Aril ogļūdeņraža receptoru signalizācijas ceļa ietekmes uz Junín vīrusa replikāciju modulācija 1. daļa

Abstract:

Junín vīruss (JUNV), kas ir Arenaviridae ģimenes loceklis, ir Argentīnas hemorāģiskā drudža etioloģiskais izraisītājs, kas ir endēmiska slimība Argentīnas lauku reģionā, kurai trūkst specifiskas ķīmijterapijas. Arilogļūdeņraža receptors (AHR) tiek ekspresēts vairākos zīdītāju audos, un tas ir norādīts kā mainīgu avotu ligandu sensors un šūnu imūnās atbildes modulators.

Junin vīruss ir rets vīruss, kas ietekmē cilvēka imūnsistēmu un izraisa smagu imūnreakciju. Tomēr imunitāte nav vienīgā stratēģija, kas nespēj cīnīties ar Junin vīrusu.

Pirmkārt, pietiekami atpūsties un gulēt ir svarīgi, lai jūsu imūnsistēma būtu vesela. Miega laikā organisms atbrīvo vielas, ko sauc par citokīniem, kas palīdz imūnsistēmai efektīvāk reaģēt uz vīrusiem un citiem ārējiem draudiem.

Otrkārt, veselīgi ēšanas paradumi ir arī imunitātes uzlabošanas atslēga. Ēdot pārtiku, kas bagāta ar C un D vitamīnu, piemēram, citrusaugļus un sēnes, var uzlabot ķermeņa imūnreakciju.

Turklāt mērens vingrinājums var arī uzlabot imunitāti. Pareiza fiziskā slodze var palielināt balto asins šūnu skaitu organismā, tādējādi uzlabojot imūnsistēmas spēju.

Visbeidzot, labs garīgais stāvoklis ir ļoti svarīgs arī imūnsistēmas veselībai. Stress un trauksme var ietekmēt ķermeņa imūnreakciju, tāpēc ir svarīgi palikt atslābinātam un pozitīvam.

Īsāk sakot, lai gan Junin vīruss ietekmē imūnsistēmu, uzlabojot savu dzīvesveidu un saglabājot pozitīvu attieksmi, mēs varam uzlabot savu imunitāti un efektīvi novērst un reaģēt uz vīrusu uzbrukumiem. No šī viedokļa mums ir jāuzlabo imunitāte. Cistanche var būtiski uzlabot imunitāti, jo gaļas pelni satur dažādus bioloģiski aktīvus komponentus, piemēram, polisaharīdus, divas sēnes, Huang Li u.c.. Šie komponenti var stimulēt imūnsistēmu Dažāda veida sistēmas šūnas, palielināt to imūno aktivitāti.

Noklikšķiniet uz cistanche deserticola papildinājuma

Interesanti, ka jaunākie pētījumi liecina, ka AHR signalizācijas ceļa aktivizēšanai vai nomākšanai var būt nozīme dažādu cilvēku vīrusu infekciju iznākumā. Šajā ziņojumā tika analizēta AHR farmakoloģiskās modulācijas ietekme uz JUNV in vitro infekciju. Sākotnējā mikroarray skrīnings parādīja, ka AHR ceļš tika pārmērīgi ekspresēts JUNV inficētajās aknu šūnās.

Vienlaikus Vero un Huh{0}} šūnu inficēšanās ar JUNV celmiem IV4454 un Candid#1 tika būtiski inhibēta no devas atkarīgā veidā, apstrādājot ar CH223191, specifisku AHR antagonistu, kā noteikts infekciozitātes pārbaudēs. laika RT-PCR un vīrusu proteīnu imunofluorescences noteikšana. Turklāt šķiet, ka AHR provīrusu loma JUNV infekcijā nav atkarīga no IFN-I ceļa. Mūsu atklājumi atbalsta daudzsološās AHR farmakoloģiskās modulācijas perspektīvas kā potenciālu AHF kontroles mērķi.

Atslēgvārdi:

Arilogļūdeņraža receptors; Junín vīruss; arena vīruss; Argentīnas hemorāģiskais drudzis; saimnieka terapeitiskais mērķis.

