Nc886, nekodējoša RNS, ir jauns biomarķieris un epiģenētiskais starpnieks šūnu novecošanai fibroblastos

Anotācija:

Organismu un cilvēku modeļu funkcionālie pētījumi atklājuši, ka epiģenētiskās izmaiņas var būtiski ietekmēt novecošanās procesu. Nekodētajai RNS (ncRNS), vienam no epiģenētiskajiem regulatoriem, ir svarīga loma mRNS un to proteīnu ekspresijas modifikācijā. Tas var būt starpnieks šūnu fenotipam. Ir ziņots, ka nc886 (=vtRNS2-1 vai pre-miR-886), gara ncRNS, var nomākt audzēju veidošanos un keratinocītu fotobojājumus, ko izraisa UVB. Šī pētījuma mērķis bija noteikt nc886 lomu fibroblastu replikatīvajā novecošanā un noteikt, vai vielas, kas spēj kontrolēt nc886 ekspresiju, varētu regulēt šūnu novecošanos.

Replikatīvajos novecošanās fibroblastos nc886 ekspresija tika samazināta, bet metilētā nc886 palielinājās. Bija izmaiņas novecošanās biomarķieros, tostarp SA- -gal aktivitātē un p16INK4A un p21Waf1/Cip1 ekspresijā novecojošās šūnās. Šie atklājumi liecina, ka nc886 samazināšanās, kas saistīta ar novecošanos, ir saistīta ar fibroblastu šūnu novecošanos un ka pieaugošā nc886 ekspresija var nomākt šūnu novecošanos. AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC) palielināja nc886 ekspresiju un uzlaboja fibroblastu šūnu novecošanos, inhibējot ar vecumu saistītus biomarķierus. Šie rezultāti liecina, ka nc886 ir potenciāls kā jauns mērķis pret novecošanos un ka ATC var būt spēcīga epiģenētiska pretnovecošanās sastāvdaļa.

Šūnu novecošanās ir plašs termins, kas aptver tādas parādības kā samazināta šūnu funkcija, samazināta proliferācijas spēja un DNS bojājumi, ko izraisa daudzi faktori. Šūnu novecošanās nav atsevišķs, paredzams process, bet gan dažādu fizioloģisko, ģenētisko un vides faktoru kopums. Pētījumā tika atklāts, ka Cistanche var pretoties novecošanai, jo Cistanche pretnovecošanās princips galvenokārt ir saistīts ar dažādām tajā esošajām aktīvajām sastāvdaļām. Cistanche ir bagāta ar dažādām bioloģiski aktīvām vielām, piemēram, polisaharīdiem, flavonoīdiem, acetofenoniem utt. Tostarp polisaharīds ir viena no galvenajām Cistanche aktīvajām sastāvdaļām, kam ir dažādas veselības funkcijas, piemēram, imunitātes uzlabošana, antioksidācija, regulē vielmaiņu utt., kā arī var atvieglot organisma novecošanās pakāpi.

Click cistanche tubulosa priekšrocības

Atslēgvārdi:

fibroblasti; replikatīva novecošanās; epiģenētiskā regulēšana; nc886; zaļās tējas ekstrakts.

1. Ievads

Šūnu novecošanās neatgriezeniskā stāvoklī pēc šūnu proliferācijas apturēšanas ir kļuvusi par potenciāli nozīmīgu audu disfunkcijas un organismu novecošanas veicinātāju [1]. Novecošanai raksturīga augsta ar novecošanos saistītās beta-galaktozidāzes (SA- -gal) aktivitāte, palielināta novecošanās biomarķieru, piemēram, p16INK4A un p21Waf1/Cip1, ekspresija un samazināta LaminB1 ekspresija [2]. Ir divi galvenie šūnu novecošanās veidi: replikatīvā novecošanās un stresa izraisīta priekšlaicīga novecošanās. Replicatīvā novecošanās ir definēta kā parādība, kad normālas šūnas pārtrauc dalīties pēc ierobežota dalījumu skaita sasniegšanas. Tas ir saistīts ar hronoloģisko novecošanos. Nepārtraukta bojājumu uzkrāšanās var izraisīt fibroblastu replikācijas novecošanos, kā rezultātā tiek zaudēta spēja pārveidot un organizēt ekstracelulāro matricu (ECM). Galvenās novecojušās dermas pazīmes ir samazināts kolagēna šķiedru daudzums un palielināta matricas metaloproteināžu (MMP) ražošana, kas veicina plānu un neorganizētu dermas struktūru [3,4].

