Cilvēka nieru slimību zebrafish modeļu izveides un novērtēšanas metodes 1. daļa

KOPSAVILKUMS

Ar nierēm saistīti traucējumi skar miljoniem cilvēku visā pasaulē. Hroniskas nieru slimības (HNS) pacientu aptauja parādīja, ka nieru slimību slogs ar katru gadu palielinās. 2017. gadā veiktajā globālajā slimību sloga (GBD) pētījumā HNS ir 12. galvenais nāves cēlonis visā pasaulē. Tāpēc ļoti svarīga ir nieru slimību cēloņu noteikšana, precīzu diagnostikas metožu izstrāde un jaunas terapijas metodes. Modeļa organismiem, kas patiesi apkopo cilvēku slimības, ir svarīga loma slimības procesa izpratnē un tie nodrošina vērtīgu augsni, lai atrastu to ārstēšanu. Zebrafish ir lielisks modelis, lai pētītu cilvēka nieru slimību attīstību, patofizioloģiju un molekulāros aspektus. Šajā pārskatā mēs apkopojam dažādas ģenētiskas un eksperimentālas manipulācijas, ko var veikt zebrafish, lai labāk izprastu cilvēka nieru slimību patofizioloģiju. Mēs iesakām, ka šīs metodes palīdzēs izstrādāt potenciālu terapiju nieru slimību ārstēšanai.

Saskaņā ar attiecīgiem pētījumiem,cistancheir tradicionāls ķīniešu augs, ko gadsimtiem ilgi izmanto dažādu slimību ārstēšanai. Ir zinātniski pierādīts, ka tai piemīt pretiekaisuma, pretnovecošanās un antioksidanta īpašības. Pētījumi liecina, ka cistanche ir labvēlīga pacientiem, kuri cieš no nieru slimībām. Ir zināms, ka cistanche aktīvās sastāvdaļas mazina iekaisumu, uzlabo nieru darbību un atjauno bojātas nieru šūnas. Tādējādi cistanche integrēšana nieru slimību ārstēšanas plānā var sniegt lielu labumu pacientiem, pārvaldot viņu stāvokli. Cistanche palīdz samazināt proteīnūriju, pazemina BUN un kreatinīna līmeni un samazina turpmāku nieru bojājumu risku. Turklāt cistanche arī palīdz samazināt holesterīna un triglicerīdu līmeni, kas var būt bīstams pacientiem, kuri cieš nonieru slimība.

Noklikšķiniet uz Cistanche Norge

Vairāk informācijas:

Deivids.deng

@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

ATSLĒGVĀRDI:CKD, AKI, cilvēka nieru slimību zebrafish modelis, pronefross, nieru patoloģija

Ievads

Nieres ir viens no svarīgākajiem orgāniem mugurkaulniekiem, kas izvada atkritumus un uztur pH, jonu un metabolītu koncentrāciju asinīs fizioloģiskā diapazonā. Nieres izdala eritropoetīnu, kas regulē sarkano asins šūnu veidošanos un aktivizē D vitamīnu, kas palīdz kauliem absorbēt kalciju. Katrā cilvēka nierē ir aptuveni miljons nefronu, kas ir šī orgāna strukturālās un funkcionālās vienības. Līdz ar to nefronu defekti ietekmē nieru struktūru un funkcijas. Nieru darbības traucējumi var rasties ģenētisku mutāciju, infekciju, traumu, zāļu vai toksisku savienojumu iedarbības dēļ vidē. Hroniskas slimības, piemēram, diabēts, sirds un asinsvadu slimības un hipertensija, ir galvenais nieru slimību sloga veicinātājs (Levey et al., 2010). Nieru darbības traucējumi palielina komplikāciju risku arī citās orgānu sistēmās (Thomas et al., 2008). Biežākie nieru slimību veidi un to cēloņi ir parādīti 1. tabulā.

