Piena osteopontīns priekšlaicīgi dzimušu cūku zarnām, imunitātei un smadzeņu attīstībai
Jun 14, 2022
Lai uzzinātu vairāk informācijas, lūdzu sazinietiesdavid.wan@wecistanche.com
Abstrakts
Nepietiekams piena osteopontīna (OPN) līmenis zīdaiņu maisījumā var daļēji izskaidrot attīstības atšķirības starp zīdaiņiem, kuri baroti ar mākslīgo maisījumu vai mātes pienu. Mēs atzinīgi vērtējam piena diētu, kas papildināta ar liellopu pienuOPNuzlabo zarnu, imunitāti un smadzeņu attīstību un pārbaudīja to priekšlaicīgas cūkas modelī. Priekšlaicīgi dzimušas cūkas, kas dzemdētas ar ķeizargrieziena operāciju (90 % grūsnības), tika barotas ar liellopu svaigpienu (CON, n=19) vai ar to pašu barību, kas papildināta ar fizioloģiski atbilstošu OPN devu (46 mg/(kg:d), n{ {3}}). Pētījuma laikā tika novērtēti ar klīniskajiem rezultātiem, sistēmisko imunitāti un neirokognitīvo attīstību saistītie beigu punkti, un zarnu audi tika savākti 19. dienā. Augšanas modelis, agrīna motora attīstība un lielākā daļa sistēmisko imūno parametru bija līdzīgi starp OPN unCONcūkas. OPN cūkām 8. dienā bija augstāka villu un kripta attiecība nekā CON cūkām un lielāks monocītu un limfocītu skaits. Zarnu gremošanas un absorbcijas funkcijas un kognitīvā veiktspēja (T-labirinta tests) OPN un CON cūkām bija līdzīgas. Noslēgumā jāsaka, ka uztura bagātināšana arOPNvirs liellopu piena bazālā līmeņa izraisīja nelielus zarnu struktūras un sistēmiskās imunitātes uzlabojumus, neietekmējot kognitīvo darbību. Joprojām ir jānosaka minimālie OPN līmeņi mākslīgā piena maisījumā zīdaiņiem, lai nodrošinātu optimālu adaptāciju tuvākajā jaundzimušo periodā.
Atslēgvārdi: osteopontīns; bioaktīvais piena proteīns; priekšlaicīgi dzimušie; zarnu veselība; sistēmiskā imunitāte; smadzeņu attīstība; izziņa
Noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk par Cistanche
1. Ievads
Bioaktīvo proteīnu līmeņa optimizēšana mākslīgajos maisījumos zīdaiņiem var palīdzēt samazināt vispāratzītās attīstības un slimību rezistences atšķirības starp zīdaiņiem, kas baroti ar mākslīgo maisījumu un mātes pienu[1-3]. Osteopontīns (OPN) ir skābs proteīns ar augstu glikozilāciju un fosforilāciju, kas tiek uzskatīts par svarīgu attīstības stimulēšanai tiešā jaundzimušā periodā, un tas ir bagātīgi sastopams agrīnā mātes pienā[4-6]. OPN piena koncentrācija starp sugām ievērojami atšķiras, un cilvēka pienā pat atšķirības starp mātēm ir lielas. Samazinājums laktācijas periodā šķiet konsekvents novērojums [5,7]. Daudzcentru pētījumā vidējais OPN līmenis bija 160 mg/l aptuveni 13 nedēļas pēc dzemdībām [7]. Augstākais 25 procentu OPN līmenis mātes pienā bija 230-495 mg/l, kas ir daudz augstāks par vidējo līmeni, kas ziņots liellopu pienam (~18 mg/l) vai mākslīgajiem maisījumiem zīdaiņiem (~9 mg/l)[ 4]. Pašlaik liellopu piens OPN ir komerciāli pieejams, un tāpēc to var pievienot mākslīgajiem maisījumiem zīdaiņiem, lai sasniegtu līmeni, kas ir līdzīgs mātes pienā konstatētajam līmenim.
Tā kā OPN ir ļoti konservēta arginīna-glicīna-aspartāta (RDG) integrīna saistīšanās vieta, sagaidāms, ka bioloģiskie efekti visās sugās būs līdzīgi [8]. Fragments, kas satur RDG secību, ir ļoti izturīgs pret sadalīšanos glikozilācijas dēļ, kas ir tuvu integrīnu saistošajam motīvam [9], tādējādi atbalstot dabiskā piena OPN bioaktīvo potenciālu zarnās. In vitro piena OPN spēj stimulēt zarnu šūnu proliferāciju un veikt antibakteriālas aktivitātes kā daļu no kompleksa ar laktoferīnu (LF), citu svarīgu bioaktīvo piena proteīnu [10,11]. Piena OPN labvēlīgā ietekme uz zarnām ir pierādīta arī in vivo. Zarnu attīstību jaundzimušajiem rēzus pērtiķiem uzlaboja liellopu piens OPN, un ar OPN papildinātu mākslīgo dzīvnieku jejunālā transkripts bija līdzīgs ar krūti barotiem dzīvniekiem [12]. Diētiskais piensOPN efekti, gan lokāli zarnās, gan sistēmiski pēc nelielas uzsūkšanās zarnās zīdaiņiem, daļēji tiek attiecināta uz tā spēju stimulēt endogēno OPN līmeni [5,13,14]. OPN ir atrodams lielākajā daļā ķermeņa audu un šķidrumu, kur tas veic dažādas funkcijas, piemēram, biomineralizāciju un imūnmodulāciju, ne tikai piedalās šūnu proliferācijā, migrācijā, adhēzijā un opsonizācijā [8, 10, 15, 16]. Ir zināms, ka OPN regulē Th1/Th2 līdzsvaru, kas jaundzimušajiem ir novirzīts uz Th2 polarizāciju [17]. OPN piemīt citokīniem līdzīgas īpašības un tas var stimulēt Th1 tipa imunitāti, inducējot IL-12 ekspresiju un kavējot IL-10, Th2 citokīna, ražošanu makrofāgos [18]. Turklāt OPN var veicināt smadzeņu nobriešanu, potenciāli veicinot kognitīvo funkciju uzlabošanos zīdaiņiem, kas baroti ar krūti salīdzinājumā ar mākslīgajiem zīdaiņiem [19-21]. Lai to pamatotu, ar OPN barotiem peļu mazuļiem bija labākas mācīšanās spējas un augstāks ar mielinizāciju saistīto proteīnu ekspresijas līmenis, tostarp mielīna pamata proteīna un ar mielīnu saistītā glikoproteīna, un OPN arī uzlaboja mielinizāciju in vitro [14, 22, 23]. Termiskām cūkām vairākus smadzeņu reģionus ietekmēja palielināts relatīvais tilpums pēc uztura papildināšanas ar liellopu pienu OPN, taču netika novērota ietekme uz izziņas parametriem [24].