1. Ievads

Pašlaik arvien vairāk pierādījumu apstiprina, ka arilogļūdeņraža receptors (AHR) ir svarīgs saimniekorganisma imūnās atbildes modulators, un šī īpašība veicina atšķirīgus infekciju klīniskos iznākumus indivīda un populācijas līmenī [1,2]. AHR ir citoplazmas receptors, kas visur izpaužas zīdītāju audos un darbojas kā sensors visdažādākajiem endogēniem un eksogēniem ligandiem ar dažādu izcelsmi, piemēram, piesārņotājiem, uzturu, mikrobiomu un saimniekorganisma metabolismu [3–5].

Patiešām, ir stingri norādīts, ka AHR lielā mērā ietekmē vides faktoru un vīrusu infekciju mijiedarbību [1, 2]. Kad AHR atpazīst ligandu molekulu, tā tiek pārvietota uz kodolu, kur tā heterodimerizējas ar arilogļūdeņraža receptoru kodoltranslokatoru un regulē ksenobiotiskā metabolisma gēnu (CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1) ekspresiju.

AHR var mijiedarboties arī ar citiem transkripcijas faktoriem, piemēram, NF-kB, lai modulētu plašu signalizācijas ceļu klāstu, tostarp tos, kas iesaistīti imūnreakcijā [6–8]. AHR var modulēt imūnregulējošo gēnu ekspresiju un mainīt iekaisuma dendritisko šūnu un T-šūnu diferenciācijas ceļus [9–11].

Nesenie mūsu pētnieku grupas veiktie pētījumi ir parādījuši, ka AHR signalizācijas ceļa aktivizēšanai ir provīrusu loma Zikas (ZIKV), tropu drudža (DENV) [12] un smaga akūta respiratorā sindroma koronavīrusa 2 (SARS-CoV{{) laikā. 4}}) infekcijas [13]. Ņemiet vērā, ka tika apstiprināts, ka AHR inhibīcija izraisīja vīrusu replikācijas samazināšanos šajos vīrusu modeļos, parādot, ka AHR ir daudzsološa pretvīrusu stratēģija.

Junín vīruss (JUNV) ir apvalkots segmentēts RNS genoma vīruss no Arenaviridae ģimenes [14]. Katrs RNS segments kodē divus proteīnus pretējos virzienos. No vienas puses, lielais segments (L RNS) kodē no RNS atkarīgo RNS polimerāzi (L) un matricas proteīnu (Z).

No otras puses, mazais segments (S RNS) kodē nukleoproteīnu (NP) un glikoproteīna prekursoru (GPC), ko proteāzes šķeļ, lai iegūtu trīs apakšvienības (GP1, GP2 un signālpeptīdu SSP), kas ir tiek turēti kopā, veidojot glikoproteīna kompleksu [14].

JUNV ir Argentīnas hemorāģiskā drudža (AHF) [15], endēmiskas slimības, kas skar lauku strādniekus Argentīnas mitrajā Pampa reģionā, etioloģiskais izraisītājs. Ņemiet vērā, ka AHF raksturīga iezīme ir plašais klīnisko simptomu klāsts, ko rada inficēti pacienti. Asimptomātiska vai viegla slimība ar gripai līdzīgiem simptomiem rodas 70–80% infekciju. Tomēr smagi gadījumi ietver hemorāģiskas un neiroloģiskas komplikācijas ar mirstības līmeni no 20 līdz 30 procentiem no hospitalizētiem pacientiem [15].

Svarīgi, ka dzīva novājināta vakcīna ar nosaukumu Candid#1 ir izrādījusies ļoti efektīva smagu AHF gadījumu profilaksē [15,16]. Tomēr vienīgā pieejamā ārstēšana pret slimību ir imūnplazmas ievadīšana no atveseļošanās stadijā esošiem pacientiem; terapija, kas samazina letālo gadījumu skaitu tikai tad, ja to ievada 8 dienu laikā pēc pirmo simptomu parādīšanās [17].

Lai gan pēdējos gados ir savākti vairāki pierādījumi par AHR ietekmi infekciju laikā, joprojām nav skaidru pierādījumu par tā lomu arēnavīrusu infekciju laikā [2].

Tā kā lauku iedzīvotāji ir pastāvīgi pakļauti AHR ligandiem, piemēram, piesārņotājiem no lauksaimniecības nozares, piemēram, agroķīmiskām vielām, pesticīdiem un fosilā kurināmā sadegšanas blakusproduktiem [18], šajā darbā mēs novērtējām in vitro AHR farmakoloģiskās modulācijas ietekmi uz šūnu reakcija uz JUNV infekciju un iespējamā AHR izmantošana kā kandidāta mērķis terapeitiskai iejaukšanās AHF slimībā.

