Jaunas kumarīna glikoziltransferāzes CtUGT1 molekulārā klonēšana un bioķīmiskais raksturojums no Cistanche Tubulosa

lai iegūtu plašāku informāciju:ali.ma@wecistanche.com

Xiping Xu, et al

KOPSAVILKUMS

UDP-glikoziltransferāzes (UGT) ir svarīga un funkcionāli daudzveidīga enzīmu saime, kas iesaistīta sekundāro metabolītu biosintēzē. Kumarīns ir viens no visizplatītākajiem dabīgo produktu skeletiem, kam ir farmakoloģiskās aktivitātes. Tomēr līdz šim daudzi ziņojuši par GT no augiem galvenokārt atzina flavonoīdus par cukura akceptoriem. Tikai ierobežoti GT varēja katalizēt kumarīnu glikozilāciju. Šajā pētījumā jauns UGT tika klonēts noCistanche tubulosa, vērtīgs tradicionāls tonizējošs ķīniešu augs, kas ir bagāts ar dažādiem glikozīdiem, piemēram, feniletanoīdu glikozīdiem, lignāna glikozīdiem un iridoīdiem glikozīdiem. Secību saskaņošana un filoģenētiskā analīze to parādījaCtUGT1ir filoģenētiski tālu no vairuma ziņoto flavonoīdu UGT un blakus fenilpropanoīdu UGT. Plašās in vitro enzīmu pārbaudēs atklājās, ka, lai ganCtUGT1gadā nebija iesaistīti bioaktīvo glikozīdu biosintēzēCistanche tubulosa, tas varētu katalizēt kumarīnu umbelliferona 1, eskuletīna 2 un himekromona 3 glikozilāciju ar ievērojamu ražu. Glikozilētie produkti tika identificēti, salīdzinot ar atsauces standartiem vai KMR spektroskopiju, un rezultāti liecināja, kaCtUGT1var reģionāli specifiski katalizēt hidroksilkumarīnu glikozilāciju C7- OH pozīcijā. Galvenās atliekas, kas noteicaCtUGT1Uzņēmuma darbība tika tālāk apspriesta, pamatojoties uz homoloģijas modelēšanu un molekulārās dokstacijas analīzēm. Apvienojumā ar uz vietas vērstas mutaģenēzes rezultātiem tika konstatēts, ka H19 bija neaizvietojama kā izšķirošā katalīzes bāze.CtUGT1var izmantot bioaktīvo kumarīna glikozīdu fermentatīvajā preparātā.

Atslēgvārdi:augu glikoziltransferāzes, kumarīna glikozīdi,Cistanche tubulosa, Homoloģijas modelēšana, uz vietu vērsta mutaģenēze

Noklikšķiniet, lai cistanche ekstrakts dod labumu produktiem

Ievads

Glikozilēšana ir viens no visizplatītākajiem sekundāro dabisko produktu struktūras modifikācijas veidiem. Glikozilēšana var mainīt aglikona stabilitāti un/vai šķīdību un daudzu veidu konjugācijas veidu dēļ dot lielu ieguldījumu dabisko/nedabisko produktu daudzveidībā. Augos šīs reakcijas parasti veica no uridīna difosfāta (UDP) atkarīgās glikoziltransferāzes (UGT), kas ir sava veida enzīmi, kas katalizē monosaharīdu daļu pārnešanu no aktivētā nukleotīda cukura uz glikozila akceptormolekulu, kas var būt ogļhidrāts, glikozīds, oligosaharīds. vai polisaharīds [1,2]

Līdz šim daudzi gēni, kas kodē UGT, ir izolēti no vairākiem augiem [3]. Glikozilēšana galvenokārt notika dažādu sekundāro produktu hidroksilgrupās vai karboksilgrupās, piemēram, flavonoīdos [4], fenilpropanoīdos [5], terpenoīdos [6], steroīdos [7], alkaloīdos [8] utt. Kumarīni ir fenilpropanoīdu metabolīti, kas plaši izplatīti daudzās augu sugās. Dabā sastopamie kumarīni bieži pastāv kā glikokonjugāti, un šiem atvasinājumiem bija plašs farmakoloģiskās iedarbības spektrs, tostarp antioksidants [9], pretvīrusu [10,11], hepatoprotektīvs [12], pretiekaisuma [13], pretvēža līdzeklis [14]. ], antimutagēnas [15] un holīnesterāzes (ChE) un monoamīnoksidāzes (MAO) inhibējošās aktivitātes [14,15] utt. Tomēr līdz šim, salīdzinot ar visbiežāk ziņotajiem un plaši pētītajiem flavonoīdiem UGT, ir konstatēti tikai ierobežoti UGT ziņots, ka spēj pārnest cukura daļu uz kumarīniem [16–18].

Ar dažādiem glikozīdiem bagāti augi varētu kalpot kā ideāls UGT gēnu fonds ar jaunām katalīzes aktivitātēm. Turklāt ir ziņots, ka daudziem UGT piemīt ievērojama akceptoru izlaidība, lai katalizētu vairāku substrātu glikozilāciju, no kuriem daži augos pat netika atdalīti [19]. Šajā rakstā jauna glikoziltransferāzeCtUGT1tika identificēts noCistanche tubulosa, tradicionāls ārstniecības augs, kas ir bagāts ar dažādiem glikozīdiem, piemēram, feniletanoīdu glikozīdiem (PhG), lignāna glikozīdiem un iridoīdiem glikozīdiem. Heteroloģiskā ekspresija un funkciju raksturojums parādīja, ka, lai gan tas ir rekombinantsCtUGT1gadā nebija iesaistīts šo glikozīdu biosintēzēCistanche tubulosa, tas var katalizēt hidroksilkumarīnu glikozilāciju, un reakcija reģionāli notika kumarīnu umbelliferona 1, eskalācijas 2 un himekromona 3 7- OH pozīcijā, lai iegūtu trīs farmakoloģiski aktīvus savienojumus, kas ir nosmelti (1a), cihorīns (2a). , un 4-metilumbelliferilglikozīds (3a) ar ievērojamu ražu, attiecīgi. Turklāt benzofenona substrātu 4,4′-dihidroksibenzofenonu (4), izoflavona substrātu genisteīnu (5) un antrahinona substrātu alvejas-emodīnu (6) varētu pieņemt arīCtUGT1. Katalītiskās īpašības un galvenie atlikumi, kas uzsver katalīzes spējuCtUGT1tika novērtēti arī, pamatojoties uz homoloģijas modelēšanu, AutoDock analīzi un uz vietu vērstu mutaģenēzi.

2. Eksperimentāls

2.1. Augu materiāls un ķīmiskās vielas

Cistanche tubulosaŠajā pētījumā izmantotais tika savākts no tuksneša apgabaliem Hetianas, Sjiņdzjanas autonomajos reģionos. Viņu botānisko identitāti apstiprināja Pekinas universitātes profesors Pengfei Tu. Pārbaudītie kumarīni un citi substrāti šajā pētījumā tika iegādāti no Sigma-Aldrich (St. Louis, ASV), Chengdu Push Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Ķīna) un Chengdu Biopurify Phytochemicals Co., Ltd. (Chengdu, Ķīna). ), ja vien nav norādīts citādi. Smelšanas (1a) un cihorīna (2a) atsauces standarti tika iegādāti no Wuhan Chem Faces Biochemical Co., Ltd. (Uhaņa, Ķīna).