Epiģenētiskie regulējošie mehānismi ir galvenie novecošanās procesa starpnieki, pielāgojoties stresa faktoriem un ar vecumu saistītām izmaiņām genomiskajā un molekulārajā vidē. Šīs epiģenētiskās izmaiņas notiek dažādos līmeņos, tostarp masveida histona kodola samazināšanās, histona deformācija ar pēctranslācijas modifikāciju un DNS metilēšanu, kanonisko histonu aizstāšana ar histona variantiem un mainīta nekodējošās RNS (ncRNS) ekspresija organisma un replikācijas novecošanās laikā [5] ,6]. nc886 ir 101 nukleotīdu garš ncRNS, kas var saistīties ar mērķa proteīnu, tādējādi mediējot proteīna aktivitāti un kontrolējot gēnu ekspresiju [7]. nc886 ir ierosināts arī kā audzēja nomācējs, kas lielā mērā izriet no tā ekspresijas modeļa un genoma atrašanās vietas cilvēka hromosomā 5q31, audzēja supresora gēna lokusā. nc886 ekspresijas iezīme ir bieža ļaundabīgo audzēju apklusināšana ar CpG DNS metilēšanu promotora reģionā [8]. Pamatojoties uz iepriekšējiem pētījumiem, mēs esam noskaidrojuši, ka nc886 ekspresijas samazināšanās, ko izraisa UVB apstarošana, ir saistīta ar COX-2 un MMP-9 palielināšanos, izmantojot proteīnkināzes RNS aktivētu (PKR) ceļu keratinocītos un ka nc886 ekspresijas veicināšana var būt noderīga stratēģija UVB aizsargājošu materiālu izstrādei [9, 10].

Zaļā tēja ir pētīta kā līdzeklis dažādu dermatoloģisku stāvokļu, piemēram, pūtīšu, rosacejas, psoriāzes, vīrusu kārpu un pat ādas vēža ārstēšanai. Fenola savienojumi, tostarp gallskābe (GC) un epigallokatehīna gallāts (EGCG), ir labi zināmi zaļās tējas aktīvie savienojumi. (-)-Epigallokatehīna-3-(3"-O-metil)galāts (3" Me-EGCG) ir unikāla O-metilēta EGCG forma, un to satur oolong tēja un zaļā tēja. Jo īpaši Jangwon Nr. 3 (zaļās tējas Amorepacific šķirnes) satur vairāk 3" Me-EGCG nekā citas zaļās tējas šķirnes [11]. Ir ziņots, ka 3" Me-EGCG piemīt antioksidanta un fotoaizsargājoša iedarbība uz keratinocītiem [12]. . Šajā pētījumā mēs pētījām nc886 lomu fibroblastu replikatīvajā novecošanā un noskaidrojām, vai augsti koncentrēts zaļās tējas 3" Me-EGCG preparāts (AbsoluTea Concentrate 2.{21}}), kas varētu palielināt nc886 ekspresiju, varētu uzlabot šūnu novecošanos.

2. Rezultāti

2.1. AbsoluTea koncentrāta 2 ķīmiskais profils.0 (ATC)

AbsoluTea Concentrate 2.0 (ATC) ķīmiskais profils ir parādīts 1.B attēlā. Rezultāti tika iegūti, izmantojot HPLC ATC, kas sagatavots, kā aprakstīts sadaļā Metode. ATC saturēja 30 procentus vai vairāk 3" Me-EGCG (1.B attēls). Ir zināms, ka zaļās tējas ekstrakts nesatur 3" Me-EGCG vai uzrāda koncentrāciju, kas ir mazāka par 6 procentiem [13,14]. Gan jauniem, gan novecojošiem fibroblastiem, kas apstrādāti ar ATC, nc886 ekspresija palielinājās vairāk nekā tiem, kas tika ārstēti ar 70% zaļās tējas etanola ekstraktu (papildu attēls S1A). Turklāt SA- -gal ekspresijas līmenis novecojošos fibroblastos, kas tika ārstēti ar ATC, tika samazināts vairāk nekā tiem, kas tika ārstēti ar zaļās tējas ekstraktu (papildu attēls S1B).