2. Materiāli un metodes

2.1. Šūnu līnijas

Tika izmantotas šādas šūnu līnijas: Huh-7 (JCRB šūnu banka Nr. 0403) un HepG-2 ATCC HB8065, divas no cilvēka hepatocītiem atvasinātas karcinomas šūnu līnijas; Vero ATCC CCL-81, no pērtiķiem iegūta nieru epitēlija šūnu līnija. Katra šūnu līnija tika kultivēta Eagle's Minimum Essential Medium (MEM) (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ASV), kas papildināta ar 5 procentiem jaundzimušā teļa seruma (NBCS) (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ASV) un papildināta ar 50 µg/ml gentamicīna (Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, ASV), 1 mM nātrija piruvāta (Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, ASV), 2 mM L-glutamīna (Gibco, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ASV) un buferēts ar HCl/NaHCO3. Šūnu līnijas tika kultivētas un uzturētas 37 ◦C temperatūrā ar 5% CO2 atmosfēru.

2.2. Vīrusu celmi

Tika izmantoti šādi vīrusu celmi: dabiski novājināts IV4454 celms, kas iegūts no vieglas AHF gadījuma cilvēkiem [19], un ar vakcīnu novājināts Candid#1 celms [20]. Vero šūnas tika izmantotas gan vīrusu krājumu ģenerēšanai, gan vīrusu titrēšanai, izmantojot standarta plāksnes testu.

Viss darbs ar infekcijas izraisītājiem tika veikts bioloģiskās drošības 2. līmeņa telpās, un to apstiprināja Buenosairesas Universitātes Zinātņu skolas Vides veselības un drošības birojs. Visi inficēšanās procedūrās iesaistītie darbinieki tika vakcinēti ar Candid-1, ko nodrošināja Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas Dr. JI Maiztegui (Pergamino, Buenosairesa, Argentīna).

2.3. Mikromasīvu analīze

Pavisam 5 × 105 HepG2 šūnas tika iesētas 25 cm2 kultivēšanas kolbās un inficētas ar JUNV IV4454 ar infekcijas daudzuma (MOI) 1 vai imitācijas infekciju. RNS tika ekstrahēta un attīrīta, izmantojot RNAeasy (Qiagen, Hilden, Vācija) 24 un 48 stundas pēc inficēšanās (pi). RNS koncentrācijas tika mērītas, izmantojot Nanodrop. HepG2 šūnu gēnu ekspresijas profili tika raksturoti, izmantojot mikroarray analīzi (Affymetrix Human U133 Plus 2.0 GeneChips), lai identificētu saimniekgēnus, kurus transkripcijas regulē infekcija.

Kopējais saimniekgēnu skaits, ko būtiski regulē infekcija, tika aprēķināts katram laika punktam, identificējot gēnus, kas uzrādīja vismaz 16-kārtīgas ekspresijas izmaiņas un 95 procentu varbūtību, ka tie tiks izteikti atšķirīgi (p {{ 3}}.05).

Programmatūra WebGestalt (http://www.webgestalt.org, atvērta 2020. gada 3. jūlijā), kurā tiek izmantota Wikipathways datubāze, tika izmantota gēnu ontoloģijas un ceļu pārmērīgas reprezentācijas analīzēm. Eksperimentu atkārtojumi tika veikti dažādās dienās (n=3 neatkarīgi eksperimenti katrā stāvoklī).

2.4. Mazu molekulu savienojumi

Sintētiskais AHR specifiskais konkurējošais antagonists CH223191, 1-metil-N-[2-metil4-[2-(2-metilfenil)diazenil]fenil]{ {9}}H-pirazola-5-karboksamīds (Tocris Bioscience, Bristole, Apvienotā Karaliste) tika izšķīdināts dimetilsulfoksīdā (DMSO) un tika izmantots koncentrācijā 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40 un 80 µM.

Triptofāna metabolīts L-kinurenīns (2S)-2-Amino-4-(2-aminofenil)-4-oksobutānskābe (Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, ASV) bija izšķīdināts DMSO un izmantots koncentrācijā 2,5, 5, 10, 20, 40, 80, 160 un 320 µM.