Priekšlaicīgi dzimuši zīdaiņi (dzimšana<37 weeks="" of="" gestation)="" are="" particularly="" diet-sensitive="" due="" to="" their="" relatively="" immature="" gut,="" immune="" system,="" and="" brain.="" such="" infants="" are="" susceptible="" to="" developing="" both="" short-and="" long-term="" complications="" such="" as="" necrotizing="" enterocolitis="" (nec),="" feeding="" intolerance,="" infections,="" and="" impaired="" neurodevelopment="" [25-28].="" bovine="" milk="" opn="" supplementation="" has="" previously="" been="" shown="" to="" reduce="" nec="" severity="" in="" formula-fed="" preterm="" piglets="" [29],="" and="" other="" milk="" factors="" have="" proven="" to="" support="" brain="" structure="" and="" cognitive="" development,="" particularly="" in="" preterm="" newborns="" [30,31].="" on="" this="" background,="" we="" hypothesized="" that="" preterm="" newborns,="" fed="" a="" standard="" milk="" diet="" with="" relatively="" natural="" bioactivity,="" would="" benefit="" from="" further="" opn="" supplementation.="" following="" an="" initial="" in="" vitro="" demonstration="" of="" opn="" antimicrobial="" activity,="" we="" used="" diet-sensitive="" preterm="" pigs="" [32-34]to="" investigate="" if="" an="" opn-enriched="" bovine="" milk="" diet="" would="" improve="" gut,="" immunity,="" and="" brain="" development="" in="" the="" first="" three="" weeks="" after="" preterm="">
2. Materiāli un metodes 2.1. In vitro antibakteriālais tests
Pirmkārt, tika izmantots antibakteriālais tests [35], lai novērtētu bioaktivitātiOPNkvantitatīvi nosakot tā spēju kavēt Staphylococcus, ti, bieži sastopama jaundzimušo grampozitīvā patogēna, augšanu vai nogalināt [36]. To pašu neskarto nepasterizēto liellopu pienu, ko izmantoja par enterālo diētu cūku pētījumā, atkausēja un centrifugēja secīgi pie 500 × g un 3000 × 8,4 grādiem 15 minūtes, katru reizi aspirējot ūdens slāni, lai noņemtu tauku saturu. piena olbaltumvielu zuduma samazināšana [37]. Pēc liellopu vājpiena sterilitātes pārbaudes,OPNpulveris (Lacprodan⑧ OPN-10, Arla Foods Ingredients, Viby, Dānija) tika izšķīdināts koncentrācijā 1,6 (tāds pats daudzums, kāds OPN pienam tika pievienots 1. dienā cūku pētījumā), 2,8, 5, 10 un 20 g. /L, izveidojot 6 testa diētas, tostarp bezpiedevu liellopu vājpienu, kas tika uzglabātas 1 ml alikvotās daļās -80 grādu temperatūrā līdz analīzei. Saldēti S.epidermidis (WT1457 [38], Dr. Xiaoyang Wang, Gēteborgas Universitāte, Zviedrija) kultūras krājumi [35] tika atkausēti, centrifugēti ar ātrumu 3200 × g un atkārtoti suspendēti sterilā fizioloģiskā šķīdumā pirms inkubācijas ar 6 testa diētas (papildus komerciāli pieejamai, barošanai gatavai priekšlaicīgas piena formulai, kas iekļauta kā negatīva kontrole [1]) ar aprēķināto 10 grādu devu un 106 KVV/ml 2, 4, 6 un 24 stundas pie 37 grādiem. Tika noteiktas galīgās inokulācijas devas un baktēriju augšana testa diētā un mākslīgā piena maisījumā zīdaiņiem pēc dažādiem inkubācijas laikiem [35]. Tika veikti neatkarīgi trīs antibakteriālās pārbaudes eksemplāri.
2.2. Dzīvnieki un eksperimentālais dizains
Visas procedūras ar dzīvniekiem tika apstiprinātas un veiktas saskaņā ar licenci (licences nr. 2014-15-0201-00418), ko izdevusi Dānijas Dzīvnieku eksperimentu inspekcija. Četrdesmit astoņi sivēni (Dānijas Landracex Yorkshire Duroc) no divām komerciāli audzētām sivēnmātēm tika izvadīti priekšlaicīgi ar ķeizargrieziena palīdzību aptuveni 90% grūtniecības laikā (pilns termiņš: 117±2 dienas). Pēc veiksmīgas reanimācijas un, vēl anestēzējot no mātes anestēzijas līdzekļiem, ķirurģiska nabas artērijas katetra ievietošana, lai atvieglotu parenterālo barošanu (PN), un orogastrālās barošanas caurule, lai atvieglotu enterālo barošanu (EN), tika veikta, kā aprakstīts iepriekš 32]. Seši sivēni tika eitanāzēti tūlīt pēc piedzimšanas neveiksmīgas atdzīvināšanas dēļ, un tāpēc tie tika izslēgti no pētījuma. Kopumā četrdesmit divi sivēni tika stratificēti pēc dzimuma un dzimšanas svara un iedalīti vienā no divām grupām: viena grupa saņēma liellopu svaigpienu, kas papildināta ar OPN (OPN, n=21), un kontroles grupa, kas saņēma neapstrādātu liellopu gaļu. piens (CON, n=21)(1. attēls). Mātes plazma tika ievadīta 3 bolusos (kopā 25 ml/kg) caur nabas katetru pirmo 24 stundu laikā, lai nodrošinātu pasīvo imunizāciju. Cūkas tika audzētas individuāli visā 19 dienu pētījuma periodā. Sākot ar 1-5. dienu, tie tika audzēti ventilējamos, apsildāmos inkubatoros (plus skābekļa padeve pirmajās 24 h), un 5. un 11. dienā tie tika pārvietoti uz lielākiem būriem. Visi klīniskie pētnieki bija akli pret uztura ārstēšanu visā eksperimenta periodā.