2.2. CtUGT1 molekulārā klonēšana no Cistanche tubulosa

Kopējā RNS noCistanche tubulosatika ekstrahēts no gaļīgā stumbra, izmantojot OMEGA Plant RNA Kit (GA, ASV), un reversi transkribēts uz cDNS ar PrimeScript™ RT reaģenta komplektu (TaKaRa, Japāna), ievērojot ražotāja norādījumus. 3′RACE tika izstrādāts deģenerēts primers, pamatojoties uz aminoskābju sekvencēm konservētajā augu glikoziltransferāžu PSPG (Plant Secondary Product Glycosyltransferase) kastē. 3′-gala un 5′-gala pastiprinājumiCtUGT1tika veikti, izmantojot Smart RACE cDNA amplifikācijas komplektu (Clontech, ASV) saskaņā ar ražotāja protokolu, izmantojot primerus (S1 tabula). Pilna garuma cDNSCtUGT1tika pastiprināts ar PCR, izmantojot KOD-Plus Neo DNS polimerāzi (TOYOBO, Japāna) ar gēnu specifiskiem primeru pāriem (S1 tabula) šādos apstākļos: sākotnējais denaturācijas posms 94 ◦C temperatūrā 2 minūtes, kam seko 35 denaturācijas cikli plkst. 98 ◦C 15 s, atkvēlināšana 55 ◦C 30 s un pagarināšana 68 ◦C 55 s, ar pēdējo pagarināšanas soli 68 ◦C 7 minūtes. Visi iegūtie DNS fragmenti tika klonēti pEASY-Blunt vektorā (TransGen Biotech, Ķīna) un sekvencēti.

2.3. Sekvenču saskaņošana un filoģenētiskā analīze

Secības līdzināšanaCtUGT1ar ziņotajām glikoziltransferāzēm (S2 tabula) tika veikta, izmantojot DNAMAN 4.0 programmatūras pakotni (Lynnon Biosoft, Kanāda). Motīvi un domēni tika analizēti, izmantojot konservētā domēna rīku (//www.ncbi.nlm.nih.Gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi). Filoģenētiskais koks tika izveidots, bootstrapping MEGA 7.0.14 programmatūru, izmantojot kaimiņu savienošanas metodi ar 1000 bootstrap atkārtojumiem [20]. Tulkotā proteīna secībaCtUGT1tika saskaņots ar zināmajām augu glikoziltransferāzēm, kas deponētas NCBI GenBank datubāzē (S3 tabula) ar ClustalW.

2.4. CtUGT1 heterooloģiskā ekspresija un olbaltumvielu attīrīšana Escherichia coli

Kodēšanas reģionsCtUGT1tika pastiprināts ar BamH I un Not I kā restrikcijas vietām, izmantojot primerus, kas parādīti S1 tabulā. PCR reakcijas tika veiktas, izmantojot KOD-Plus-Neo DNS polimerāzi (TOYOBO, Osaka, Japāna). Iegūtās sekvences tika pārbaudītas, klonējot pEASY-Blunt vektorā (TransGen Biotech, Ķīna). Apstiprināts amplifikācijas produktsCtUGT1pēc tam tika sagremots un subklonēts ekspresijas vektorā pET-28a( plus ) (Novagen, ASV). Pēc tam pārbaudītā konstrukcija tika transformēta E. coli Transetta (DE3), lai iegūtu rekombinanto celmu. Rekombinantā celma vienas nakts kultūra tika inokulēta Luria-Bertani (LB) barotnē, kas satur 50 ug⋅mL− 1 kanamicīna un 40 ug⋅mL− 1 hloromicetīna attiecībā 1:1{{ 19}}0. Kultūras tika audzētas 37 ◦C, 200 apgr./min, līdz OD600 vērtība sasniedza 0,4–0,6. Pēc tam tika pievienots izopropil- -D-tiogalaktopiranozīds (IPTG) līdz galīgajai koncentrācijai 0,5 mM, un šūnas tika audzētas 16 stundas 18 ◦C, 180 apgr./min. Pēc tam šūnu granulas tika novāktas, centrifugējot (7600 × g, 10 min, 4 ◦ C), un atkārtoti suspendētas 3 ml/g atdzesētā līzes buferšķīdumā (1. papildu datu piezīme) un izjauktas ar ultraskaņu uz ledus. Šūnu atliekas tika noņemtas, centrifugējot pie 7600 × g, 4 ◦ C apmēram 30 minūtes. Afinitātes hromatogrāfijai saskaņā ar ražotāja norādījumiem tika izmantota iepriekš līdzsvarota Histrap kolonna (GE Healthcare, Upsala, Zviedrija). Rekombinanto proteīnu eluēja ar 10 kolonnu tilpumiem eluēšanas buferšķīduma (1. papildu datu piezīme), kas satur 250 mM imidazola. Olbaltumvielu tīrība tika analizēta ar 10% SDS-PAGE. Attīrītais proteīns tika koncentrēts ar 30 kDa ultrafiltrācijas cauruli (Sigma-Aldrich, ASV) un atsāļots, izmantojot PD-10 kolonnu (GE Healthcare, Upsala, Zviedrija) ar atsāļošanas buferi (1. papildu datu piezīme). Olbaltumvielu koncentrācija tika noteikta ar Bredforda metodi, izmantojot BSA kā standartu.

2.5. CtUGT1 fermentatīvās aktivitātes testi un substrāta specifika

Lai izpētītu glikozilācijas aktivitātiCtUGT1, enzīmu testi tika veikti reakcijas maisījumā (150 μL), kas sastāvēja no 0,4 mM aglikona, 0,8 mM UDP-glikozes (UDPG) un 50 ug attīrīta.CtUGT1olbaltumvielas atsāļošanas buferī. Visas reakcijas tika inkubētas 30 ◦C 12 stundas un pabeigtas, pievienojot 300 μL auksta metanola. Maisījumus centrifugēja ar ātrumu 15, 000 × g 30 minūtes, lai savāktu supernatantu HPLC-UV/ESI-MS analīzēm. Katrai reakcijai regulāri tika veikti trīs paralēli testi. HPLC (Agilent 1260, ASV) tika aprīkots ar diožu matricas detektoru un CAPCELL PAK C18 kolonnu (250 mm × 4,6 mm, 5 μm; Shiseido, Japāna) ar plūsmas ātrumu 1 ml⋅min-1 un kolonnas temperatūru. tika uzturēta 30 ◦C temperatūrā. Kustīgā fāze sastāvēja no A (ti, 0,1% skudrskābes ūdens šķīduma) un B (ti, acetonitrila). Gradienta programmas tika uzskaitītas S4 tabulā. HRESI-MS dati tika ierakstīti LCMS-IT-TOF sistēmā, kas aprīkota ar ESI interfeisu (Shimadzu, Kioto, Japāna) ar īpaši augstas tīrības pakāpi He kā sadursmes gāzi un N2 kā izsmidzināšanas gāzi. Optimizētie ESI avota parametri bija šādi: apvalka gāzes plūsmas ātrums, 1,5 mL⋅min−1; palīggāzes plūsmas ātrums, 1,5 mL⋅min− 1; smidzināšanas spriegums, 4,5 kV; kapilārā temperatūra, 200 ◦C. Pilnai skenēšanas MS analīzei spektri tika reģistrēti 100–1500 m/z diapazonā.