Visas apstrādes tika veiktas bez gaismas, ņemot vērā, ka savienojumiem ir gaismas jutība.

2.5. Šūnu dzīvotspējas testi

Šūnu dzīvotspējas noteikšanai Huh-7 un Vero šūnu vienslāņi tika audzēti 96 iedobju plāksnēs 24 stundas MEM 5% NBCS. Šūnu monoslāņi ar 90 procentu saplūšanu tika apstrādāti ar dažādām CH223191 koncentrācijām (1,25 µM līdz 80 µM) un kinurenīnu (5 µM līdz 320 µM) 72 stundas. Mock tika apstrādāts ar tādu pašu DMSO koncentrāciju kā lielākā ligandu terapijas deva, un to uzskatīja par 100 procentiem no šūnu dzīvotspējas.

Visas procedūras tika veiktas četros eksemplāros. Šūnu dzīvotspēja tika novērtēta ar 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīdu (MTT) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ASV) tests. Absorbcija tika mērīta pie 570 nm FLUOstar OPTIMA mikroplašu lasītājā. Šūnu dzīvotspējas procenti tika noteikti, relativizējot apstrādes absorbcijas rezultātus, izmantojot Mock absorbcijas vērtības.

Turklāt apstrādāto šūnu augšanas spējas un morfoloģija tika pētīta gaismas mikroskopā. Attēli tika uzņemti 72 h ar Nikon Eclipse TS100 mikroskopu; palielinājums: 100×; NA: 0,25.

2.6. Ārstēšana un vīrusu infekcijas

Vero un Huh{{0}} šūnu monoslāņi tika iepriekš apstrādāti ar CH223191 un kinurenīnu, kas atšķaidīts MEM 1,5% NBCS, attiecīgi 1 stundu vai 24 stundas 37 ◦C temperatūrā. CH223191 tika izmantots koncentrācijās no 1,25 līdz 20 µM, savukārt kinurenīns tika izmantots koncentrācijās no 5 līdz 80 µM. Pēc tam vīrusu infekcija tika veikta ar IV4454 vai Candid#1 celmu ar MOI 0,5. Pēc 1 stundas inokulāts tika noņemts un šūnas tika pakļautas abiem savienojumiem 48 stundas minētajās koncentrācijās. Pēc 48 stundām pi supernatanti tika savākti aplikuma noteikšanai, un šūnu monoslāņi tika apstrādāti vai nu netiešai imunofluorescencei, vai RT-qPCR.

2.7. Netiešā imunofluorescence

Huh-7 monoslāņi, kas apstrādāti ar CH223191 vai kinurenīnu un inficēti ar JUNV, kā minēts iepriekš, tika fiksēti pie 48 h pi ar metanolu 10 minūtes pie –20 ◦C, trīs reizes mazgāti ar PBS un uzglabāti svaigā PBS 4 ◦C temperatūrā. līdz apstrādei.

Tika izmantotas šādas antivielas: primārās peles monoklonālās anti-NP antivielas (1:200) (NA05-AG12) [21] un sekundārās Alexa Fluor 488 konjugētās anti-peļu kazas antivielas (1:200) (A{{ 10}}) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, ASV). Šūnu kodoli tika iekrāsoti ar 40,6-diamidino-2- fenilindolu (DAPI) (1:1000) (Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, ASV). Mikroskopijas un fotografēšanas dati tika iegūti, izmantojot Olympus IX71 fluorescences mikroskopu ar pievienotu QImaging Exi-Aqua kameru (pikseļu izmērs: 6,45 µm; fotodetektora laukums: 1392 × 1040 pikseļi2).

Fluorescences datu kvantitatīva noteikšana tika veikta, izmantojot Fidži programmatūru (versija 1.53v) (National Institutes of Health, Bethesda, MD, ASV). DAPI iekrāsotā kodola un NP pozitīvo šūnu manuāla kvantitatīvā noteikšana tika veikta manuāli, izmantojot Fidži programmatūrā iekļauto šūnu skaitītāja spraudni (versija 1.53v). Šūnas tika uzskatītas par pozitīvām, ja varēja noteikt NP vīrusa antigēna krāsošanu. NP-pozitīvo šūnu procentuālais daudzums tika izteikts kā attiecība starp NP-pozitīvām šūnām un kopējo šūnu skaitu katrā laukā, un pēc tam tika noteikts un parādīts vidējais procentuālais daudzums.