2.3. Uzturs un barošana
Enterālā barība, kas tika izbarota visām cūkām, tika balstīta uz nepasterizētu, neskartu liellopu pienu, kas tika savākts divās partijās no vietējās Džersijas govju piena fermas un uzglabāts -20 grādu temperatūrā. Liellopu piens tika bagātināts ar minerālvielām un vitamīniem (15 g/l Pediatric Seravit, Nutricia, Utrehta, Nīderlande) un elektrolītiem (6 g/l Revolyte Nutrition, Gunnar Kjems ApS, Kopenhāgena, Dānija). Šī piena bāze kalpoja par pilnvērtīgu enterālo diētu CON grupas sivēniem. OPN grupas cūkām liellopu piena bāzi papildus papildināja ar liellopu pienu OPN (Lacprodan⑧ OPN-10) pie vidējās piedevas.OPNkoncentrāciju 319 mg/l(IQR 272-445), lai iegūtu ikdienas fiksēto papildu OPN devu 46 mg/(kg·dienā). Koncentrācija ir OPN robežās mātes pienā [4]. OPN koncentrācija savāktajā liellopu pienā bija 91 mg/l, mērot ar šķidruma hromatogrāfijas-tandēma masas spektrometriju (LC-MS/MS, Alphalyse A/S, Odense, Dānija). OPN papildu deva tika izvēlēta tā, lai tā atbilstu cilvēka piena diapazona augstākajai robežai, lai nodrošinātu saprātīgu atšķirību no liellopu piena kontroles diētas. Ikdienas enterālās diētas sagatavoja un uzglabāja 4 grādu temperatūrā līdz lietošanai (<24 h).="" pigs="" received="" gradually="" increasing="" volumes="" of="" en="" from="" 32="" ml/(kg.="" day)="" on="" day="" 1="" to="" 180ml/(kg:="" day)on="" day="" 15="" and="" until="" euthanasia.="" the="" enteral="" diets="" were="" given="" as="" boluses.="" during="" the="" daytime,="" the="" boluses="" were="" given="" every="" second="" hour,="" and="" during="" the="" night="" every="" third="" hour="" until="" day="" 9.="" thereafter,="" the="" feeding="" frequency="" was="" reduced="" to="" every="" third="" hour,="" day="" and="" night.="" the="" en="" was="" given="" through="" the="" orogastric="" feeding="" tube="" until="" day="" 5="" when="" pigs="" were="" taught="" to="" drink="" from="" troughs.="" the="" pn="" was="" given="" as="" a="" continuous="" infusion="" in="" decreasing="" amounts="" from="" days="" 1-8="" (144-148="" ml/(kg.="" day))to="" counterbalance="" the="" small="" enteral="" volumes="" the="" piglets="" can="" cope="" with.="" the="" pn="" solution="" was="" a="" commercially="" available="" human="" parenteral="" nutrition="" product="" (kabiven,="" fresenius="" kabi,="" uppsala,="" sweden)="" adjusted="" to="" the="" requirements="" of="" piglets="" as="" previously="" described="" [32].="" after="" removal="" of="" the="" orogastric="" feeding="" tube="" on="" day="" 11="" and="" onwards,="" all="" pigs="" had="" free="" access="" to="">
2.4. Klīniskā novērtēšana un audu savākšana
Visā pētījuma periodā cūkas tika rūpīgi uzraudzītas (vismaz ik pēc 3 stundām), un klīniskie rādītāji tika piešķirti divas reizes dienā, kā aprakstīts iepriekš [33]. Pēc klīniskām indikācijām tika uzsākta atbilstoša ārstēšana, piemēram, intramuskulāru pretsāpju līdzekļu ievadīšana (meloksikams: Metacam, 5 mg/ml Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Vācija vai butorfanols: Torbugesic Vet, 10 mg/ml, Zoetis, Parsippany, NJ, ASV). Gadījumos, kad nebija atbildes reakcijas uz ārstēšanu, cūkas tika eitanāzētas. Ķermeņa svars tika mērīts katru dienu, un vidējais ķermeņa masas pieaugums, kas izteikts kā g / (kg.d), tika aprēķināts pēc formulas: (svars eitanāzijas laikā - svars dzimšanas brīdī) / (vidējais ķermeņa svars × dzīves ilgums). Divas reizes dienā izkārnījumi tika vērtēti šādi: 1 (cieti izkārnījumi), 2 (mīksti/pastaveida izkārnījumi), 3 (krēmveida izkārnījumi) un 4 (caureja). Lai izvairītos no dehidratācijas, starp barošanas reizēm tika ievadīts iekšķīgi lietojams elektrolīta šķīdums (Revolyte Nutrition). Profilaktiskās perorālās antibiotikas (metronidazols: Flagyl, 40 mg/ml, Sanofi-Aventis, Parīze, Francija; amoksicilīns, 500 mg, ar klavulānskābi, 125 mg: Bioclavid, Sandoz GmbH, Kopenhāgena, Dānija; gentamicīns: Gentocin Vet35 mg/mL. , Scanvet, Fredensborg, Dānija) tika ievadītas divas reizes dienā no 8-10. dienām pēc nabas artērijas katetra noņemšanas. Tāda pati perorālo antibiotiku kombinācija tika ievadīta terapeitiski pēc indikācijas. 19. dienā, 60 minūtes pirms eitanāzijas, cūkām tika dota pēdējā standartizētā to attiecīgās barības boluss. Cūkas anestēzēja ar intramuskulāru zolazepāma/tiletamīna (Zoletil 50,25 mg/ml zolazepāma un 25 mg/ml tiletamīna, Virbac, Carros, Francija), ketamīna (Ketaminol, 50 mg/ml, MSD Animal Health, Kenilworth, NJ) injekciju. , ASV) un butorfanolu (Torbugesic Vet), un pēc tam tie tika eitanizēti ar nātrija pentobarbitālu (Euthanimal, 400 mg / ml, Scanvet) ar intrakardiālu injekciju. Tūlīt pēc eitanāzijas iekšējie orgāni tika sadalīti un nosvērti, gan veseli orgāni, gan konkrēti orgānu reģioni (piemēram, pilns/tukšs kuņģis, tievā zarna, resnās zarnas, veselas smadzenes, smadzeņu reģioni, aknas, liesa, nieres, plaušas un sirds). Smadzeņu ūdens frakcija tika noteikta, nosverot kreiso smadzeņu puslodi pirms un pēc dehidratācijas 14 dienas 50 grādu temperatūrā. Katrs no pieciem kuņģa-zarnu trakta reģioniem (kuņģis, proksimālā tievā zarna (Prox), vidējā tievā zarna (Mid), distālā tievā zarna (Dist) un resnā zarna) tika novērtēts makroskopiski un piešķirts NEC punktu skaits [39]. Audu paraugi no katra kuņģa-zarnu trakta reģiona tika savākti un ātri sasaldēti šķidrā slāpeklī vai fiksēti 4% formaldehīdā un uzglabāti -80 grādos līdz turpmākām analīzēm. Pētījuma plāns un rezultāti parādīti 1. attēlā.
2.5. Zarnu gļotādas struktūra un otu robežas enzīmu aktivitātes
Gļotādas struktūra tievajās zarnās tika novērtēta, mērot paraformaldehīdā fiksēto un ar hematoksilīnu un eozīnu nokrāsoto Prox, Mid un Dist audu histoloģisko šķēlumu viļņu augstumu un kripta dziļumu, kā aprakstīts iepriekš [40]. Lai novērtētu enterocītu proliferāciju tievās zarnas gļotādā, kā aprakstīts iepriekš [41], tika izmantota imūnhistoķīmiskā krāsošana Prox, Mid un Dist sekciju atkārtojumos [41]. Četri katra atkārtojuma attēli tika iegūti sistemātiskā nejaušā veidā, izmantojot gaismas mikroskopu (Ortho-plane, Leitz, Vācija), kas pievienots kamerai un 10 × objektīvam. Attēla analīze tika veikta, izmantojot Fidži: Image] (NIH Image, Bethesda, Maryland), un kopējais Ki-67-pozitīvi iekrāsoto kodolu laukums tika aprēķināts kā daļa no kopējā kodolu laukuma. Vidējo audu homogenātos, izmantojot spektrofotometriju, tika noteikta 6 otu apmales enzīmu (maltāzes, saharāzes, laktāzes, aminopeptidāzes N (ABN), aminopeptidāzes A (APA) un dipeptidilpeptidāzes IV (DPPIV)) aktivitāte [42].
2.6.Asins bioķīmija, hematoloģija un sistēmiskā imunitāte
Asins paraugi bioķīmiskajiem un hematoloģiskajiem parametriem tika analizēti 1. dienā no nabassaites C-sekcijas laikā, 8. dienā no atvērtiem nabas arteriālajiem katetriem vai alternatīvi jūga vēnas un 19. dienā no sirds punkcijas eitanāzijas laikā. Plazma bioķīmijai, kas iegūta ar heparinizētu asiņu vakuuma ierīci (BDDiagnostics, Oksforda, Apvienotā Karaliste), kam sekoja centrifugēšana (2500 × g, 4 grādi 10 minūtes), tika analizēta, izmantojot ADVIA 1800 Chemistry System (Siemens Healthcare GmbH, Erlangena, Vācija). Pilnas asinis hematoloģijai un imūno šūnu skaitam, kas iegūtas ar EDTA pārklātu asins vakutaineru (BD Diagnostics), tika analizētas, izmantojot ADVIA 2120i hematoloģijas sistēmu (Siemens Healthcare GmbH).