2.2. nc886 Regulē fibroblastu šūnu novecošanos

Lai novērotu nc886 lomu fibroblastu šūnu novecošanā, mēs izmantojām replikatīvu novecošanās modeli, izmantojot audzēšanu un subkultūru. Kā parādīts S2 papildattēlā, SA- -gal aktivitāte un novecojošo marķieru p16INK4A un p21Waf1/Cip1 ekspresijas līmeņi tika palielināti un Lamin B1 ekspresija tika samazināta novecojošos fibroblastos, salīdzinot ar jaunām šūnām. Daudzos iepriekšējos pētījumos ir ziņots, ka novecošanos izraisa oksidatīvais stress. Lai apstiprinātu, vai šī oksidatīvā stresa sērija ir saistīta ar šūnu novecošanos, tika mērīts ROS līmenis jaunos (p3) un novecojošos fibroblastos (p30). Rezultāti parādīja, ka ROS līmenis palielinājās līdz ar novecošanos (papildu attēls S2D).

Lai novērotu nc886 iespējamo ietekmi uz šūnu novecošanos fibroblastos, tika noteikts nc886 gēna ekspresijas līmenis katrā fragmentu skaitā. Nc886 ekspresijas līmenis tika samazināts, palielinoties fragmentu skaitam (2.A attēls). Ir ziņots, ka nc886 ekspresija tiek samazināta līdz ar CpG salu metilēšanu. Lai noteiktu, vai nc886 pazemināšanos novecojošos fibroblastos izraisīja nc886 metilēšana, tika veikta metilēšanai specifiska PCR. Kā parādīts 2.A attēlā, nc886 metilēšana tika palielināta, palielinoties pasāžu skaitam (2.A attēls). Šis rezultāts parāda, ka samazinātā nc886 ekspresija lielā fibroblastu caurlaidības skaitā ir saistīta ar nc886 DNS metilēšanas palielināšanos. Lai pārbaudītu nc886 lomu fibroblastu novecošanā, tika noteiktas izmaiņas novecojošos marķieros nc886 pārmērīgas ekspresijas un notriekšanas modeļos. Rezultāti atklāja, ka novecojošo fibroblastu grupa ar nc886 pārmērīgu ekspresiju uzrādīja samazinātu SA-beta-gal aktivitāti, samazinātu p16INK4A un p21Waf1/Cip1 ekspresijas līmeni un paaugstinātu laminB1 līmeni.

Turklāt ROS palielināšanos novecojošos fibroblastos samazināja nc886 pārmērīga ekspresija (2.B attēls). Un otrādi, jaunu fibroblastu grupā ar nc886 notriekšanu tika paātrināta šūnu novecošanās un palielināti šūnu novecošanas marķieru, piemēram, p16INK4A un p21Waf1 / Cip1, ekspresijas līmeņi (2.C attēls). Šie rezultāti liecina, ka nc886 var regulēt fibroblastu šūnu novecošanos, regulējot novecošanās marķieru ekspresiju (attēls 2B, C).

2.3. ATC mazina šūnu novecošanos, regulējot nc886 ekspresiju

Iepriekš iegūtie rezultāti parādīja, ka nc886 ekspresijas palielināšana var uzlabot šūnu novecošanos, mediējot novecojošus marķierus. Lai novērotu ATC ietekmi uz nc886 ekspresiju, ekspresijas līmenis un nc886 metilēšana novecojošos fibroblastos tika novērtēts pēc apstrādes ar ATC necitotoksiskā koncentrācijā (3.A attēls). Kā parādīts 3B un C attēlā, ATC ievērojami palielināja nc886 ekspresiju un samazināja nc886 metilēšanu atkarībā no koncentrācijas. Šis rezultāts parādīja, ka nc886 ekspresijas palielināšanās ar ATC tika saistīta ar nc886 metilēšanas kavēšanu. Turklāt mēs novērojām, ka ATC inhibēja SA- -gal aktivitāti un samazināja novecojošo marķieru p16INK4A un p21Waf1/Cip1 ekspresijas līmeņus novecojošos fibroblastos (3D, E attēls). Tomēr LaminB1 ekspresija, kas, kā zināms, samazinās līdz ar novecošanos, palielinājās novecojošos fibroblastos, kas tika ārstēti ar ATC (3.E attēls). Šie rezultāti parāda, ka ATC var mazināt šūnu novecošanos, palielinot nc886 ekspresiju.