2.6. Reakcijas laika, pH vērtības un temperatūras ietekme uz fermentu aktivitāti un CtUGT1 kinētiskie pētījumi

Reakcijas laika, pH vērtības un temperatūras ietekme uz fermentu aktivitātiCtUGT1tika pārbaudīti, izmantojot UDPG kā cukura donoru un 3 kā cukura akceptoru iepriekš aprakstītajos reakcijas apstākļos. Lai noteiktu optimālo pH līmeni, fermentu aktivitāte tika salīdzināta 100 mM buferšķīdumā (citronskābes-nātrija citrāts) ar pH vērtībām no 3.0 līdz 6.{{ 14}}, 10{{20}} mM buferšķīdums (KH2PO4-K2HPO4) ar pH vērtībām no 6.0 līdz 8.{29} }, 100 mM buferšķīdums (Tris-HCl) ar pH vērtībām diapazonā no 7,0 līdz 9,0, 100 mM buferšķīdums (Na2CO3-NaHCO3) ar pH vērtībām no 9,0 līdz 11,0. Lai noteiktu optimālo reakcijas temperatūru, reakcijas tika inkubētas dažādās temperatūrās no 0 līdz 65 ◦C. Reakcijas laika gaitas tika novērtētas 12 dažādos laika punktos no 0 līdz 24 stundām. Visi eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros. Reakcijas maisījumus analizēja ar HPLC-MS, kā aprakstīts iepriekš. Kinētiskiem pētījumiem parCtUGT1, fermentatīvās pārbaudes tika veiktas galīgajā tilpumā 100 μL, kas satur 100 mM KH2PO4-K2HPO4 buferšķīdumu (pH 8,0), 25 ug attīrīta.CtUGT1, 3 mM UDPG un dažādas koncentrācijas (50–3000 μM) no 3. Reakcijas tika veiktas 37 ◦ C temperatūrā 30 minūtes un pēc tam tika pabeigtas ar 100 μL ledusaukstu metanolu. Visas šīs reakcijas tika veiktas trīs eksemplāros, un fermentu aktivitāte tika novērtēta, kvantitatīvi nosakot atbilstošos glikozilētos atvasinājumus. Kinētiskie parametri, tostarp Michaelis-Menten konstante (Km) un Vmax, tika aprēķināti ar nelineāras regresijas analīzi, izmantojot GraphPad Prism 5 programmatūru.

2.7. CtUGT1 substrāta un cukura donoru selektivitāte

Lai izpētītu substrāta preferencesCtUGT1, kopā tika pārbaudīti 27 substrāti, kas pieder pie dažādiem strukturālajiem tipiem, izmantojot UDPG kā donoru. To ķīmiskā informācija bija norādīta S5 tabulā, un to struktūras ir parādītas 1. S1 un S2. Izpētīt cukura donoru selektivitātiCtUGT1, testi tika veikti, izmantojot umbelliferonu (1), eskuletīnu (2), himekromonu (3), 4,4′-dihidroksibenzofenonu (4), genisteīnu (5) un alvejas emodīnu (6) kā substrātus ar UDPG, UDP- N acetilgalaktozamīns, UDP-galaktoze, GDP-mannoze, GDP-fukoze, UDP galakturonskābe, UDP-ramnoze kā cukura donori, attiecīgi. Visi eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros. Reakcijas maisījumus analizēja ar HPLC-MS, kā aprakstīts iepriekš.

2.8. 4-metilumbelliferilglikozīda (savienojums 3a) sagatavošana ar CtUGT1

Preparāta reakcijas maisījums sastāvēja no {{0}},034 mmol substrāta savienojuma 3, 0,04 mmol UDPG, 5 mg attīrītaCtUGT150 ml reakcijas buferšķīdumā. Reakcijas tika viegli maisītas optimālos apstākļos (100 mM KH2PO4-K2HPO4 ar pH 8,0; 37 ◦C). Pēc 24 stundu inkubācijas 37 ◦C temperatūrā reakcijas supernatants tika atdalīts ar kolonnas hromatogrāfiju ar makroporainiem sveķiem (MCI GEL CHP) pēc centrifugēšanas pie 12,000 × g 30 minūtes. Mobilā fāze bija gradienta eluēšana no 100 procentiem ūdens līdz 100 procentiem metanola. Katra frakcija tika analizēta ar HPLC-UV. Frakcijas, kas satur tikai mērķa produktus, tika iztvaicētas līdz sausumam pazeminātā spiedienā un raksturotas ar 1H kodolmagnētiskās rezonanses (NMR) spektroskopiju un 13C KMR spektroskopiju.

2.9. CtUGT1 molekulārā doka un uz vietni vērsta mutaģenēze

Olbaltumvielu modelisCtUGT1tika izveidots, izmantojot SWISS-MODEL [21–25]. Par šablona struktūru tika izvēlēta Medicago truncatula glikoziltransferāzes UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) kristāliskā struktūra [26]. Izveidotais modelis tika novērtēts ar VERIFY-3D [27,28]. Auto-Dock Vina tika izmantota molekulārās dokstacijas pētījumiem [29]. UGT74F2 [30] kristāliskā struktūra, glikoziltransferāze no Arabidopsis thaliana, kompleksā ar ligandu UDP un salicilskābi (PDB ID 5U6M), tika izmantota kā kontroles struktūra attiecīgi cukura donora kabatas un cukura akceptora kabatas analīzei. . Auto-Dock-Tools 1.5.6 no MGLTools (Molecular Graphics Laboratory Tools) tika izmantoti, lai sagatavotu cukura donora UDPG un substrātu 1, 2 molekulārajai dokstacijai. Atlikumu sānu ķēdes ap aktīvās vietas dobumu tika iestatītas elastīgas, un ligandu rotējošās saites tika atstātas brīvi griezties. Visaugstākā poza, kas novērtēta pēc Vina dokstacijas modeļa ar visaugstāko (kcat/mol) afinitāti, tika pakļauta vizuālai analīzei, izmantojot PyMOL 2.0 programmatūru.

Mutaģenēzes pētījumiem secības optimizētais gēnsCtUGT1(Papildu datu 2. piezīme) tika sintezēts un pārbaudīts kā savvaļas tips. Uz vietni vērsta mutaģenēzeCtUGT1tika veikta, izmantojot Fast Mutagenesis System (TransGen Biotech). Mutanti tika amplificēti no optimizētā gēna veidnes, kas tika konstruēts vektorā pET{0}}, izmantojot specifiskos primerus, kas parādīti S1 tabulā. Konstruētie mutanti tika pārbaudīti ar PCR un sekvencēšanu, pirms tie tika transformēti E. coli (DE3) heteroloģiskai ekspresijai. Proteīnu attīrīšanas un enzīmu reakcijas tika veiktas un analizētas, kā aprakstīts iepriekš.