Sistēmiskās imunitātes pārbaudes, lai pētītu asins T-šūnu apakšgrupas, neitrofilu fagocitozes funkciju un imūnās spējas, stimulējot ex vivo asins nodevu līdzīgu receptoru (TLR), tika veiktas pilniem asins paraugiem, kas savākti heparinizētā asins vakutainerā (BD Diagnostics) uz diviem. dienas; 8. diena no nabas artērijas katetriem vai jūga vēnas un 19. diena no jūga vēnas. Asins T-šūnu apakškopas raksturojums tika mērīts, kā aprakstīts iepriekš [43]. Īsumā, eritrocīti tika lizēti, izmantojot 1 X BD FACS Lysing šķīdumu (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, ASV), un leikocīti tika inkubēti ar fiksācijas/permeabilizācijas buferi (Invitrogen, Carlsbad, California) 30 minūtes 4 grādu temperatūrā tumsā. Pēc mazgāšanas ar permeabilizācijas buferi (Invitrogen) šūnas tika bloķētas ar cūku serumu (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ASV) 15 minūtes 4 grādus tumsā un pēc tam iekrāsotas ar četrām fluorescējoši iezīmētām monoklonālām antivielām; PE-Cy7-konjugēta peles anti-cūku CD3 antiviela (klons BB23-8E6-8C8, BD Biosciences), ar FITC konjugēta peles anti-cūku CD4 antiviela (klons MIL17, Bio- Rad Laboratories, Hercules, California), PE konjugēta peles anti-cūku CD8 antiviela (klons MIL12, Bio-Rad Laboratories) un APC konjugēta žurku anti-peļu FOXP3 antiviela (klons JFK-16s, ThermoFisher Scientific). Paraugi tika analizēti, izmantojot BD Accuri C6 plūsmas citometru (BDiosciences) un T-šūnu (CD3 plus limfocīti), citotoksisko T-šūnu (CD3 plus CD4-CD8 plus limfocītu), palīgu T-šūnu ( Tika identificēti CD3 plus CD4 plus CD8-limfocīti) un regulējošās T-šūnas (CD3 plus CD4 plus FoxP3 plus limfocīti). Asins neitrofilu fagocītiskā funkcija tika analizēta ar plūsmas citometriju, izmantojot pHrodo Red Escherichia coli (560/585). nm)Biodaļiņu fagocitozes komplekts plūsmas citometrijai (ThermoFisher Scientific)34]. Fagocītu ātrumu norādīja to neitrofilu procentuālais daudzums, kas izraisīja fagocitozi neitrofilu populācijā (pHrodo plus ), un neitrofilu fagocītu spēja tika norādīta ar vidējo fluorescējošu intensitāti (MFI). Lai novērtētu sistēmisko iekaisuma reakciju uz ex vivo Gram- negatīva baktēriju iedarbība, 294 μl pilnas asinis tika inkubētas ar TLR4 agonistu (lipopolisaharīdu (LPS), E.coli O127:B8, Sigma Aldrich, St. Louis, MI, ASV) 5 stundas pie 37 grādiem, 5 procentiem CO. Stimulētās un nestimulētās asinis pēc tam centrifugēja ar ātrumu 2000 × g, 4 grādiem 10 minūtes, un plazmas supernatantos tika analizēts audzēja nekrozes faktors (TNF) un interleikīns (IL)-10, izmantojot ELISA (porcine Specific Duoset Kits, R&D). Systems, Abingdon, Apvienotā Karaliste), ievērojot ražotāja norādījumus. Plazmas paraugi pirms analīzes tika atšķaidīti 2-2,5 reizes. Lai aprēķinātu vidējo citokīnu līmeni un attiecības, tika iekļauti tikai paraugi ar citokīnu absorbcijas līmeni standarta diapazonā. Tomēr paraugiem, kuru citokīnu absorbcijas līmenis bija zemāks par zemāko standartu, bet augstāks par tukšo paraugu, tika piešķirta patvaļīga vērtība, kas bija puse no zemākā noteiktā līmeņa plāksnē, un tie tika iekļauti statistiskajā analīzē.
2.7. Agrīna motora attīstība, uzvedība un izziņa
Laiks, kas nepieciešams pirmās stāvēšanas un pirmās pastaigas laikā pēc dzimšanas, tika mērīts kā pamata motorisko prasmju apguves aplēses. Kustības jutīgas infrasarkanās kameras, kas uzstādītas virs katra mājas būra, nepārtraukti reģistrēja cūku motorisko aktivitāti no 1. dienas pulksten 21:00 pēcpusdienā, kad cūkas bija pilnībā atveseļojušās no mātes anestēzijas līdz 11. dienai[33]. Vidējā aktīvā laika proporcija stundā tika aprēķināta no 12-stundu intervālu ierakstiem dienas laikā (9:00 no rīta līdz 9:00 vakarā) un naktī (no 9:{{12). }} līdz 9:00. Katras cūkas izpētes uzvedība tika novērtēta 9. dienā atklātā lauka arēnā (1,2 m × 1,2 m) ar videokameras ierakstu no putna skata {{ 20}}min ierakstīšanas periods ar cūkām randomizētā secībā. Divi akli novērotāji cūkām piešķīra reāllaika kopējo punktu skaitu, pamatojoties uz četriem objektīviem parametriem: saskare ar grīdu, saskare ar sienu, bēgšanas mēģinājumi un vairākas gaitas. Pēc tam iegūtie videoklipi tika analizēti, izmantojot EthoVision XT10 (Noldus Information Technology, Wageningen, Nīderlande). Rezultāti bija kopējais pārvietotais attālums un katrai cūkai aprēķināts ātrums. Pēc adekvātas redzes attīstības un pieraduma perioda katras cūkas telpiskā izziņa tika novērtēta randomizētā secībā dienās 12-18, izmantojot standartizēto telpiskā T veida labirinta izziņas testu [44]. No hipokampa atkarīgā mācīšanās un atmiņa tika pārbaudīta 1-2 iegūšanas laikā dienā, katrā no kurām bija 10 izmēģinājumi. Cūkām tika izmantotas papildu labirinta vizuālās norādes, lai tās varētu pārvietoties, lai atrastu fiksētu piena atlīdzību. Tika izmantotas mainīgas cūku sākuma pozīcijas, lai izvairītos no egocentriskiem reakcijas mehānismiem, un piens tika ievietots abās atlīdzības grupās. Lai maskētu ožas signālus, piens bija pieejams tikai vienā no rokām. Pareizo izvēļu skaits vienam ieguvumam tika reģistrēts standarta fāzē (iegūšanas 1-6, dienas 12-17) un apvērsuma fāzē (iegūšanas 7-9, dienas 17-18). Apvērsuma fāzē piena atlīdzība tika mainīta uz pretējo roku. Vismaz 80 procenti pareizo izvēļu (8 pareizās izvēles no 10 izmēģinājumiem) tika definētas kā mācīšanās kritērijs [30].