Nieru slimības

Nieru slimības rada ievērojamu daļu no slimību sloga visā pasaulē. Aptuveni 750 miljonus cilvēku visā pasaulē ietekmē ar nierēm saistīti traucējumi (Crews et al., 2019). HNS ir visizplatītākā starp tiem ar globālo izplatību 13,4 procenti (Hill et al., 2016). GBD 2010. gada pētījumā HNS ir 18. lielākais nāves cēlonis visā pasaulē, kas līdz 2017. gadam bija palielinājies līdz 12. vietai, jo izraisīja maksimālo nāves gadījumu skaitu pasaulē (Jha et al., 2013; Carney, 2020). Saskaņā ar GBD pētījumu 2017. gadā visā pasaulē tika ziņots par aptuveni 697,5 miljoniem HNS gadījumu, no kuriem 1,2 miljoni cilvēku nomira. Tiek lēsts, ka nāves gadījumu skaits HNS dēļ sliktākajā gadījumā līdz 2040. gadam pieaugs līdz 4 miljoniem (Foreman et al., 2018). Viena trešdaļa HNS pacientu dzīvo divās valstīs, Ķīnā un Indijā (Bikbov et al., 2020). CKD statuss Indijas iedzīvotāju vidū ir neskaidrs, jo trūkst precīzu datu vākšanas sistēmu. Indijā 2017. gadā tika ziņots par aptuveni 115 miljoniem HNS gadījumu (Bikbov et al., 2020). Indijas populācijā visizplatītākās slimības ir diabēts un hipertensija (Geldsetzer et al., 2018). Saskaņā ar Indijas Medicīnas pētījumu padomes (ICMR) ziņojumu cukura diabēta un hipertensijas izplatība pieaugušo pilsētu iedzīvotāju vidū ir attiecīgi 28 procenti un 21,4 procenti (Varma, 2015). No 40 procentiem līdz 60 procentiem HNS gadījumu rodas šīs komplikācijas, un to skaits strauji pieaug (Rajapurkar et al., 2012). Starptautiskās nefroloģijas biedrības nieru slimību datu centrs ziņoja par CDK izplatību Indijas iedzīvotāju vidū par 16,8 procentiem (Ene-Iordache et al., 2016). CKD cēloņi Indijā atšķiras. Andhra Pradesh, Odisha un Goa ziņoja par augstu nezināmas etioloģijas CKD līmeni, kas pazīstams kā hroniska intersticiāla nefropātija (Varughese un Abraham, 2018). Tā kā HNS pacientu skaits visā pasaulē pieaug satraucošā ātrumā, ir steidzami jāveic rūpīga parasto nieru slimību pamatcēloņu analīze, lai atrastu labākus veidus to profilaksei un ārstēšanai. Modeļu organismi, kas var atdarināt cilvēka fizioloģiju un slimos apstākļus, var nodrošināt lieliskus veidus iepriekš minēto problēmu risināšanai. Zebrafish ir kļuvuši par noderīgu modeli attīstības un slimību izpētei un sniedz daudzsološus veidus, kā noteikt jaunus terapeitiskos mērķus un zāles. Šajā pārskatā mēs esam apsprieduši dažādas metodes, lai apkopotu cilvēka nieru slimības zebrafish un kā šos modeļus var izmantot, lai izprastu slimības patogenitāti un tās pamatā esošos molekulāros mehānismus. Tā rezultātā var tikt radītas jaunas terapeitiskās pieejas nieru slimību ārstēšanai un ārstēšanai.

Līdzības starp cilvēka un zebrazivs nierēm

Nieru attīstība zīdītājiem ir unikāla, jo embrioģenēzes laikā tā notiek trīs atšķirīgās struktūrās: pronefrosā, mezonefrosā un metanefrosā. Pirmās divas struktūras ir pārejošas zīdītājiem, un tikai metanefros saglabājas visu mūžu (Smyth et al., 2017; Jain, 2014). Pronefross ir funkcionāla niere embrionālās attīstības laikā zemākiem mugurkaulniekiem, piemēram, abiniekiem un zivīm, ko vēlākos posmos aizstāj ar mezonefrosu kā funkcionālu nieri (Tahara et al., 1993; Diep et al., 2015). 2. tabulā ir aprakstīts dažādu nieru formu laika ilgums cilvēkiem, pelēm, Xenopus un zebrafish.