3. Rezultāti un diskusijas

3.1. CtUGT1 gēna pilna garuma cDNS klonēšana noCistanche tubulosa

Cistanche tubulosa(L.) (RouCongRong) ir tradicionāls ķīniešu ārstniecības augs, kas ražo dažādus bioaktīvus dabiskos glikozīdus. Tās genomā vajadzētu būt ievērojamam skaitam jaunu glikoziltransferāžu gēnu. Lai meklētu jaunas glikoziltransferāzes ar interesantām katalīzes aktivitātēm, tika izstrādāts deģenerēts primers 3'-RACE, pamatojoties uz konservēto PSPG motīvu, lai klonētu pieļaujamos UGT noCistanche tubulosa. Iegūtā 3′ gala secība tika tālāk analizēta ar NCBI strūklu, un, pamatojoties uz iegūto secību, tika izstrādāts specifiskais 5′-RACE primer. Pastiprinātie 5′ cDNS gali un 3′ cDNS gali tika savienoti, un pilna garumaCtUGT1tika iegūta secība, ieskaitot 1739 nukleotīdus (S3. att.) un uzskaitīta 3. piezīmē papildu dati. Pēc tam tika izveidots atvērts lasīšanas rāmis (ORF).CtUGT1tika atrasts ar NCBI ORF Finder rīkiem, un 1482 bp kodējošā secība tika veiksmīgi klonēta ar RT-PCR amplifikāciju, izmantojot specifiskus primerus S1 tabulā. CtUGT1 cDNS secība ir iesniegta NCBI (pievienošanās Nr. MW629113).

3.2. CtUGT1 secības analīze un heteroloģiskā ekspresija

TheCtUGT1Paredzams, ka gēns kodēs 493 aminoskābju atlikumu proteīnu ar aprēķināto molekulmasu 55,78 kDa. NCBI sprādziens atklāja, ka secinātā olbaltumvielu secībaCtUGT1ir vislielākā identitāte (76,39 procenti) ar UGT86A1- līdzīgiem enzīmiem. Šāda veida enzīmu bioķīmiskās funkcijas nav pilnībā raksturotas. Tiek prognozēts, ka tie var būt iesaistīti augu pielāgošanā abiotiskajam stresam. CtUGT1 un citu augu glikoziltransferāžu aminoskābju secību saskaņošana ir parādīta S4 attēlā.

Ļoti konservēti 44 PSPG motīva atliekas tika atrasti C-terminālāCtUGT1. PSPG lodziņā HCGWNS peptīdu secība atradās pie 373. aminoskābes, kas ir konstatēta 95 procentos no visām glikoziltransferāzēm [31]. PSPG motīva galīgais atlikums bija glutamīns, kas norādīja, ka šim fermentam ir tendence izmantot UDPG kā cukura donoru [32] (S4. att.). Filoģenētiskais koks tika izveidots, pamatojoties uz prognozētajām polipeptīdu sekvencēmCtUGT1un dažāda veida augu izcelsmes glikoziltransferāzes, kas bija iesaistītas dažādu sekundāro metabolītu biosintēzē. Līdz šim lielākā daļa ziņoto glikoziltransferāžu no augiem par saviem substrātiem atpazina flavonoīdus, piemēram, flavona 7-O-glikoziltransferāzes, flavonoīdu 3-O-glikoziltransferāzes, izoflavona 7-O-glikoziltransferāzes un halkona glikoziltransferāzes. Filoģenētiskās analīzes rezultāti to parādījaCtUGT1nav grupēts flavonoīdu GT kladē. Tā vietā tas atrodas blakus UGT74T1 un UGT74S1 (lignāna glikoziltransferāzes no Linum usitatissimum) un NtGT2 (kumarīna glikoziltransferāze no Nicotiana tabacum), kas norādīja, ka.CtUGT1var būt dažas jaunas katalīzes aktivitātes pret fenilpropanoīda substrātiem (1. att.), īpaši ņemot vērā, ka ir funkcionāli identificēti tikai ierobežoti locekļi, kas pieder šiem kladiem.

Lai vēl vairāk atklātu tā katalīzes aktivitāti,CtUGT1sekvence tika ekspresēta T7 lac promotora kontrolē E. coli Transetta (DE3) šūnās kā His6-marķēts saplūsmes proteīns. His-marķētais rekombinantsCtUGT1tika efektīvi attīrīts līdz viendabīgumam ar Ni – NTA afinitātes hromatogrāfiju. Attīrītā rekombinantā CtUGT1 molekulmasa bija aptuveni 55 kDa (S5 att.), kas atbilst paredzamajai molekulmasai.

3.3. CtUGT1 in vitro akceptora substrāta specifika

Lai pārbaudītu glikozilācijas aktivitātiCtUGT1, tika veiktas in vitro enzīmu pārbaudes. UDPG tika izmantots kā cukura donors. Cukura akceptori tika izvēlēti, pamatojoties uz dažādām bažām. Pirmkārt,CtUGT1gēns tika klonēts noCistanche tubulosakuru galvenās ķīmiskās sastāvdaļas ir PhGs. Lai pārbaudītu, vaiCtUGT1ir iesaistīts PhG, parasto PhG aglikonu, biosintēzēCistanche tubulosapiemēram, tirozols (NP1, att. S2) un salidroside (NP2, att. S2), vispirms tika izvēlēti kā substrāti. Diemžēl HPLC un HRESI-MS analīzēs netika atrasti glikozilēti produkti, kas to liecinājaCtUGT1var nebūt iesaistīti PhG biosintēzē.

Otrkārt, pamatojoties uz secību saskaņošanu un filoģenētiskās analīzes rezultātiem (1. att.),CtUGT1bija filoģenētiski saistīta ar lignanoīdu un kumarīna glikoziltransferāzēm, kas liecināja, kaCtUGT1iespējams, ir fenilpropanoīda glikoziltransferāze. Lai pārbaudītu šo prognozi, kā cukura akceptori tika pārbaudīti attiecīgi trīs kumarīna substrāti 1, 2 un 3 kopā ar vienu lignanoīdu substrātu magnololu NP17. Kā negatīva kontrole tika izmantoti termiski inaktivēti enzīmi (100 ◦C, 10 min). HPLC-HRESI-MS reakciju analīze, izmantojot NP17 kā substrātu, neatrada nevienu produktu. Turpretī,CtUGT1uzrādīja acīmredzamas glikozilācijas spējas pret pārbaudītajiem kumarīna substrātiem (1, 2, 3). Izmantojot 1. substrātu kā piemēru, kā parādīts 2.A attēlā, tika iegūts jauns maksimums (1a) ar samazinātu aiztures laiku (11,46 min), salīdzinot ar substrāta 1 (19,75 min).CtUGT1ar ienesīgumu 37,78 procenti. Tā UV absorbcijas spektrs atbilst 1. HRESI-MS spektrs parādīja, ka maksimums 1a uzrādīja [M plus H] plus pie m/z 325,1029 un [M plus Na] plus pie m/z 347,0710 (aprēķināts 347,0737 C8NaH16O ) ar paredzēto formulu C15H16O8, kas bija par 162 amu lielāka nekā 1 un atbilst glikozilēta produkta teorētiskajai formulai (2.A attēls). Līdzīgi arī substrāta 2 (14,21 min, 2.B att.) un 3 (21,92 min, 2.C attēls) glikozilētais produkts tika atrasts pie aiztures laika 10,85 min un 13,80 min ar konversijas ātrumu 22,03 procenti un 68,67 procenti. , attiecīgi. Produktu molekulmasa precīzi sakrita ar aprēķināto glikozilēto produktu masu, kas apstiprināja, kaCtUGT1varētu katalizēt kumarīna savienojumu 1–3 glikozilāciju (1. tabula).