2.8. Statistiskā analīze
Visām statistiskajām analīzēm tika izmantota statistikas programmatūra R (versija 3.6.0). Antibakteriālajam testam tika analizētas S. augšanas atšķirības starp 6 testa diētām un mākslīgo maisījumu zīdaiņiem 2-24 h inkubācijas laikā, izmantojot lineāru jauktu efektu modeli (Ime funkcija) ar inokulācijas devu, laiku un testa diētu. /formula kā fiksēti efekti (ieskaitot mijiedarbību starp pēdējiem diviem) un eksperimentālais periods kā nejaušs efekts, kam seko pāru salīdzinājumi katrā laika punktā (ls nozīmē paketi). Nepārtraukti atkārtoti mērījumi no cūku pētījuma (ti, ķermeņa svars, mājas būra aktivitāte, pareizas izvēles telpiskā T veida labirinta izziņas testā un tievās zarnas parametri, kas mērīti vairākos reģionos), tika analizēti, izmantojot lineāro jaukto efektu modeli (man funkcija). iekļaujot atbilstošo korelācijas struktūru un cūku kā nejaušu efektu. Iepakojums veicināja turpmākus salīdzinājumus katrā tievās zarnas reģionā. Tika izmantots Koksa proporcionālais bīstamības modelis (funkcija), lai iegūtu nepārtrauktus datus par laiku līdz notikumam (ti, pamata motorisko prasmju apguvei un pirmo reizi, kad parādās caureja). Visi pārējie nepārtrauktie dati tika analizēti, izmantojot daudzkārtējas lineārās regresijas modeli (lm funkcija). Holma korekcija tika piemērota visiem asins bioķīmijas datiem, lai labotu vairākkārtēju salīdzināšanas testu un kontrolētu ģimenes kļūdu līmeni. Diskrēti dati par laiku līdz notikumam (ti, to cūku procentuālā daļa, kuras sasniedza T-labirinta mācīšanās kritēriju) tika analizēti, izmantojot vispārinātu vairākkārtējas lineārās regresijas modeli (funkciju) ar binomiālu reakciju un papildu log-log saiti. Dzimums, metiens un dzimšanas svars pirms pētījuma tika identificēti kā bioloģiski nozīmīgi potenciālie sajauktāji un tādējādi iekļauti kā fiksēta ietekme visos iepriekš minētajos modeļos. Turklāt visiem asins bioķīmiskajiem un hematoloģiskajiem parametriem sākotnējie līmeņi, kas izmērīti 1. dienā pirms grupu randomizācijas, tika iekļauti kā fiksēti efekti attiecīgajos daudzkārtējās lineārās regresijas modeļos. Lineārās regresijas modeļu modeļu validācija tika veikta, grafiski attēlojot atlikumu un piemēroto vērtību normalitāti un homoskedasticitāti, un, ja nepieciešams, tika veiktas datu transformācijas (log vai sqrt), lai apmierinātu šos pieņēmumus. Mainīgajiem lielumiem, kas nevarēja atbilst normālajam sadalījumam, tika izmantots neparametrisks Manna-Vitnija tests. Regresijas modeļi ar kategoriskiem atbildes mainīgajiem tika apstiprināti, pētot kumulatīvos atlikumus, izmantojot (paketes) atbilstības testu. Ja nav norādīts citādi, neapstrādātie dati tiek parādīti kā vidējie ± SD un p vērtības<0.05 are="" considered="" statistically="">
3. Rezultāti
3.1. In vitro antibakteriālais tests
Tika novērtēta liellopu vājpiena, kas papildināts ar OPN dažādās koncentrācijās, ietekme uz S. augšanu un dzīvotspēju un salīdzināta ar mākslīgo piena maisījumu zīdaiņiem. Pēc 4, 6 un 24 h inkubācijas ar mākslīgo maisījumu zīdaiņiem S. koncentrācija palielinājās attiecīgi par aptuveni 10, 50 un 1 × 10 plus reizes abām inokulācijas devām (10) un 10 grādu FU ). Nebija nekādu atšķirību starp 6 testa diētām un formulu pirms 4 stundu ilgas inkubācijas ar inokulācijas devu 105 KVV (2. attēls). Tomēr, salīdzinot ar mākslīgo piena maisījumu zīdaiņiem, bija acīmredzama baktericīda iedarbība uz liellopu pienu balstītām diētām, jo S. koncentrācija tajās saglabājās statiska 1-4 h inkubācijas laikā. Pēc 4 inkubācijas stundām pēc vienas un tās pašas inokulācijas devas baktēriju skaits bija mazāks visās 6 testa diētās, salīdzinot ar formulu (apmēram 10 reizes, p < 0,01).="" opn="" papildinājums="" radīja="" no="" devas="" atkarīgu="" ilgtermiņa="" bakteriostatisku="" iedarbību="" pret="" s.,="" jo="" baktēriju="" skaits="" pēc="" 6="" h="" inkubācijas="" bija="" ievērojami="" zemāks="" testa="" diētās,="" kurās="" bija="" 4="" lielākās="" opn="" devas=""><0.05,10>inokulācijas deva). Tikai nepapildināts vājpiens, inkubējot 6 stundas (105 KVV inokulācijas deva), uz brīdi zaudēja savu spēju novērst baktēriju augšanu. 24 stundu inkubācijas laikā baktēriju skaits bija mazāks visās 6 testa diētās, salīdzinot ar formulu (p<001, 105="" cfu="" inoculation="" dose).="" all="" 6="" test="" diets="" exerted="" bacterial="" inhibitory="" effects="" (initially="" bactericidal)="" against="" s.,="" inoculated="" at="" 10°cfu,="" at="" all="" tested="" time=""><2 h="" of="" incubation=""><0.07,>2 h inkubācijas p<>
3.2. Klīniskie un izaugsmes rezultāti
Septiņas cūkas (5/21 OPN salīdzinājumā ar 2/21 CON, p=0.4) no 42 cūkām eksperimenta sākumā tika eitanāzētas/nobeigtas ar nenobriedumu saistītu/jatrogēnu komplikāciju rezultātā (
3.3. Zarnu struktūra un funkcija
Villus augstums un kripta dziļums, kas novērtēts tievās zarnas proksimālajā, vidējā un distālajā daļā, abās grupās bija līdzīgs (2. tabula). Salīdzinot ar CON, kopumā augstāka villu un kripta attiecība trīs tievo zarnu reģionos tika mērīta OPN (p<0.05, figure="" 4a).="" similar="" amounts="" of="" proliferative="" enterocytes="" were="" observed="" between="" the="" two="" groups,="" indicated="" by="" the="" same="" relative="" area="" of="" ki-67="" positive="" stained="" nuclei="" in="" the="" three="" small="" intestinal="" regions="" (figure="" 4b,="" c).="" further,="" the="" gastric="" emptying="" ability="" indicated="" by="" the="" gastric="" content="" weights="" at="" euthanasia="" as="" well="" as="" the="" activity="" of="" lactase,="" maltase,="" sucrase,="" apa,="" abn,="" and="" dppiv="" measured="" in="" the="" middle="" part="" of="" the="" small="" intestine="" were="" comparable="" between="" the="" groups="" (table="">
3.4. Asins bioķīmija, hematoloģija un sistēmiskā imunitāte