2. attēls. nc886 regulē fibroblastu šūnu novecošanos. (A) nc886 un metilētā nc886 ekspresija saskaņā ar fragmentu tika apstiprināta ar reāllaika PCR un normalizēta ar 18s rRNS. (B) nc886 fragments, kas amplificēts un attīrīts no cilvēka genoma DNS, tika transficēts novecojošās šūnās ar Lipofectamine 3000. Pārmērīga ekspresija tika apstiprināta, novērojot nc886 ekspresiju ar reāllaika PCR un SA- -gal ekspresiju ar fluorescences mikroskopiju un plūsmas citometriju. Novecošanās marķiera proteīna ekspresija un intracelulārā ROS ģenerēšana tika novērota nc886 pārmērīgas ekspresijas modelī. (C) Šūnas tika transficētas ar anti-oligos (si-ctrl un si-nc886) koncentrācijā 250 ppm, izmantojot LipofectaminTM RNAiMAX reaģentu. nc886 notriekšana tika apstiprināta, novērojot nc886 ekspresiju ar reāllaika PCR un SA- -gal ekspresiju ar fluorescences mikroskopiju un plūsmas citometriju. Novecošanās marķieru ekspresija tika apstiprināta ar Western blot. Mēroga stieņi: 200 µm. Dati ir parādīti kā vidējais ± SD no trim neatkarīgiem testiem. *, p < 0,05; **, p < 0,01, salīdzinot ar kontroli.

2.4. ATC regulē ar vecumu saistītas izmaiņas ECM un SASP

Fibroblastu novecošanās īpašība ir tāda, ka palielinās kolagēnu noārdošā komponenta MMP-1 aktivitāte, savukārt kolagēna sintēze samazinās [15,16]. MMP-1 palielināšanās un kolagēna samazināšanās tika apstiprināta novecojošos fibroblastos ar lielu pasāžu skaitu (4.A attēls).

Tomēr ATC nomāca MMP{0}} ekspresiju un palielināja kolagēna sintēzi novecojošos fibroblastos. Šis rezultāts norāda, ka ATC var uzlabot ar vecumu saistītas ECM izmaiņas, regulējot MMP-1 ekspresiju un kolagēna sintēzi novecojošos fibroblastos (4.B attēls). Ir ziņots, ka ar novecošanos saistīts sekrēcijas fenotips (SASP), kurā novecojošas šūnas izdala specifiskus iekaisuma faktorus, augšanas faktorus un proteolītiskos enzīmus, veicina ar novecošanu saistītu slimību rašanos un progresēšanu [17–19]. Mēs novērojām ATC ietekmi uz SASP, īpaši pro-iekaisuma citokīniem, piemēram, IL-1, IL_6 un IL-8. Kā parādīts 4.C attēlā, ATC pazemināja novecošanās izraisīto IL-1, IL-6 un IL-8 ekspresijas līmeni. Tas liecina, ka ATC var iedarboties pret novecošanos, nomācot SASP.

3. Diskusija

Novecojošās šūnās notiek raksturīgas morfoloģiskas izmaiņas, kas ietver paplašinātu un bieži neregulāru kodola un hromatīna reorganizāciju. Ja novecošanos izraisa DNS bojājumi, replikācijas samazināšanās vai onkogēna ekspresija, Lamīns B1 galvenokārt tiek zaudēts. Dažādi iekšējie vai ārējie stresa faktori var izraisīt DNS bojājumu reakcijas (DDR) ceļu, lai aktivizētu p53 un/vai p16INK4A ceļu. p16INK4A var inaktivēt Cdk4/6, izraisīt fosforilētā pRb uzkrāšanos, traucēt E2F transkripcijas faktora regulēšanu un izraisīt šūnu cikla apstāšanos vai novecošanos [20, 21]. Palielināta reaktīvo skābekļa sugu (ROS) ražošana, ko galvenokārt ražo disfunkcionāli mitohondriji, var izraisīt šūnu novecošanos, pateicoties DNS bojājumiem un novecošanās signalizācijas ceļu transaktivācijai, tostarp p53, p16INK4A un p21Waf1/Cip1 [22].