Pēc tam, ņemot vērā, ka lielākajai daļai nesen ziņoto enzīmu in vitro bija katalīzes izlaidība, lai turpinātu pētīt substrāta spektruCtUGT1, tika veiktas ekspansīvas enzīmu pārbaudes attiecībā uz dažādiem savienojumiem, kas pieder pie dažāda veida dabīgiem produktiem, tostarp flavonoīdiem, fenola savienojumiem, kumarīniem, stilbēnu, antrahinoniem, benzofenonu, naftalīnu un iridoīdu (S1-S2. att.), izmantojot UDPG kā cukura donors. Tika konstatēts, ka benzofenona substrāta 4,4′-dihidroksibenzofenona (4), izoflavona substrāta genisteīna (5) un antrahinona substrāta alvejas-emodīna (6) katalizāciju var arī katalizētCtUGT1veidot atbilstošo glikozilēto produktu 4a, 5a, 6a ar lielāku polaritāti (3. att.). HRESI-MS analīze parādīja, ka produktu jonu maksimumi bija par 162 amu lielāki nekā substrātiem, kas liecina, kaCtUGT1varētu katalizēt šo savienojumu glikozilāciju, veidojot to atbilstošo monoglikozīda produktu. Konversijas likmes 4, 5 un 6 bija attiecīgi 4,12 procenti, 14,14 procenti un 23,33 procenti (1. tabula).

Cukura donora selektivitāteCtUGT1tika arī izpētīts. Papildus UDPG tika pārbaudīti seši citi donori, tostarp UDP-N-acetilgalaktozamīns, UDP galaktoze, GDP-mannoze, GDP-fukoze, UDP-galakturonskābe un UDP ramnoze, izmantojot substrātus 1–6 kā akceptorus. Rezultāti to parādījaCtUGT1kā cukura donoru izvēlējās tikai UDPG. Pārbaudot citus aktivētos cukurus, netika novērots neviens produkts (dati nav parādīti).

3.4. CtUGT1 bioķīmiskās īpašības un kinētiskie parametri

Bioķīmiskās īpašībasCtUGT1tika pētīti, izmantojot 3 kā cukura akceptoru un UDPG kā cukura donoru, kā norādīts 4. attēlā. Katalīzes aktivitāteCtUGT1tika pārbaudīts temperatūras diapazonā no 4–60 ◦C, optimālā aktivitāte tika noteikta 37 ◦C temperatūrā (4.A att.). Fermenta aktivitātes analīze starp pH 3.0 un 9.0 parādīja, ka optimālā pH vērtība tika novērota pie pH 8,0 (100 mM buferšķīdums KH2PO4-K2HPO4, 4. att.). Glikozilācijas produkta 3a iznākums lineāri palielinājās 1 stundas laikā, un augšanas ātrums izlīdzinājās pēc 5 stundām (4.B attēls). Šķietamā Km vērtībaCtUGT13 bija 218,7 ± 7,176 μM, un Vmax bija 0.02255 ± 0,0001796 nmol⋅min−1⋅ug−1.

3.5. Glikozilētu produktu fermentatīvā sagatavošana un strukturālā identifikācija

Pamatojoties uz fermentu analīžu rezultātiem,CtUGT1mēdz būt specifiska glikoziltransferāze, kas var katalizēt dažādu veidu dabisko produktu glikozilāciju. HPLC-HR-MS informācija par produktiem ir apkopota 1. tabulā. Starp tiem kumarīnu substrātiem bija ievērojams konversijas līmenis. Tālāk tika analizēta fermentu aktivitāte pret kumarīniem. Jāatzīmē, ka visus trīs pārbaudītos kumarīna substrātus pieņēmaCtUGT1ir hidroksilgrupa C-7 pozīcijā, savukārt eskuletīnam (2) ir papildu hidroksilgrupa C-6 pozīcijā. Eskuletīna glikozilētā produkta HPLC profils ir parādīts 2. attēlā. Tika novērots tikai viens produkts, kas liecina, ka glikozilācijas reakcija reģionāli notika C-6 vai C-7 pozīcijā. Lai apstiprinātu glikozilācijas vietu, produkts 2a tika identificēts, salīdzinot ar autentiskajiem glikozīdiem ar HPLC-UV/HRESI-MS analīzi. Pievienojot reakcijas sistēmā autentisko glikozīda cihorīnu (glikozilēts 7-OH pozīcijā 2), pīķis pārklājās ar 2a, ko-HPLC profils vēl vairāk apstiprināja, ka 2. glikozilēto produktu katalizēCtUGT1ir cihorīns [33], kas pierādīja, ka glikozilgrupa tika īpaši pārnesta uz C7-OH pozīciju. Produkts 1a tika identificēts arī, salīdzinot ar atsauces standartu. UV-HPLC spektri kopā ar ko-HPLC analīzi (2. att.) atklāja, ka 1a ķīmiskā struktūra tika attiecināta uz nosmelšanu [34], kas ir 1 glikozilēts produkts C7-OH pozīcijā.

Produkts 3a tika sagatavots no palielinātas reakcijas un strukturāli raksturots ar HRESI-MS, 1H KMR un 13C KMR spektroskopiju (S13., S14. attēls un 4. piezīme). 1H KMR signālā, salīdzinot ar 3. substrātu, fenola hidroksilgrupas signāls C{{10}} pozīcijā pazuda, un C-7 oglekļa signāls nobīdījās par δ 1.{25} } ppm uz augsto lauku, savukārt C-6 un C-8 signāli tika novirzīti uz zemo lauku 13C KMR. Šie atklājumi apstiprināja, ka glikopiranozila atlikums bija saistīts ar fenola hidroksilgrupu C-7 pozīcijā 3 [35]. Turklāt 1H KMR spektrs uzrādīja anomērus protonu signālus pie δH 5.00 (1H, d, J=7,0 Hz); cukura komponents tika norādīts kā -D-glikopiranoze. Šis rezultāts parādījaCtUGT1ir kumarīna O-glikoziltransferāze, kas katalizēja hidroksilkumarīna glikozilāciju 7-OH pozīcijā.

3.6. CtUGT1 proteīna homoloģijas modelēšana, molekulārā dokstacija un vietēja mutaģenēze

Plašas enzīmu reakcijas to atklājaCtUGT1varētu katalizēt trīs kumarīnu glikozilāciju tiem atbilstošajā glikozilētajā produktā, un glikozilētā pozīcija īpaši notika 7- OH pozīcijā. Identificēt galvenos atlikumus, kas noteica katalīzes aktivitātesCtUGT1, tika veikti CtUGT1 homoloģijas modelēšanas, molekulārās dokstacijas un uz vietas vērsti mutaģenēzes pētījumi. CtUGT1 homologā molekulārā modelēšana tika izveidota, izmantojot SWISS-MODEL [21–25]. Medicago truncatula glikoziltransferāzes UGT85H2 (PDB ID 2PQ6) kristāliskā struktūra, kas noteikta ar izšķirtspēju 2,1 Å, uzrādīja augstāko kopējo punktu skaitu ar maksimālo secības homoloģiju un zemu E-vērtību, tika izvēlēta kā veidnes struktūra [26]. Izveidotā modeļa racionalitātes novērtējums tika parādīts Ramachandran diagrammā (S6. att.), 88,5 procenti no izveidotā modeļa atliekām atrodas vislabvēlīgākajā reģionā. CtUGT1 homoloģijas modelis sastāv no diviem līdzīgiem Rossmann tipa kroku motīviem attiecīgi N- un C-galā (5.A att.). N-gala domēnam ir septiņu virkņu paralēlas loksnes, kas ir ap desmit spirālēm. C-termināla domēnā ir sešu pavedienu loksnes, kurām blakus ir deviņas spirāles (5.A, S7 att.).