Lai gan kopējā nieru sarežģītība palielinās, virzoties uz augstākajām formām, nefroni ir visu veidu nieru strukturālās un funkcionālās vienības. Katram nefronam ir trīs daļas: nieres korpuss, lai filtrētu asinis, kanāliņos, lai absorbētu un izdalītu izšķīdušās vielas, un savākšanas kanāls, lai savāktu nevēlamus atkritumus izvadīšanai. Cauruļveida epitēlijs ir veidots dažādos segmentos, lai veiktu noteiktas funkcijas. Visu veidu nieru nefroniem ir līdzīgs segmentācijas modelis (Desgrange un Cereghini, 2015). Zebrafish pronephros un mezonefrosa nefrona segmentālā organizācija ir līdzīga zīdītāju metanefrosam, kā parādīts 1. attēlā. Zebrafish pronephros kanāliņos ir sadalīts proksimālā vītņotā kanāliņā (PCT), proksimālā taisnā kanāliņā (PST) un distālā agrīnā (DE) ) un distālās vēlīnās (DL) kanāliņos, kas ir analogas zīdītāju metanefrisko nefronu segmentācijas modelim. Zebrazivīm ir endokrīnais dziedzeris, ko sauc par Stanniusa (CS) asinsķermenīšiem, kas uztur kalcija homeostāzi (Krishnamurthy, 1976). CS veidojas nieru epitēlija šūnu transdiferenciācijā starp DE un DL segmentiem, kas pakāpeniski atdalās no kanāliņiem un veido pārī savienotu CS dziedzeru, kas atrodas retroperitoneāli pie nieres virsmas pieaugušām zivīm (Roberts un Ellis, 2012; Naylor et al., 2018). Viena no galvenajām atšķirībām starp zebrazi un zīdītāju nefroniem ir Henles cilpas trūkums zebrazivī, kas darbojas kā pretstrāvas reizinātājs, lai radītu medulāro osmotisko gradientu ūdens saglabāšanai. Šis segments nav noderīgs zebrazivīm, jo ​​tā ir saldūdens zivs (Elmonem et al., 2018). Katram segmentam ir atšķirīgi šūnu tipi un segmentam specifiskas gēnu ekspresijas, kas ir saglabājušās mugurkaulnieku vidū (Verlander, 1998; Desgrange un Cereghini, 2015). Visiem nieru tipiem ir līdzīgi attīstības ceļi. Sekojošie četri posmi ir secīgi iesaistīti nefronu attīstībā; A: starpposma mezodermas indukcija, veidojot nieru primordium, B: nefriskā kanāla epitelizācija un augšana, C: nefrona veidošanās specializētos segmentos un D: nefrona vaskularizācija asins filtrēšanai (Drummond, 2003).

Metodes, lai radītu zebrafish modeļus cilvēka nieru slimībām

Zebrazivīm ir viens pronefrosu pāris, kas sāk veidoties 12 stundas pēc apaugļošanas (hpf) un kļūst pilnībā funkcionāls par 48 ZS. Visa genoma sekvences pieejamība, 71 procents cilvēka gēnu ar vismaz vienu zebrafish ortologu, ērta apstrāde, caurspīdīgi embriji, īss ģenerēšanas laiks, efektīvas gēnu manipulācijas metodes, metodes transgēnu zivju ģenerēšanai un to ātra skrīnings padara zebrafish par vispiemērotāko paraugorganismu. pētīt nieru anomālijas (Howe et al., 2013; Poureetezadi un Wingert, 2016). Viena no būtiskākajām pieaugušu zebrazivju iezīmēm ir tās spēja reģenerēt jaunus nefronus neo-nefroģenēzes procesā, reaģējot uz nieru bojājumiem (Chambers and Wingert, 2016). 3. tabulā ir aprakstīti zebrafish un citu izplatītu modeļu organismu, piemēram, peles un Xenopus, salīdzinājumi. Ģenētiskās manipulācijas ar zebrazi ir parādījušas, ka, izmantojot šo paraugorganismu, var identificēt jaunos nieru attīstības un funkciju ģenētiskos komponentus (Poureetezadi un Wingert, 2016). Ir vairākas metodes, lai radītu cilvēka nieru slimību zebrafish modeļus.