NP pozitīvo šūnu fluorescences intensitāte tika iegūta, mērot atsevišķu šūnu vidējo pelēko vērtību un atņemot fona fluorescenci. Vīrusu perēkļi tika norobežoti, ņemot vērā NP-pozitīvo šūnu grupas, kuras ieskauj NP-negatīvas šūnas. Vīrusu perēkļi tika saskaitīti uz 3 dažādiem attēliem no 3 dažādiem nejauši izvēlētiem laukiem, un vidējais perēkļu lielums tika noteikts pēc šūnu skaita, kas tos veidoja.

2.8. Vīrusu nukleīnskābju noteikšana

Nukleīnskābes ekstrakcija tika veikta no inficētiem šūnu monoslāņiem, izmantojot Highway ADN / ARN PuriPrep-VIRUS komplektu K1501 (Inbio Highway, Buenosairesa, Argentīna), saskaņā ar ražotāja norādījumiem. JUNV RNS vīrusu slodzes un šūnu transkriptu kvantitatīvā noteikšana tika veikta ar RT-qPCR. Reversā transkripcija tika veikta, izmantojot izlases primerus un Moloney peles leikēmijas vīrusa reverso transkriptāzi (M-MLV RT).

Fragmentu pastiprināšanai tika izmantoti šādi praimeri: JUNV-np (uz priekšu: 5 0 -GGC ATC CTT CAG AAC ATC-30, reverss: 50 -CGC ACA GTG GAT CCT AGGC{{4} } ), ahr (uz priekšu: 50 -ATC CTT CCA AGC GGC ATA GAG ACC-30; Reverse: 50 -CAA AGA AGC TCT TGG CTC TCA GG-30 ), cyp1a1 ( Uz priekšu: 50 -TTCCGACACTCTTCCTTCGT-30; Reverss: 50 -ATGGTTAGCCCATAGATGGG-30 ), -aktīns (Uz priekšu: 50 -TTA GTT GCG TTA CAC CCT TTC TTG{{17} }}; Reverss: 50 -TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT-30). PCR cikla detaļas bija šādas: sākotnējā denaturalizācija 2 min pie 95 ◦C; 45 pastiprināšanas cikli, kas sastāv no 30 sekundēm 95 ◦C, 1 min 58 ◦C un 1 min pie 72 ◦C; pēdējais cikls 5 minūtes 72 ◦C temperatūrā; visbeidzot, tika veiktas kušanas līknes. Noteikšana tika veikta, izmantojot MyiQ2 aprīkojumu (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, ASV). Rezultāti tika ziņoti kā 2−∆∆Ct (locījuma maiņa) un normalizēti, izmantojot -aktīnu kā mājturības gēnu.

2.9. Plāksnes tests

Vīrusu iznākums tika noteikts ar standarta aplikuma testu. Tika savākti šūnu supernatanti un sagatavoti sērijveida atšķaidījumi, lai inficētu Vero šūnu monoslāņus 1 stundu 37 ◦C temperatūrā. Pēc vīrusa adsorbcijas inokulas tika noņemtas, tika pievienots MEM 5% NBCS, kas papildināts ar 0,7% metilcelulozes, un šūnas tika inkubētas 1 nedēļu 37 ◦C temperatūrā 5% CO2 inkubatorā. Pēc tam šūnu monoslāņi tika fiksēti ar 10% formaldehīda, mazgāti un iekrāsoti ar kristālvioletu. Vīrusu titrs tika aprēķināts pēc plāksnes veidojošās vienības (PFU) kvantitatīvās noteikšanas.

2.10. Statistiskā analīze

Mikromasīvu statistiskā analīze tika veikta, izmantojot WebGestalt programmatūru (http://www. webgestalt.org/, piekļūts 2. jūlijā, 3. jūlijā020). Dati ir aprakstīti kā vidējais ± SD vienvirziena ANOVA ar Dunnett post hoc testu ar GraphPad Prism 8 (versija 8.0.1) operētājsistēmai Windows 11 (GraphPad Software, Sandjego, CA, ASV), lai novērtētu statistisko nozīmīgumu. p Mazāks vai vienāds ar 0,05 tika uzskatīts par statistiski nozīmīgu.

For more information:1950477648nn@gmail.com