Lai vēl vairāk noskaidrotu aktīvās kabatasCtUGT1, tika veikta molekulārā dokstacija. Tā kā UGT85H2 ir tikai apo formas struktūra, kā kontroles veidne tika izvēlēts cits homologs UGT74F2 ar UDP un salicilskābi kā diviem ligandiem. UDPG tika sagatavots kā cukura donors. Divi kumarīna substrāti 1 un 2 tika sagatavoti attiecīgi kā cukura akceptori. Glikozila donora un akceptora saistīšanās vietas tika aprēķinātas un piestiprinātas atsevišķi, kā parādīts 5. attēlā. Rezultāti liecināja, ka abas no divām saistīšanas kabatām atrodas dziļās spraugas iekšpusē cieši noslēgtā N-gala domēna un C mijiedarbības zonā. -gala domēnsCtUGT1un telpiski tuvu viens otram (5.A att.). C-galsCtUGT1galvenokārt ir iesaistīts saskarē ar glikozila donoru, kā aprakstīts citu augu UGT, un lielākā daļa apkārtējo atlikumu ir hidrofīli un ļoti konservēti. Piemēram, tipiskā PSPG kaste, atlikums W377 šajā motīvā varētu veidot ūdeņraža saites ar UDPG glikozes grupu (5.B att.); N378 un S379 šajā motīvā varētu veidot ūdeņraža saites ar UDPG difosfātu grupu (5.B att.). Turklāt saskaņā ar dokstacijas rezultātiem W356 un Q359 atliekas var mijiedarboties ar uridīna grupu, izmantojot ūdeņraža saites mijiedarbību, lai stabilizētu donoru aktīvajā kabatā. Lai pārbaudītu šo paredzamo galveno atlieku darbību, kopumā tika atlasītas 16 vietas un pakļautas alanīna skenēšanas mutaģenēzei. Šo mutantu katalīzes aktivitātes tika pārbaudītas, izmantojot visus sešus iepriekš minētos pozitīvos substrātus. HPLC analīzes parādīja, ka tad, kad G18, H19, S295, F296, W356, C357, Q359, H374, G376, W377, N378, S379, E382, Y397 un D398 atlikumi tika mutēti par proteīnu glikozalanilācijas aktivitāti. pilnībā zaudēta attiecībā pret visiem pārbaudītajiem substrātiem. Šie rezultāti liecināja, ka iepriekš minētie 16 atlikumi ir galvenie atlikumi, kas noteica UDPG donora saistīšanos un glikozilācijas aktivitāti.CtUGT1.

To identify the crucial residues in the sugar acceptor binding pocket, molecular docking analyses were performed on 1 and 2, respectively. These two substrates have the same coumarin core. 2 have two hydroxyl groups at both C-6 and C-7 position while 1 only has one hydroxyl group at the C-7 position. The overlapped docking results of these two compounds were shown in Fig. 5C. They exhibited almost the same confirmation in the glycosyl acceptor binding pocket (1 in cyan color and 2 in green color). Two hydrogen bonds were observed between the NE2 atom of the imidazole ring of H19 and the OH group of coumarins at positions C-6 (~3.1 Å) and C-7(~3.0 Å) respectively (Fig. 5D). It was calculated that H19 is much closer to the 7-OH group which will make the hydroxyl group at the C-7 position easily to be deprotonated by H19 to form the nucleophilic oxyanion that could attack the C1′ carbon of UDPG to initiate the glycosylation reaction. This may explain why the glycosylation position was preferred to happen at the 7-OH position of coumarins substrates. Besides, it can be seen that H19 is located at the cleft of the two active pockets, and interacts with both the substrate and UDPG (Fig. 5B, C, D). Mutation of His19 to alanine will lead to the complete loss of enzyme activity, which confirmed the irreplaceable role of H19 that plays a role as the crucial catalysis basis, meanwhile, stabilizing the UDPG donor. Alanine scanning mutagenesis of some other sites in the acceptor binding pocket also resulted in no detectable enzyme activity, including Y16, L213, F296, or significantly decrease of the enzyme activity (>44 procenti ), piemēram, V14, V132, E153, T212 un I209 (S8. att.). Tiek prognozēts, ka šie hidrofobie atlikumi, kas ieskauj aromātisko gredzenu, varētu veidot van der Vāla mijiedarbību ar substrātu saistošajā kabatā.

4. Diskusija

Glikozilēšana ir viens no svarīgākajiem modifikācijas posmiem daudzu sekundāro metabolītu biosintēzes ceļos. Glikozilēšana varētu palielināt dabisko produktu biopieejamību, uzlabojot to šķīdību ūdenī un samazinot to toksicitāti. Kumarīns tiek uzskatīts par vienkāršāko formu plašā dabā sastopamo fenola vielu klasē, kas veidota no pirona gredzena, kas sakausēts ar benzola gredzenu. Gan dabiskie, gan sintētiskie kumarīna savienojumi ir piesaistījuši lielu zāļu ķīmiķu un zāļu dizaina zinātnieku uzmanību to atšķirīgo farmakoloģisko un bioloģisko īpašību dēļ [36]. Turpmāka kumarīnu glikozilētā modifikācija varētu palīdzēt bagātināt šo savienojumu strukturālo daudzveidību, kā arī uzlabot to šķīdību un biopieejamību. Augos šādu glikozilācijas procesu katalizē UDP-glikoziltransferāze. Lai gan no dažādiem augiem ir identificēti vairāki UGT, līdz šim lielākā daļa ziņoto UGT bija iesaistīti flavonoīdu glikozilētā modifikācijā. Tika ziņots, ka tikai ierobežoti UGT spēj pieņemt kumarīnus kā substrātus. Šajā pētījumā jauns glikoziltransferāzes gēnsCtUGT1tika klonēts no tradicionālā ķīniešu garšaugaCistanche tubulosa. Secību saskaņošana un filoģenētiskās analīzes rezultāti to parādījaCtUGT1ir filoģenētiski tālu no vairuma ziņoto flavonoīdu UGT un daudz tuvu fenilpropanoīdu UGT. Plaši enzīmu testi atklāja, ka CtUGT1 nevarēja katalizēt feniletanola savienojumu glikozilāciju, veidojot PhG, kas ir galvenā ķīmiskā sastāvdaļa.Cistanche tubulosa. Tā vietā tas varētu atpazīt kumarīnus kā substrātus un veikt glikozilācijas reakciju. Produktu struktūras noskaidrošana parādīja, ka glikozilācijas vietu katalizēCtUGT1reģionālā specifiskā veidā notika kumarīnu C7-OH pozīcijā. Izmantojot CtUGT1, tika veiksmīgi fermentatīvi sintezēti un strukturāli identificēti trīs kumarīna glikozīdi, tostarp nosmelšana (1a), cihorīns (2a) un 4-metilumbelliferilglikozīds (3a). Visi šie trīs savienojumi tika ziņots kā farmaceitiski aktīvas molekulas. Piemēram, tiek uzskatīts, ka 1a piemīt dažādas farmakoloģiskas aktivitātes, tostarp renoprotektīva iedarbība, pretiekaisuma, pretvēža un antiamēbiskas īpašības [37]. 2a uzrādīja augstu antibakteriālo aktivitāti pret dažām grampozitīvām baktērijām, piemēram, Bacillus cereus un Staphylococcus aureus [38]. 3a var palīdzēt augiem uzlabot to reakcijas spējas uz ķīmiskām vielām un toksīniem [39].