Uz priekšu ģenētika

Pārejas ģenētikas ekrāns tiek izmantots, lai identificētu gēnus, kas saistīti ar interesējošiem fenotipiem (Lawson and Wolfe, 2011). Gan ķīmiskā, gan ievietošanas mutaģenēze tiek izmantota priekšējās ģenētikas ekrānos (Patton un Zon, 2001). Ķīmiskā mutaģenēze ir trīs paaudžu skrīnings, kurā pieauguši vīrieši tiek apstrādāti ar ķīmiskiem mutagēniem, piemēram, etilmetāna sulfonātu (EMS), etilnitrozourīnvielu (ENU) vai fizikāliem mutagēniem, piemēram, gamma starojumu, lai radītu vairākas mutācijas dzimumšūnās (Varšnijs un Burgess, 2014). Zivis, kurām ir mutācijas, tiek krustotas ar savvaļas tipa mātītēm, lai iegūtu F1 zivis, kas satur unikālas radītās mutācijas alēles. F1 zivis tiek krustotas, lai radītu F2 nesējus, kas pēc tam tiek krustoti, lai iegūtu homozigotos mutantus F3 paaudzē. Pēc tam pēcnācējus ar vēlamajiem fenotipiem izolē un izmanto ģenētiskai kartēšanai un sekvencēšanai, lai identificētu mutācijas gēnu (Patton un Zon, 2001). Citas šī ekrāna variācijas, piemēram, izmantojot haploīdus un homozigotus diploīdus, var palīdzēt samazināt laiku un pūles, kas nepieciešamas fenotipa un izraisošās ģenētiskās mutācijas identificēšanai (sīkāk apsprieda Patton un Zon, 2001). Transgēnās reportieru līnijas, kas ekspresē fluorescējošus proteīnus interesējošajā orgānā, var apvienot ar parasto ģenētisko skrīningu, lai viegli pārbaudītu interesējošos mutantus. Uz ENU balstīta mutaģenēzes ekrāns ļāva identificēt spuldzes (lib) mutantu zebrazi, kam ir morfoloģiski un nefronu segmentācijas defekti, kas līdzīgi zebrazivs embrijiem ar retīnskābes (RA) deficītu. Tika konstatēts, ka lib mutantiem ir pāreja no C uz A aldh1a2 174. nukleotīdā, kas, domājams, sintezēs 58 aminoskābju garu saīsinātu proteīnu, tādējādi atceļot aldh1a2 funkciju un ietekmējot RA sintēzi no retinaldehīda. Lib, bezkakla (nls) mutanta ar punktveida mutāciju aldh1a2 un DEAB (retīnskābes sintēzes inhibitora) apstrādāto embriju katalītiskajā domēnā analīze atklāja, ka RA līmeņi modulē nefronu segmentāciju, mainot segmentu specifisko transkripcijas faktoru telpisko ekspresiju (Vingerts un Davidson, 2011; Begemann et al., 2001; Mullins et al., 1994). Cits mutants, ko sauc par Zeppelin, palīdzēja identificēt brac2 kā podocītu attīstības regulatoru (Kroeger et al., 2017).

Ievietošanas mutaģenēze ir uz transpozonu vai pretvīrusu balstīta metode, ko izmanto, lai nejauši ievietotu DNS dažādos genoma lokos, un šī svešā DNS pēc tam palīdz identificēt mutācijas gēnu (Amsterdam et al., 1999). Hopkinsa laboratorija MIT veica ievietošanas mutaģenēzes skrīningu zebrafish embrijiem, izmantojot retrovīrusu vektoru. Viņi identificēja 12 gēnus, kas bija saistīti ar bojātiem nieru fenotipiem ar cistām glomerulārā kanāliņu reģionā, no kuriem četri bija saistīti ar skropstu veidošanos (Sun et al., 2004). Progresīvās ģenētikas pieejas trūkumi ir tādi, ka skrīninga process ir apgrūtinošs un laikietilpīgs. Tomēr jaunās sekvencēšanas tehnoloģijas attīstība ir padarījusi ģenētikas pieeju daudz efektīvāku.