Nabassaites asiņu paraugi atklāja augstāku kopējo leikocītu un bazofilu skaitu pirmajā dienā (1<0.05)of pigs="" later="" assigned="" the="" opngroup="" relative="" to="" pigs="" assigned="" the="" con="" group.="" no="" other="" immune="" cell="" counts,="" blood="" biochemistry,="" or="" hematology="" variables="" differed="" between="" the="" two="" groups="" prior="" to="" receiving="" their="" specific="" dietary="" interventions(data="" not="" shown).="" blood="" biochemistry="" variables="" measured="" on="" days="" 8="" and="" 19="" did="" not="" differ="" between="" groups(table="" s1,="" supplementary="" materials),="" and="" accompanied="" hematology="" parameters="" and="" immune="" cell="" counts="" are="" presented="" in="" table="" 3.="" compared="" with="" con="" pigs,="" opn="" pigs="" had="" a="" higher="" lymphocyte="" and="" monocyte="" count="" on="" day=""><0.05, figure="" 5a,="" b).="" the="" lymphocyte="" and="" monocyte="" count="" increased="" from="" day="" 8="" to="" day="" 19,="" with="" no="" final="" differences="" between="" the="" groups(figure="" 5a,="" b).="" the="" remaining="" immune="" cell="" counts="" and="" nonimmune-related="" hematological="" parameters="" were="" similar="" between="" opn="" and="" con="" pigs="" (table="" 3).="" innate="" and="" adaptive="" immune="" parameters="" were="" evaluated="" on="" days8="" and="" 19.="" on="" day="" 8,="" the="" blood="" neutrophil="" phagocytic="" rate="" and="" capacity="" were="" similar="" between="" opn="" and="" con="" (table="" 3).="" conversely,="" on="" day="" 19="" they="" had="" a="" higher="" frequency="" of="" neutrophils="" exerting="" phagocytosis="" compared="" with=""><0.05). the="" phagocytic="" capacity="" was="" though="" not="" different="" between="" groups="" (figure="" 5c,="" d).="" the="" t-cell="" subset="" characterization="" on="" days="" 8="" and="" 19="" did="" not="" reveal="" any="" differences="" between="" t="" helper="" cells,="" cytotoxic="" t="" cells,="" and="" regulatory="" t="" cells="" in="" the="" two="" groups="" (table="" 3).="" a="" representative="" facs="" gating="" is="" shown="" in="" figure="" s1,="" supplementary="" materials.="" the="" tlr4-mediated="" il10="" and="" tnf-α="" cytokine="" production="" of="" full="" blood="" from="" days="" 8="" and="" 19="" was="" evaluated.="" tnf-α="" and="" il10="" were="" detected="" at="" similar="" levels="" between="" opn="" and="" con="" in="" unstimulated="" plasma="" obtained="" on="" day="" 8="" and="" there="" were="" no="" group="" differences="" in="" the="" response="" to="" lps="" stimulation="" indicated="" by="" a="" similar="" tnf-α/il10="" ratio(table="" s2,="" supplementary="" materials).="" tnf-α="" was="" not="" detectable="" in="" unstimulated="" plasma="" obtained="" on="" day="" 19="" from="" either="" group.="" however,="" both="" groups="" responded="" equally="" to="" lps="" stimulation,="" indicated="" by="" similar="" tnf-α="" and="" il-10="" plasma="" levels="" (table="" s2,="" supplementary="">
3.5. Smadzeņu strukturālais un funkcionālais rezultāts
Ar smadzenēm saistītie strukturālie rezultāti, tostarp kopējā smadzeņu svara, reģionālā smadzeņu svara un smadzeņu ūdens satura absolūtās un relatīvās vērtības, bija līdzīgi OPN un CON grupās (4. tabula). Agrīnās motorikas attīstības atšķirības netika novērotas, jo laiks līdz pirmajai stāvēšanai, pirmā pastaiga un pirmā brīvprātīga pilna piena bolus uzņemšana, kā arī aktīvā laika īpatsvars mājas būros tika mērīts ar kustību jutīgām kamerām no Days { {3}}, bija līdzīgi starp OPN un CON (6.A-D attēls). Cūku izpētes uzvedība, kas novērtēta atklātā lauka arēnā 9. dienā, bija salīdzināma starp abām grupām, jo kopējais rezultāts, kopējais pārvietotais attālums un ātrums bija līdzīgi (4. tabula). Turklāt līdzīga kognitīvā veiktspēja tika novērota standarta un apvērsuma fāzē telpiskā T veida labirinta izziņas testā, kas tika veikts 9 iegūšanas laikā no 12-līdz 18. dienai (7.A, B attēls). Vidējais pareizo izvēļu īpatsvars laika gaitā palielinājās abās grupās abās fāzēs (7.A attēls). Standarta fāzē gan OPN, gan CON sasniedza iepriekš definēto mācību kritēriju 5. apguvei (80 procenti pareizo izvēli, 7.A attēls). Visas cūkas sasniedza mācīšanās kritēriju, un laiks, kas vajadzīgs, lai sasniegtu mācīšanās kritēriju, neatšķīrās (7.B attēls).
4. Diskusija
OPN daudzfunkcionālā iedarbība, jo īpaši attiecībā uz tās proliferatīvo, imūno regulējošo un antibakteriālo aktivitāti, bet, iespējams, arī atbalstot smadzeņu attīstību, var palīdzēt uzlabot jutīgu jaundzimušo un zīdaiņu veselību un orgānu attīstību. Augstais OPN līmenis agrīnā mātes pienā un atbilstošā zīdaiņu OPN koncentrācija plazmā veicina pietiekamu OPN piegādi tūlītējā jaundzimušā periodā, kad zīdaiņi tiek baroti ar mātes pienu [5]. Gluži pretēji, zemāka OPN koncentrācija liellopu pienā un mākslīgajos maisījumos zīdaiņiem 4 nodrošina iespēju palielināt OPN saturu piena maisījumos, un papildināšana ar OPN var palīdzēt samazināt attīstības atšķirības, kas pastāv starp mākslīgo barošanu un mātes pienu. -baroti zīdaiņi [2,3]. Šajā pētījumā mēs parādījām, ka OPN pievienošana liellopu piena diētai ar bazālo OPN saturu bija labi panesama, taču tika novēroti tikai nelieli zarnu struktūras un sistēmiskās imunitātes uzlabojumi, un netika novērota turpmāka ietekme uz smadzeņu struktūru un darbību. Liellopu piena bāze tika izvēlēta, lai nodrošinātu atbilstošu bioaktīvo bāzes diētu salīdzinājumā ar piena maisījumu, kam papildus zemākam OPN saturam ir arī samazināta bioaktivitāte. Piena OPN ir atzīts par svarīgu bioloģiski aktīvu sūkalu proteīnu, galvenokārt pateicoties tā spējai modulēt imunitāti un stimulēt šūnu proliferāciju [18,45]. OPN spēja veidot kompleksus ar pienā atrodamo pozitīvi lādēto laktoferīnu var pievienot papildu funkcionālās