Papildus kumarīniem plašie enzīmu testi atklāja, kaCtUGT1uzrādīja arī novērojamu glikozilācijas aktivitāti pret benzofenona substrātu 4, izoflavona substrātu 5 un antrahinona substrātu 6, kas norādīja, ka CtUGT1 ir noteikta substrāta tolerance. Tomēr,CtUGT1nevarēja katalizēt glikozīdu komponentu biosintēziCistanche tubulosapiemēram, feniletanoīdu glikozīdi (PhG), lignanoīdu glikozīdi un iridoīdu glikozīdi. Turklāt saskaņā ar iepriekšējiem pētījumiem kumarīna glikozīdi netika izolēti noCistanche tubulosa. Tātad, in vivo funkcijaCtUGT1vēl ir jāturpina izpētīt. CtUGT1 glikozilācijas aktivitāte pret kumarīna substrātiem padara šo enzīmu par noderīgu rīku kumarīnu enzīmu glikozilācijas modifikācijai, kā arī norādīja, ka augu sekundārie vielmaiņas enzīmi var veikt nenovērtējamas katalīzes aktivitātes, kas daudz pārsniedz to dabiskās funkcijas.

Konkurējošo interešu deklarācija

Autori paziņo, ka interešu konfliktu nav.

Atzinība

Šo darbu finansiāli atbalstīja Pekinas Dabaszinātņu fonds (granta Nr. 7192112); CAST jauno elites zinātnieku sponsorēšanas programma (granta Nr. CACM− 2018− QNRC1−02); Ķīnas Nacionālais dabaszinātņu fonds (granta Nr. 81402809); Ķīnas Stipendiju padomes valsts stipendiju fonds (dotācijas Nr. 201906555010) un Zinātnes fonds Pekinas Ķīnas Medicīnas universitātes jauno zinātnieku elites zinātniekiem (granta Nr. 2018-JYB-XJQ006).

A pielikums. Papildu dati

Papildu datus šim rakstam var atrast tiešsaistē vietnē https://doi. org/10.1016/j.fitote.2021.104995.

No: "Jaunas kumarīna glikoziltransferāzes molekulārā klonēšana un bioķīmiskais raksturojumsCtUGT1noCistanche tubulosa' autorsXiping Xu, et al