Gēnu izslēgšana, izmantojot programmējamas nukleāzes

Viena no galvenajām priekšrocībām, izmantojot zebrafish kā paraugorganismu, ir efektīvu genoma rediģēšanas metožu, piemēram, CRISPR/Cas, TALEN un ZFN, pieejamība (Sertori et al., 2016). CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) / Cas9 ir daudzpusīgākā un visbiežāk izmantotā genoma rediģēšanas tehnoloģija zebrafish. CRISPR RNS (crRNS) un trans-aktivējošās crRNS (tracrRNS) himēra ir veidota kā viena virzošā RNS (sgRNS), kas kopā ar Cas9 proteīnu/mRNS tiek injicēta zebrafish embrijos vienas šūnas stadijā (Varshney et al. , 2016). SgRNS saistās ar 20 bp mērķa DNS sekvenci, kas atrodas blakus protospacer blakus motīvam (PAM) NGG secībai genomā, pēc tam Cas9 ģenerē dubultās virknes griezumu mērķa DNS sekvencē. Pēc tam to vēlams labot ar nehomologu gala savienošanu, kas ir ar kļūdām pakļauts labošanas mehānisms, kura rezultātā tiek ģenerēta nejauša ievietošana/dzēšana (indel), kas noved pie izmaiņām kodēšanas secības nolasīšanas rāmī, un līdz ar to atceļ interesējošā gēna funkcijas. Pēdējos gados ir izstrādātas uzlabotas metodoloģijas, lai palielinātu uz CRISPR balstītas genoma rediģēšanas tehnikas efektivitāti (Liu et al., 2019). Ir iespējams izdzēst lielu DNS fragmentu, izmantojot divas vai vairākas sgRNS vienlaikus (Kim un Zhang, 2020). Ir iespējams arī vienlaikus efektīvi mērķēt uz vairākiem gēniem vienā zebrafish embrijā (Shah et al., 2016). Ir veikti daudzi pētījumi, lai radītu zebrafish mutantus, lai apkopotu cilvēka nieru slimības, izmantojot CRISPR / Cas9 tehnoloģiju. CRISPR izraisītā ciliārā membrānas proteīna Arl13b izslēgšana izraisīja mutantu veidošanos, kas atdarina "Joubert sindromu" (Cantagrel et al., 2008). Tiek ziņots, ka mutācijas cilvēka ELMO1 gēnā veicina diabētisko nefropātiju. elmo1 mutantu zebrafish uzrāda fenotipus, kas novēroti hiperglikēmiskajos embrijos, ko rada pdx1 gēna notriekšana, piemēram, lielāks glomeruls, bojāts podocīts, īsāks kakls un hiperfiltrācija, tādējādi izceļot šī gēna saglabāto funkciju (Sharma et al., 2016). Mutantiem magi2a zebrafish ir pret steroīdiem rezistents nefrotiskais sindroms, kas tiek novērots arī cilvēkiem ar MAGI2 mutācijām (Jobst-Schwan et al., 2019). Šie novērojumi liecina par zebrafish kā organisma piemērotību cilvēka nieru slimību modelēšanai.

Vēl viena metode zebrafish mutantu ģenerēšanai ir transkripcijas aktivatoram līdzīgas efektoru nukleāzes (TALEN), kuras pamatā ir genoma rediģēšana. Šajā tehnikā DNS saistošo domēnu TALE veido monomēri, katrs monomērs sastāv no 34 aminoskābju atlikumu tandēma atkārtojumiem, kas saistās ar konkrētu nukleotīdu DNS secībā. Šīs TALE sekvences ir iegūtas no patogēnām baktērijām Xanthomonas, kas maina gēnu transkripciju saimniekšūnās (Boch and Bonas, 2010). TALEN mērķa konstrukcija sastāv no kodola lokalizācijas signāla, DNS saistošā domēna un FokI nukleāzes domēna to karboksilgalos. TALEN darbojas pa pāriem, un to saistīšanās vietas atrodas pretējās DNS virknēs, kas atdalītas ar 12 līdz 25 bp starpliku secību. Konstrukcijas saistās ar mērķa vietu kodolā un ģenerē divvirzienu pārrāvumu, kas pēc tam tiek labots ar nehomologu galu savienošanu (Liu et al., 2014). CRISPR vai TALEN radītās mutācijas zebrafish var aktivizēt gēnus, kas kompensē interesējošo gēnu zudumu, tādējādi apgrūtinot gēna funkcijas atklāšanu (Rossi et al., 2015). Tomēr šos kompensējošos gēnus ir iespējams identificēt ar transkripta analīzi, izmantojot nākamās paaudzes sekvencēšanas (NGS) metodes, kas var palīdzēt identificēt interesējošā gēna funkciju. Gēnu un molekulāro ceļu identificēšana, kas kompensē gēna funkcijas zudumu, var palīdzēt atrast jaunas ārstēšanas metodes gēnu mutācijām, kas izraisa nopietnas slimības (El-Brolosy un Stainier, 2017).