īpašības, veicinot aizsardzību pret patogēniem zīdaiņa zarnās [10]. OPN-laktoferīna komplekss ir atrodams cilvēka un liellopu pienā, bet var veidoties arī no atsevišķiem proteīniem [10]. Lai dokumentētu OPN bioaktīvo potenciālu diētā uz liellopu piena bāzes, mēs sākotnēji pārbaudījām liellopu piena OPN antibakteriālo spēju in vitro, kas dažādās koncentrācijās tika pievienots sterilam vājpienam. Mūsu rezultāti liecina, ka OPN papildinātās piena diētas nodrošina gan īstermiņa, gan ilgtermiņa antibakteriālas spējas atkarībā no devas, inhibējot S.epidermidis, kas ir izplatīts jaundzimušo patogēns, kas izraisa novēlotu sepsi pēc zarnu translokācijas, augšanu [46,47 ]. Tas sniedz iespēju stimulēt zarnu attīstību, OPN papildinot jaundzimušo piena diētu. Optimālais OPN līmenis diētās, kuru pamatā ir piens, nav skaidrs, un OPN satura atšķirības mātes pienā ir lielas gan starp mātēm un valstīm, gan laktācijas periodā [7. Iepriekšējie pētījumi ar dzīvniekiem galvenokārt ir pētījuši OPN pievienošanas ietekmi kontroles diētai bez OPN tādā līmenī, kas ir salīdzināms ar vidējo cilvēka piena saturu [14, 22, 24]. Šajā preklīniskajā cūku pētījumā mēs koncentrējāmies uz klīniski nozīmīgo aspektu, pievienojot vairāk OPN diētai ar bazālo OPN līmeni, lai sasniegtu augstu cilvēka piena līmeni. OPN papildinājums šajā pētījumā palielināja OPN dienas devu līdz devai, kas atbilst zīdaiņiem no mātēm ar relatīvi augstu OPN piena koncentrāciju, un ievērojami pārsniedz to, ko parasti saņem no mākslīgā piena maisījuma zīdaiņiem[4]. OPN saturs savāktajā Džersijas pienā izrādījās ar augstāku OPN saturu nekā iepriekš mērīts liellopu pienā. Ir svarīgi atzīmēt, ka izmantotā LC-MS/MS metode atšķiras no iepriekšējos pētījumos izmantotās ELISA metodes [48]. Kognitīvās ietekmes trūkums pašreizējā pētījumā var būt saistīts ar faktu, ka kontroles cūkas jau saņem OPN 91 mg/l koncentrācijā, kas raksturīga Džersijas pienam, un papildu OPN papildinājums nesniedz papildu priekšrocības. Mēs noskaidrojām, ka liellopu piena papildināšana ar OPN bija labi panesama un radīja nelielu ietekmi uz zarnu un imūnsistēmas nobriešanu, savukārt smadzeņu strukturālie un funkcionālie parametri nemainījās. Gan OPN, gan CON cūku augšanas ātrums bija salīdzināms ar vai augstāks nekā parasti tiek novērots priekšlaicīgi dzimušiem sivēniem līdzīgos pētījumos ar liellopu piena diētu [49-51]. Šo priekšlaicīgi dzimušo cūku augšanas ātrums un salīdzinoši labs klīniskais stāvoklis ar zemu NEC punktu skaitu nodrošināja optimālus apstākļus, lai dokumentētu uztura ietekmi uz orgānu funkciju izmaiņām un smadzeņu kognitīvo attīstību jutīgiem jaundzimušajiem.
Pastāv liela līdzība starp cilvēku, govju un cūku OPN sekvencēm [52], un OPN visuresošais raksturs ir labi pierādīts cūkām. OPN izsaka dažādi veseli cūku audi ar vislielāko pārpilnību ileālajos audos [53], bet koncentrācija cūku pienā nav zināma. Iepriekš mēs esam parādījuši nelielu OPN bagātinātās formulas labvēlīgo ietekmi uz zarnām priekšlaicīgi dzimušiem sivēniem saistībā ar atveseļošanos no pirmsdzemdību iekaisuma [43]. Kopumā tas uzsver sivēna izmantošanu kā preklīnisku modeli, lai izpētītu uztura OPN papildināšanas ietekmi. Salīdzinot ar CON, OPN cūkām bija augstāka villu un kripta attiecība visā tievajā zarnā. Tika ziņots par līdzīgu morfoloģisku atšķirību, pamatojoties uz divpadsmitpirkstu zarnas paraugiem no 10-dienu veciem peļu mazuļiem, kurus baro savvaļas tipa mātītes vai OPN izsitumu mātītes, kas papildinātas ar liellopu piena OPN, salīdzinot ar peļu mazuļiem, kas nesaņēma OPN[22]. Iepriekšējie priekšlaicīgi dzimušo cūku pētījumi ir korelējuši palielinātu bārkstiņu augstumu ar uzlabotu barības vielu, piemēram, galaktozes, absorbcijas spēju [51,54], kas var būt izšķiroša, lai nodrošinātu optimālu augšanu. Izmantojot cūku IPEC-J2 šūnu līniju, mēs iepriekš in vitro esam pierādījuši OPN spēju palielināt šūnu proliferāciju atkarībā no devas [43]. Uzlaboto zarnu gļotādas struktūru, kas novērota OPN cūkām šajā pētījumā, nevarēja izskaidrot ar proliferatīvo enterocītu pieaugumu, pamatojoties uz Ki-67 krāsojumu tievajās zarnās, un tas neizraisīja izmaiņas gremošanas enzīmu aktivitātēs. Agrākie atklājumi jaundzimušajiem rēzus pērtiķiem, kas baroti ar mākslīgo barošanu ar OPN, liecina, ka zarnu izmaiņas ar tukšās zarnas gēnu ekspresijas profiliem ir līdzīgākas ar krūti barotiem līdziniekiem [12]. Tāda pati attīstības trajektorija attiecībā uz imūno šūnu skaitu tika novērota OPN un CON cūkām. Visas imūnās šūnas, izņemot bazofilu un eozinofilu skaitu, ar līdzīgi zemu līmeni sivēniem [34], palielinājās no 8. līdz 19. dienai, kas liecina par abu grupu pastiprinātu spēju radīt pietiekamu imūnreakciju pret potenciālo patogēnu. OPN cūku cirkulējošo monocītu un limfocītu līmenis 8. dienā bija augstāks salīdzinājumā ar CON cūkām, bet ne 19. dienā. Tā kā klīniskais stāvoklis abās grupās cūkām bija līdzīgs un NEC rādītāji bija zemi, monocītu un limfocītu līmenis, iespējams, galvenokārt ir saistīts ar ārstēšanu. ietekmi un liecina par paātrinātu imūnsistēmas attīstību OPN cūkām. Lielāks cirkulējošo monocītu īpatsvars tika novērots arī randomizētā kontrolētā pētījumā ar sešus mēnešus veciem zīdaiņiem, kuri saņēma mākslīgos maisījumus ar pievienotu liellopu pienu OPN koncentrācijās 65 mg/l un 135 mg/l, salīdzinot ar kontroles grupām, kas barotas ar krūti [55]. OPN spēj mijiedarboties ar imūnās šūnām caur savu receptoru un darboties kā ķīmijtaktisks līdzeklis IL-1-aktivētiem monocītiem, kas var būt fizioloģiski nozīmīgi iekaisuma laikā [16]. OPN var vēl vairāk spēlēt lomu iedzimtajā imunitātē, mediējot fagocitozi caur integrīna receptoru ox 2, kas izteikts uz monocītu virsmas [16]. Vēl ir jāizpēta turpmāki pētījumi, kas pēta OPN lomu monocītu funkcijā un to, kā tas izpaužas kā ieguvums ar mākslīgo maisījumu barotiem zīdaiņiem.