---Fitoterapia 153 (2021) 104995 https://doi.org/10.1016/j.fitote.2021.104995

Atsauces

[1] Y. Li, S. Baldauf, EK Lim, DJ Bowles, Arabidopsis thaliana UDPglikoziltransferāzes multigēnu ģimenes filoģenētiskā analīze, J. Biol. Chem. 276 (2001) 4338–4343, https://doi.org/10.1074/jbc.M007447200.
[2] LF Mackenzie, Q. Wang, RAJ Warren, SG Withers, Glycosynthases: mutant glikozidāzes oligosaharīdu sintēzei, J. Am. Chem. Soc. 120 (1998) 5583–5584, https://doi.org/10.1021/ja980833d.
[3] CJ Thibodeaux, CE Melancon, HW Liu, Neparastā cukura biosintēze un dabīgā produkta glikodiversifikācija, Nature 446 (2007) 1008–1016, https://doi.org/ 10.1038/nature05814.
[4] Y. Ji, B. Li, M. Qiao, J. Li, H. Xu, L. Zhang, X. Zhang, Advances on the in vivo and in vitro glycosylations of flavonoids, Appl. Microbiol. Biotehnoloģija. 104 (2020) 6587–6600, https://doi.org/10.1007/s00253-020-10667-z.
[5] T. Koeduka, Y. Ueyama, S. Kitajima, T. Ohnishi, K. Matsui, Molecular cloning and characterization of UDP-glucose: volatile benzenoid/phenylpropanoid glucosyltransferase in petunia flowers, J. Plant Physiol. 252 (2020) 153245, https://doi.org/10.1016/j.jplph.2020.153245.
[6] S. Rahimi, J. Kims, I. Mijakovičs, KH Jungs, G. Choi, SC Kim, YJ Kim, Triterpenoid-biosintētiskās UDP-glikoziltransferāzes no augiem, Biotechnol. Adv. 37 (2019) 107394, https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.04.016.
[7] G. Singh, YV Dhar, MH Asif, P. Misra, Exploring thefunctional significance of sterol glycosyltransferase ferments, Prog. Lipid Res. 69 (2018) 1–10, https://doi. org/10.1016/j.plipres.2017.11.001.
[8] KF McCue, PV Allen, LV Shepherd, A. Blake, J. Whitworth, MM Maccree, DR Rockhold, D. Stewart, HV Davies, WR Belknap, The Primary in vivo steroidal alkaloid glucosyltransferase from potato, Phytochemistry. 67 (2006) 1590–1597, https://doi.org/10.1016/j.phytochem.
[9] J. Yu, L. Wang, RL Walzem, EG Miller, LM Pike, BS Patil, Citrusaugļu limonoīdu, flavonoīdu un kumarīnu antioksidantu aktivitāte, J. Agric. Food Chem. 53 (2005) 2009–2014, https://doi.org/10.1021/jf0484632.
[10] HJ Cho, SG Jeong, JE Park, JA Han, HR Kang, D. Lee, MJ Song, Angelicīna pretvīrusu aktivitāte pret gammaherpesvīrusiem, Antivīruss. Res. 100 (2013) 75–83, https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2013.07.009.
[11] Z. Xu, Q. Chen, Y. Zhang, C. Liang, Kumarīna bāzes atvasinājumi ar spēcīgu anti-HIV aktivitāti, Fitoterapija. 150 (2021) 104863, https://doi.org/10.1016/j. fitote.2021.104863.
[12] AT Mossa, TM Heikal, M. Belaiba, EG Raoelison, H. Ferhout, J. Bouajila, Cedrelopsis grevei antioksidantu aktivitāte un hepatoprotektīvais potenciāls par cipermetrīna izraisītu oksidatīvo stresu un aknu bojājumiem vīriešu pelēm, BMC papildinājums. Altern. Med. 15 (2015) 251, https://doi.org/10.1186/s12906-015-0740-2.
[13] Y. Bansal, P. Sethi, G. Bansal, Kumarīns: potenciāls kodols pretiekaisuma molekulām, Med. Chem. Res. 22 (2013) 3049–3060, https://doi.org/10.1007/s00044-012-0321-6.
[14] M. Kumar, R. Singla, J. Dandriyal, V. Jaitak, Kumarīna atvasinājumi kā pretvēža līdzekļi plaušu vēža terapijai: pārskats, Anti Cancer Agents Med. Chem. 18 (2018) 964–984, https://doi.org/10.2174/1871520618666171229185926.
[15] A. Stefanachi, F. Leonetti, L. Pisani, M. Catto, A. Carotti, Coumarin: a natural, privililed and versatile scaffold for bioactive connections, Molecules 23 (2018) 250, https://doi.org /10.3390/molecules23020250.
[16] T. Taguchi, N. Ubukata, H. Hayashida, M. Yamamoto, Okazaki, glikoziltransferāzes, kas reaģē uz 7-flavonola hidroksilgrupu un 3-kumarīna hidroksilgrupu, klonēšana un raksturojums no tabakas šūnas, Arch. Biochem. Biofizija. 420 (2003) 95–102, https://doi.org/10.1016/j.abb.2003.09.027.
[17] L. Zhou, T. Tian, ​​B. Xue, L. Song, L. Liu, R. Yu, Biosynthesis of coumarin glycosides by transgenic hairy roots of Polygonum multiflorum, Biosci. Biotehnoloģija. Biochem. 76 (2012) 1008–1010, https://doi.org/10.1271/bbb.110347.
[18] H. Kanoh, M. Kawauchi, M. Kuroyanagi, T. Arima, Molecular cloning and characterization of coumarin glucosyltransferase in hairy roots of Pharbitis nil (Ipomoea nil), Plant Tissue Cult. Lett. 31 (2014), 21–28, https://doi.org/10.5511/plantbiotechnology.13.1203a.
[19] JB He, P. Zhao, ZM Hu, S. Liu, Y. Kuang, M. Zhang, B. Li, CH Yun, X. Qiao, M. Ye, Molecular and structureization of a promiscuous Cglycosyltransferase from Trollius Chinensis, Angew. Chem. Int. Ed. Inž. 58 (2019) 11513–11520, https://doi.org/10.1002/anie.201905505.
[20] S. Kumar, G. Stecher, K. Tamura, MEGA7: molekulārās evolūcijas ģenētikas analīzes versija 7.0 lielākām datu kopām, Mol. Biol. Evol. 33 (2016) 1870–1874, https://doi. org/10.1093/molbev/msw054.
[21] A. Voterhauss, M. Bertoni, S. Bīnerts, G. Stūders, G. Tauriello, R. Gumienijs, FT Hērs, TAP de Bērs, K. Rempfers, L. Bordoli, R. Lepore, T. Šveds, SWISS-MODEL: proteīnu struktūru un kompleksu homoloģijas modelēšana, Nucleic Acids Res. 46 (2018) W296–W303, https://doi.org/10.1093/nar/gky427.
[22] N. Guex, MC Peitsch, T. Schwede, Automated salīdzinošā proteīnu struktūras modelēšana ar SWISS-MODEL un Swiss-Pdb skatītāju: vēsturiska perspektīva, Electrophoresis 30 (2009) S162–S173, https://doi.org/ 10.1002/elps.200900140.
[23] S. Bienert, A. Waterhouse, TAP de Beer, G. Tauriello, G. Studer, L. Bordoli, T. Schwede, The SWISS-MODEL repozitorijs — jaunas iespējas un funkcionalitāte, Nucleic Acids Res. 45 (2017) D313–D319, https://doi.org/10.1093/nar/gkw1132.
[24] G. Studers, C. Rempfer, AM Waterhouse, G. Gumienny, J. Haas, T. Schwede, QMEANDisCo-distance constraints used on model quality estimation, Bioinformatics. 36 (2020) 1765–1771, https://doi.org/10.1093/bioinformatics/ btz828.
[25] M. Bertoni, F. Kīfers, M. Biasini, L. Bordoli, T. Šveds, Homo- un heterooligomēru proteīna kvartārās struktūras modelēšana ārpus binārās mijiedarbības ar homoloģiju, Sci. Rep. 7 (2017) 10480, https://doi.org/10.1038/s41598-017-09654-8.
[26] L. Li, LV Modolo, LL Escamilla-Trevino, L. Achnine, RA Dixon, X. Wang, Medicago truncatula UGT85H2-kristāla struktūra sniedz ieskatu daudzfunkcionāla (izo)flavonoīda strukturālajā bāzē. glikoziltransferāze, J. Mol. Biol. 370 (2007) 951–963, https://doi.org/10.1016/j.jmb.2007.05.036.
[27] R. Lüthy, JU Bowie, D. Eisenberg, Assessment of protein models with three-dimensional profiles, Nature 356 (1992) 83–85, https://doi.org/10.1038/ 356083a0.
[28] RA Laskowski, MW MacArthur, DS Moss, JM Thornton, PROCHECK: programma proteīnu struktūru stereoķīmiskās kvalitātes pārbaudei, J. Appl. Kristalogs. 26 (1993) 283–291, https://doi.org/10.1107/S0907444998006684.
[29] O. Trots, AJ Olsons, AutoDock Vina: dokstacijas ātruma un precizitātes uzlabošana ar jaunu vērtēšanas funkciju, efektīvu optimizāciju un daudzpavedienu izveidi, J. Comput. Chem. 31 (2010) 455–461, https://doi.org/10.1002/jcc.21334.
[30] AM George Thompson, CV Iancu, KE Neet, JV Dean, JY Choe, atšķirības salicilskābes glikozes konjugācijās ar UGT74F1 un UGT74F2 no Arabidopsis thaliana, Sci. Rep. 7 (2017) 46629, https://doi.org/10.1038/srep46629.
[31] T. Vogs, P. Džounss, Glycosyltransferases in augu natural product synthesis: characterization of a supergene family, Trends Plant Sci. 5 (2000) 380–386, https://doi.org/10.1016/s1360-1385(00)01720-9.
[32] A. Kubo, Y. Arai, S. Nagashima, T. Yoshikawa, Alteration of sugar donor specificities of plant glycosyltransferases by a one point mutation, Arch. Biochem. Biofizija. 429 (2004) 198–203, https://doi.org/10.1016/j. abb.2004.06.021.
[33] H. Kanho, S. Yaoya, T. Itani, T. Nakane, N. Kawahara, Y. Takase, K. Masuda, M. Kuroyanagi, Glucosylation ofphenolic connections by Pharbitis nil hairy roots: I. Glucosylation of coumarin un flavonu atvasinājumi, Biosci. Biotehnoloģija. Biochem. 68 (2004) 2032–2039, https://doi.org/10.1271/bbb.68.2032.
[34] J. Bjerre, EH Nielsen, M. Bols, Hidrolīze toksiskiem dabīgiem glikozīdiem, ko katalizē ciklodekstrīna diciānhidrīni, Eur. J. Org. Chem. 2008 (2010) 745–752, HTTPS:// doi.org/10.1002/ejoc.200700954.
[35] B. Xue, LB Zhou, JW Liu, RM Yu, Hidroksikumarīna atvasinājumu biotransformācija ar Catharanthus roseus kultivētām suspensijas šūnām, Pharmazie 67 (2012) 467–471, https://doi.org/10.1691/ph.2012. .
[36] T. Al-Warhi, A. Sabt, EB Elkaeed, WM Eldehna, Kumarīnu saturošu pretvēža līdzekļu jaunākie sasniegumi: jaunākais pārskats, Bioorg. Chem. 103 (2020) 104163, https://doi.org/10.1016/j.bioorg.2020.104163.
[37] X. Li, MY Gruber, DD Hegedus, DJ Lydiate, MJ Gao, Kumarīna atvasinājuma 4-metilumbelliferona ietekme uz sēklu dīgtspēju un stādu augšanu, Arabidopsis, J. Chem. Ecol. 37 (2011) 880–890, https://doi.org/10.1007/s10886-011-9987-3.
[38] K. Xu, ZM Feng, YN Yang, JS Jiang, PC Zhang, astoņi jauni eudesmane- un eremophilane tipa seskviterpenoīdi no Atractylodes lancea, Fitoterapia. 114 (2016) 115–121, https://doi.org/10.1016/j.fitote.2016.08.017.
[39] Y. Lou, H. Wu, J. Zheng, X. He, Z. Wu, X. Lu, Y. Qiu, Determination and farmakokinetic study of skimming by UHPLC-MS/MS in žurku plazmā, J. Pharm . Biomed. Anal. 179 (2020) 112969, https://doi.org/10.1016/j.jpba.2019.112969.