Gēnu iznīcināšana, izmantojot morfolino antisense oligos

Morfolini ir neanjonu oligonukleotīdi, kas ir salīdzinoši stabili, salīdzinot ar to DNS vai RNS oligomēriem (Summerton, 1999). Morfolino antisense oligonukleotīdi saistās ar mērķa proteīna mRNS tās translācijas iniciācijas vietā un bloķē tās translāciju. Cita veida morfolino antisense oligo var mērķēt uz splicēšanas krustojumiem un bloķēt pre-mRNS splicēšanu (Summerton, 1999). Morfolino-antisensa oligo efekts ir pārejošs, un to var izmantot, lai pētītu interesējošo gēnu agrīnās attīstības lomu. Morfolino-antisense oligo injekcija tiek veikta zebrafish embriju 1-4 šūnu stadijā, un tās efektu var redzēt līdz 3-5 dienām pēc apaugļošanas (pdf) (Bill et al., 2009). Morfolino antisensu oligonukleotīdiem bieži ir ārpus mērķa iedarbība (Robu et al., 2007). Kontroles eksperimenti, piemēram, glābšanas eksperiments, jāveic, injicējot morfolino kopā ar mRNS, ko nevar mērķēt šis antisense oligo, lai pārbaudītu tā specifiku (Eisen and Smith, 2008). Ir izstrādāts fotoaktivēts morfolino, kura darbību var kontrolēt telpiski un laikā ar UV iedarbību (Tallafuss et al., 2012). Ir veikti daudzi pētījumi, izmantojot morfolino antisense oligo-mediētu gēnu nojaukšanu, lai izprastu cilvēka nieru slimības. Piemēram, nefrocistīna-3 gēna iznīcināšana izraisīja cistu veidošanos un hidrocefāliju zebrafijas embrijos līdzīgi kā nefronoftizes tipa-3 slimībai (Zhou et al., 2010).

Aminoglikozīdu antibiotikas, ko parasti lieto daudzu dzīvībai bīstamu infekciju ārstēšanai, ir pazīstamas ar to nefrotoksisko un ototoksisko iedarbību (Mingeot-Leclercq and Tulkens, 1999). Gentamicīns ir plaši lietota antibiotika, kas var izraisīt akūtu nieru bojājumu (AKI) zebrafish. Gentamicīns izraisa otas robežu epitēlija saplacināšanu, kanāliņu epitēlija zudumu, glomerulu struktūras deformāciju, lizosomu fosfolipidozi un leikocītu vai šūnu atlieku uzkrāšanos cauruļveida lūmenā, kas imitē gentamicīna pārdozēšanu cilvēkiem (Cianciolo Cosentino et al., 2010). Zebrafish var atjaunot un aizstāt bojātos nefronus. Gentamicīna apvainojumu var izmantot, lai pētītu nieru reģenerāciju zebrazivīm (Kamei et al., 2015). Gentamicīna ievainojums izraisa reģenerācijas reakciju, kas izraisa nieru cilmes šūnu specifikācijas, proliferācijas un diferenciācijas posmus, lai radītu jaunus nefronus. Pieaugušām zivīm nefronu atjaunošanai nepieciešama aptuveni 14 līdz 21 diena (Diep et al., 2011; McCampbell et al., 2015). Cisplatīnam, ko izmanto kā ķīmijterapijas līdzekli audzēju ārstēšanai, ir arī nefrotoksiska iedarbība, kā novērots zebrazivīm (Henschel et al., 2005). Etimicīns ir vēl viens aminoglikozīds, ko var izmantot, vienlaikus atdarinot zemu nefrotoksicitāti un ototoksicitāti zebrafijas embrijiem (Shao et al., 2020). Tādējādi ar šo antibiotiku palīdzību zebrazivīm var pētīt AKI un nieru atjaunošanos.

Mehānisks nieru bojājums

Zebrafish pronephros var tikt fiziski ievainots, izmantojot rezekciju, duršanu vai kriotraumas. Ķirurģisku traumu var veikt, izmantojot smalkas pincetes, lai iedurtu vajadzīgo pronefrosa zonu, lai izveidotu AKI modeli. Šis paņēmiens tika izmantots, lai bojātu pronefrisko kanālu tuvu kloākai, kas traucēja šķidruma plūsmu un izraisīja cistu veidošanos 30 minūšu laikā (Kramer-Zucker, 2005). Tika konstatēts, ka šķidruma plūsmas ātruma samazināšanās pronefrosā rada pretspiedienu šķidruma ievades vietā, izraisot kanāliņu luminālo paplašināšanos un cistu veidošanos. Cita pētnieku grupa izveidoja obstrukciju pronefriskajos kanāliņos ar jaudu 50 ZS vai 12-mēnešus vecu zebrazivju mezonefriskajās kanāliņos, izmantojot pinceti, lai nospiestu zonu pie distālajām savākšanas kanāliņiem (Hellman et al., 2010). Viņi atklāja, ka kanāliņu rētas izraisa ciliāru sitienu ātruma palielināšanos un foxj1a transkripcijas faktora, kas regulē lipogēno gēnu ekspresiju, regulēšanu. Tas liek domāt, ka pronefrisko kanāliņu ievainojumi rada uz cilijām balstītu mehanosensoru signālu, lai uzturētu nefrona homeostāzi.

