu atkrāsošanu. Āršūnu eksperimentu rezultātā, izmantojot sintezētus melanīna savienojumus, GPX un TPX ir melanīnu atkrāsojoša iedarbība, bet Catalasedoes ne. Ir ziņojumi, ka dažu sēņu lignīnu noārdošie enzīmi, piemēram, lakāze, lignīna peroksidāze, var noārdīt melanīnu ūdeņraža peroksīda klātbūtnē [16–18]. Šajā pētījumā tika apstiprināts, ka antioksidantu enzīmi, kas ir visos eikariotos un nav lignīnu noārdošie enzīmi, tiem piemīt melanīnu atkrāsojoša iedarbība. Lai gan GPX un TPX var arī samazināt melanīna krāsu ūdeņraža peroksīda klātbūtnē, šiem fermentiem ir iespēja darboties kā lizosomu frakcijas melanīna atkrāsošanas mehānisma galvenā sastāvdaļa.

GPX, kas bija visefektīvākais, lai samazinātu melanīna krāsu in vitro, tika apstrādāts ar B16F10 melanomas šūnām, lai noteiktu tā ietekmi uz melanīna sintēzi. B16F10 melanomas šūnās GPX nebija citotoksisks koncentrācijās, kas bija efektīvas melanīna savienojumu atkrāsošanā, un kopā apstrādātā ūdeņraža peroksīda koncentrācija bija 0, 1 mM, bez toksicitātes. Ūdeņraža peroksīda apstrāde ievērojami kavēja melanīna sintēzi, un, strādājot ar GPX, efektivitāte bija labāka, bet nebija zāļu koncentrācijas atkarības. Tā kā ūdeņraža peroksīdu ātri patērē fermenti, var interpretēt, ka jo augstāka ir apstrādājamā enzīma koncentrācija, jo mazāka ir melanīna sintēzes inhibīcija ar ūdeņraža peroksīdu. Šo viedokli apstiprina arī fakts, ka GPX apstrāde neuzrādīja dramatisku melanīna samazināšanos, ja nebija ūdeņraža peroksīda (dati nav parādīti). Rezultātā GPX inhibēja melanīna savienojumu veidošanos, bet GPX ūdeņraža peroksidetāns vairāk ietekmēja melanīna sintēzi šūnās. Šie rezultāti liecina, ka antioksidantu enzīmi inducē melanīna noārdīšanos autofagijas mehānismos, kas sagremo melanosomas.

cistanche tabletes

Lai iegūtu plašāku informāciju, lūdzu, noklikšķiniet šeit.

Secinājums

Mūsu pētījums parāda, ka glutationa peroksidāze (GPX) un tiola peroksidāze (TPX) veicina melanīna atkrāsošanos, un GPX efektīvi kavē melanīna sintēzi. Rezultāti apstiprina hipotēzi, ka antioksidantu enzīmi inducē melanīna noārdīšanos autofagijas mehānismos, kas sagremo melanosomas. Lai nonāktu pie konkrēta secinājuma, var būt nepieciešams pētījums par melanosomu gremošanas mehānismu ādas šūnās, keratinocītos un melanocītos.