T-šūnu apakškopu raksturojums tika veikts 8. un 19. dienā, lai sīkāk aprakstītu limfocītu populāciju, bet neatklāja nekādas atšķirības apakšgrupu frakcijās starp abām grupām šajā tiešajā jaundzimušo periodā. Zīdaiņiem, kuri ir saņēmuši mākslīgo maisījumu zīdaiņiem, kas papildināti ar OPN (65 vai 130 mg/l), pirmajos sešos dzīves mēnešos ir novērots palielināts T-šūnu īpatsvars, salīdzinot ar barotu pamata maisījumu [55]. Šī reakcija var nebūt izstrādāta jau pirmajās dzīves nedēļās, vai arī salīdzinoši augstais OPN līmenis mūsu liellopu pamatpienā (91 mg/L) var ierobežot turpmākās izmaiņas. T-šūnu, palīg-T-šūnu un citotoksisko T-šūnu skaits neatšķīrās starp OPN un CON, un tāpēc nevar izskaidrot atšķirības cirkulējošo limfocītu skaitā starp abām grupām 8. dienā. Šajā pētījumā mēs iekrāsojām CD3, CD4, CD8 un Foxp3, un vēl ir jāizpēta, vai lielāks limfocītu skaits varētu būt saistīts ar lielāku B šūnu skaitu vai palielinātu dabisko slepkavu šūnu skaitu. Sistēmiskā imunitātes nobriešana pēc dzimšanas ietver Th1/Th2 līdzsvara maiņu, kur aizsardzībai pret bakteriālām infekcijām nepieciešama Th1 novirze [17]. OPN ir spēcīgs ķīmijatraktants ar citokīniem līdzīgām īpašībām, un ir zināms, ka tas regulē Th1/Th2 līdzsvaru [18]. Šajā pētījumā Th1/Th2 līdzsvaru neilgi pēc piedzimšanas nemodulēja uzturs, uz ko liecina līdzīga TNF-/IL10 attiecība 8. dienā. Tā kā TNF-o līmenis netika konstatēts nestimulētos plazmas paraugos no 19. dienas, TNF-/IL10 koeficientu šajā brīdī nevarēja aprēķināt. Nesen pētījumos, izmantojot dzīvnieku modeļus [14, 22, 24], ir pētīta piena OPN nozīme neironu attīstībā zīdaiņa vecumā. Izmantojot OPN knockout peles modeli, ir pierādīts, ka piens ar OPN līmeni, kas ir līdzīgs cilvēka pienam, uzlabo motorisko prasmju attīstību un no hipokampa atkarīgās atmiņas spējas 30-dienu veciem peļu mazuļiem, salīdzinot ar OPN deficīta uztura kontrolierīcēm. Šie ar uzturu saistīto OPN funkcionālie smadzeņu rezultāti bija saistīti ar paaugstinātu endogēno smadzeņu OPN līmeni un augstāku nervu / glia antigēna divu šūnu proliferāciju un diferenciāciju oligodendrocītos, kā rezultātā palielinājās ar mielīnu saistīto proteīnu ekspresija. Līdzīgā eksperimentālā iestatījumā savvaļas tipa peļu mazuļiem, kurus baroja OPN nokautas mātītes un kuriem tika dots papildu liellopu piens OPN (12 ug/g), bija lielāka atmiņas spēja nekā bezpapildinātām kontrolēm [22]. Kopumā šie rezultāti liecina, ka pienam OPN ir svarīga loma neirokognitīvajā attīstībā un ka liellopu pienam OPN var būt tik labvēlīga ietekme uz dažādām sugām. Mēs atklājām līdzīgu attīstību pamata motorisko prasmju apgūšanā, mājas būra aktivitātēs un izpētes uzvedībā atklātā lauka arēnā starp grupām. Grupu sniegums telpiskā T-labirinta testā vēl vairāk norādīja uz līdzīgu no hipokampa atkarīgu mācīšanos un atmiņu un līdz ar to arī kognitīvām spējām. Mūsu atklājumi ir saskaņā ar nesen veiktu pētījumu, kurā tika salīdzināti divas dienas veci sivēni, kas saņēma uz sojas proteīnu balstītu maisījumu, kas nesatur OPN vai tika papildināts ar 250 mg/l liellopu piena OPN [24]. Tika konstatētas tikai ierobežotas uzvedības atšķirības starp abām grupām, kas tika novērtētas, veicot jaunu objektu atpazīšanas uzdevumu, kas tika veikts 30. pēcdzemdību dienā. Tas nozīmē, ka vismaz veselām, pēcdzemdību periodā dzimušām cūkām OPN piena papildināšana vēl vairāk neuzlabo ar smadzenēm saistīto attīstību, ko mēra jaunu objektu atpazīšana. Līdzīgi kā telpiskā T veida labirinta testā [44], jaunais objektu atpazīšanas uzdevums tiek uzskatīts par atkarīgu no hipokampa, un tāpēc šie uzvedības testi varētu būt jutīgāki tuvāk hipokampu maksimālā augšanas ātruma laikam, kas notiek cūku tēviņiem un mātītēm. aptuveni pēcdzemdību 8. un 3. nedēļā [56]. Nav zināms, vai cūkām vēlākos laika punktos varētu būt dokumentēti ilgtermiņa kognitīvie uzlabojumi pēc piena OPN papildināšanas agrīnā dzīves posmā, kā parādīts peles modeļa pētījumos[14,22].
Attiecībā uz smadzeņu strukturālo attīstību iepriekš tika dokumentēts, izmantojot magnētiskās rezonanses attēlveidošanu, ka uztura OPN papildinājums palielināja smadzeņu reģionālo tilpumu skaitu pēc normalizācijas līdz kopējam smadzeņu tilpumam [24]. Šajā pētījumā mēs neatradām nekādas diētas izraisītas atšķirības smadzeņu reģionālā svarā, ne absolūtajā svarā, ne attiecībā pret kopējo smadzeņu svaru. Tāpēc mēs neveicām padziļinātu analīzi, piemēram, ar mielīnu saistīto proteīnu, piemēram, mielīna bāzes proteīna un ar mielīnu saistītā glikoproteīna, gēnu ekspresijas līmeņu mērīšanu [14, 23]. Iepriekš ir dokumentēts, ka eksogēnai OPN piemīt neiroprotektīvas īpašības, mazinot intracerebrālas asiņošanas izraisītu neiroiekaisumu, kas uzlabo neiroloģiskos rādītājus [57I. Ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai noskaidrotu, vai piena OPN spēj sniegt labvēlīgu strukturālu un funkcionālu ietekmi uz smadzenēm sistēmisku iekaisuma stāvokļu laikā, ko bieži piedzīvo priekšlaicīgi dzimuši zīdaiņi [26]. Tas neietilpa pašreizējā pētījuma darbības jomā.
5. Secinājumi
Priekšlaicīgi dzimušu cūku modelī jutīgiem jaundzimušajiem mēs parādījām, ka bioaktīvā liellopu piena diēta, kas papildināta ar papildu liellopu pienu OPN, ir labi panesama un izraisīja nelielus uzlabojumus zarnu struktūrā un sistēmiskā imunitātē, bez turpmākas ietekmes uz smadzeņu strukturālo vai funkcionālo attīstību. Papildināšanai ar OPN, kas pārsniedz to, ko saņem no liellopu bazālā piena, tādējādi sasniedzot augstāko fizioloģisko līmeni, ko zīdaiņi dabiski saņem no mātes piena, var ierobežoti ietekmēt zarnu, imunitāti un smadzeņu attīstību jutīgiem jaundzimušajiem tiešā jaundzimušo periodā. . Joprojām ir jānosaka papildu informācija par piena OPN piedevu priekšrocībām liellopu piena mākslīgajos maisījumos zīdaiņiem, lai stimulētu kompromitētu jaundzimušo attīstību.