Lāzera izraisīts nieru bojājums

Šūnu ablāciju ar lāzeru izmanto kā līdzekli, lai pētītu nieru bojājumus un atdarinātu AKI zebrazi. Džonsons et al. (2011) ir aprakstījuši metodi lāzera ablācijai, kam seko reģenerējošo nefronu izsekošana. Viņi injicēja 40 kDa dekstrāna-FITC zebrafish embriju stumbra somītos ar ātrumu 48-55 hpf, lai iezīmētu proksimālās kanāliņu epitēlija šūnas, kuras pēc tam tika mērķētas uz lāzera ablāciju pie 72 ZS. Pēc tam noņemtie embriji tika atkārtoti injicēti ar rodamīna dekstrānu, lai izsekotu proksimālās kanāliņu epitēlija šūnas. Viņi atklāja, ka pilnībā attīstīts proksimālais kanāliņš izveidojās 7. dienā pēc lāzera izraisītas ablācijas (Johnson et al., 2011). Vēl viena alternatīva ir izmantot nierēm specifisku transgēnu līniju, lai identificētu šūnas lāzera mediētai ablācijai un uzraudzītu blakus esošo šūnu uzvedību. Violetā lāzera gaisma ar viļņa garumu 405 nm tika izmantota, lai mērķētu uz Tg (atp1a1a.4:GFP) zebrafish pronefrisko kanāliņu (Palmyre et al., 2014). Tā kā GFP ierosmes spektri atrodas diapazonā no zilas līdz violetai gaismai, tas absorbēja 405 nm lāzera gaismu, kas darbojas kā enerģijas izlietne, lai potenciāli izraisītu ievainojumus mērķa epitēlija šūnās. Šis eksperiments noveda pie atklājuma, ka šūnu migrācija ir ievainotās epitēlijas primārā reakcija. Kolektīvā šūnu migrācija izraisīja mehānisku stiepšanos, kas stimulēja šūnu proliferāciju, lai labotu ievainoto kanāliņu. Lai noteiktu laiku, kad zebrafish pronefriskais kanāliņos iegūst reģenerācijas spēju, Jakulovs et al. (2018) izmantoja 2-fotonu lāzeru, lai ablētu nelielu daļu pronefrisko kanāliņu Tg(cldn2b:lyn-GFP). embrijiem dažādos laika punktos un sekoja reģenerācijas procesam. Viņi atklāja, ka 2-dienu vecu embriju pronefrisko kanāliņu ablāciju ātri atjaunoja migrācijas reakcijas, savukārt 1-dienu veciem embrijiem šādas spējas nebija. Viņi veica ievainoto zebrazivju embriju gēnu ekspresijas profilēšanu un atklāja, ka cxcr4b un vizla ir iesaistīti šajā labošanas procesā (Yakulov et al., 2018).

Ķīmiskā ģenētika

Mazas bioaktīvās molekulas var izmantot, lai traucētu olbaltumvielu darbību un izprastu to bioloģisko lomu. Liels skaits ķīmisko bibliotēku ir komerciāli pieejamas vai var tikt izgatavotas pēc pasūtījuma olbaltumvielu funkciju noteikšanai. Šīs mazo molekulu bibliotēkas ietver kināzes inhibitorus, proteāzes inhibitorus, kodolreceptorus un ligandus, ko var izmantot, lai noteiktu orgānu attīstībā un darbībā iesaistīto signālu ceļu lomu (Kawasumi un Nghiem, 2007). Pēdējo desmitgažu laikā zebrafish ir kļuvuši par spēcīgu mugurkaulnieku paraugorganismu augstas caurlaidības ķīmiskai skrīningam un fenotipu noteikšanai (Kaufman et al., 2009). Cao et al. (2009) izmantoja ķīmiskā skrīninga pieeju, lai identificētu savienojumus, kas var mainīt fenotipus, ko izraisa mutācijas pkd2 (PKD cēloņsakarības gēns) un ift172 (gēns, kas atbild par skropstu veidošanos). Viņi atklāja, ka pan-histona deacetilāzes (pan-HDAC) inhibitors trihostatīns A (TSA) un I klases specifiskais HDAC inhibitors valproiskābe (VPA) var nomākt nieru cistu veidošanos pkd2 izslēgšanas modelī (Cao et al., 2009). ). Tādējādi ķīmiskā ģenētika var būt noderīgs līdzeklis, lai identificētu jaunus zāļu kandidātus, kas var mainīt vai nomākt slimības apstākļus.

Ģenētiski inducējami nieru bojājumu modeļi

Zebrafish var izmantot ģenētiski inducējamu audu ablācijas modeli, kurā baktēriju nitroreduktāze (NTR) tiek ekspresēta izvēlēta promotora kontrolē, kas virza NTR ekspresiju noteiktā pronefrosa segmentā. NTR pārvērš metronidazolu par citotoksisku metabolītu, kas var izraisīt NTR ekspresējošo šūnu nāvi (Curado et al., 2008). Džou un Hildebrandts (2012) izmantoja šo paņēmienu, lai izraisītu podocītu bojājumus, ekspresējot NTR podocīna promotora kontrolē Tg (pod: NTR-mCherry) zebrafish līnijā. Viņi arī izstrādāja dubultu transgēnu VDBP-GFP (D vitamīnu saistošo proteīnu, kas marķēts ar GFP) līniju kā proteīnūrijas marķieri kopā ar Tg (pod: NTR-mCherry) līniju. Ārstēšana ar metronidazolu izraisīja podocītu bojājumu, izraisot visa ķermeņa tūsku un VDBP-GFP uzkrāšanos proksimālajās kanāliņos, atdarinot cilvēka nefrotiskā sindroma fenotipu (Zhou un Hildebrandt, 2012).

Metodes, lai novērtētu pronefrosa attīstību un funkciju zebrafish

Mēs esam aprakstījuši metodes cilvēka nieru slimību modeļu ģenerēšanai, izmantojot zebrazi. Slimības modeļa izveide, izmantojot citu organismu, ir sākotnējais solis, kas ir jānovērtē attiecībā uz tā spēju patiesi apkopot dažādus cilvēkiem novērotas slimības aspektus. Zebrafish piedāvā daudzas priekšrocības, ko var izmantot, lai ātri novērtētu tās spēju kalpot kā surogāts, lai izprastu cilvēka nieru slimības, kā aprakstīts tālāk.

Morfoloģijas skrīnings

Visbiežāk mutantu zebrazivju embrijiem ir morfoloģiskas atšķirības salīdzinājumā ar savvaļas tipu, ko var viegli novērtēt, novērojot mikroskopā. Zebrafish embriju caurspīdīgums un to spēja izdzīvot līdz 5 dienām pat ar smagiem attīstības defektiem ir galvenā priekšrocība uz morfoloģiju balstītos ekrānos. Bieži sastopamās morfoloģiskās izmaiņas, kas novērotas zebrafijas embrijiem ar bojātu pronefrosu, ir perikarda tūska, pronefriskas cistas, izliekta ķermeņa ass un hidrocefālija (Poureetezadi un Wingert, 2016; Outtandy et al., 2019). Tūska ir viena no biežākajām nieru defektu pazīmēm, ko novēro arī citu orgānu nepilnībās, piemēram, sirds attīstībā (Hanke et al., 2013). Mutantiem ar nieru defektiem var veidoties cistas citu epitēlija šūnu proliferācijas dēļ, kā to var viegli novērot mikroskopā (Zhao un Malicki, 2007; Yamaguchi et al., 2006). Mutantiem ar pronefrisku skropstu defektu bieži novēro izliektu ķermeņa asi. Mutantu zebrazivs, piemēram, Loks (lok), shen yantf214a (kautrīgs), garbustm304 (grb) un zatortg238a (zar), ir daži citi piemēri, kas parāda izliektu ķermeņa asi (Zhao un Malicki, 2007). Zebrafish mutantiem ar nieru defektiem ir vairāki morfoloģiski defekti vienā un tajā pašā embrijā. Divu policistīna gēnu pkd1a un pkd1b iznīcināšana izraisīja perorāli izliektu ķermeņa asi, hidrocefāliju, skrimšļus un galvaskausa un sejas defektus ar zemu pronefrisku cistu biežumu (Mangos et al., 2010). Intraflagelāro transporta proteīnu ift57, ift88 un ift172 mutantiem, kur skropstas bija bojātas, ķermeņa ass bija ventrāli izliekta (Lunt et al., 2009). Tādējādi zebrafish mutantiem ar bojātām nierēm ir daudzas morfoloģiskas pazīmes, kuras var viegli identificēt.

Plašāka informācija: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501