Šajā pētījumā mēs atklājām, ka nc886 ekspresija tika samazināta, palielinoties pasāžu skaitam un ka nc886 ekspresijas regulēšana mazināja šūnu novecošanos, izmantojot LaminB1, p16INK4A, p21Waf1 / Cip1 un ROS ražošanu. nc886 transkribē RNS polimerāze III (Pol III) un apklusina ar CpG DNS hipermetilāciju daudzos ļaundabīgos audzējos [8]. Mēs novērojām, ka nc886 ekspresija tika samazināta, metilējot CpG salas novecojošos fibroblastos. Šis rezultāts norāda, ka CpG salu hipermetilēšana pasliktina nc886 funkcionalitāti kā šūnu novecošanās nomācēju.

Specifiski gēnu ekspresijas ceļi, ko ietekmē nc886, nav skaidri. Tie, iespējams, ietvers iepriekš ziņots par citām ncRNS. nc886 var spēlēt kritisku lomu šūnu novecošanā, tieši vai netieši mediējot novecošanās signalizācijas ceļu hromatīna struktūras, transkripcijas faktora aktivitātes, pēctranskripcijas un pēctranslācijas gēnu regulēšanas līmeņos [23]. Piemēram, nc886 var būt starpnieks šūnu cikla progresēšanas novecošanās ceļā.

Ir ziņots, ka AK156230 kā ncRNS ir saistīta ar fibroblastu replikācijas novecošanās indukciju, pateicoties tās lomai autofagijā un šūnu cikla progresēšanā. AK156230 inducēta šūnu pazemināšana, lai parādītu novecošanās reakcijas, aktivizējot p53 un p21, vienlaikus samazinot ciklīna atkarīgo kināzi 1 (CDK1) [24]. Ar novecošanos saistītie ncRNA1 (SAL-RNA1), MALAT1 un MIAT ir pazīstami kā negatīvi šūnu novecošanās regulatori. Tie ir samazināti novecojošos fibroblastos. Šo gēnu pazemināšana var izraisīt novecošanās marķieru, piemēram, SA-gal, p16, p21 un p53, palielināšanos [25]. MALAT1 ietekme uz šūnu novecošanos tika panākta, samazinot onkogēno transkripcijas faktoru b-Myb/Mybl2.

Lai gan novecošanas laikā tiek ietekmēta dažādu ncRNS ekspresija, tikai daži ir funkcionāli iesaistīti novecošanā. Tā kā ncRNS lokalizācija ir svarīga, lai izprastu funkcijā iesaistītos mehānismus, kodolenerģijas un citoplazmas ncRNS tiek apspriestas atsevišķi, aprakstot molekulāros mehānismus, kas ietekmē novecošanos [26]. Citoplazmā esošā ncRNS var darboties kā translācijas regulators, savienojot bāzi pārī ar mērķa mRNS [27]. ncRNS var ietekmēt olbaltumvielu ekspresijas līmeni, palielinot vai samazinot mRNS stabilitāti [28].

Piemēram, RAS izraisītas novecošanas laikā citoplazmas UCA1 veicina p16 mRNS stabilizāciju, sekvestrējot hnRNPA1 [29]. nc886 satur proteīnkināzes RNS aktivētu (PKR) saistīšanās vietu. PKR-nc886 saistīšanās var kavēt PKR aktivitāti. PKR, citoplazmas receptors divpavedienu RNS (dsRNS), regulē serīna/treonīna proteīnkināze, ko aktivizē infekcija, citokīni, oksidatīvais stress un apstarošana (tostarp UV), izraisot sekojošu iekaisuma un apoptozes indukciju [20]. ,21] [30,31]. nc886 saistās ar PKR ar afinitāti, kas ir salīdzināma ar dsRNS, un neļauj PKR aktivizēties. nc886 knockdown izraisa eikariotu iniciācijas faktora 2 apakšvienības (eIF2) fosforilēšanos caur PKR ceļu, kas izraisa šūnu nāvi un kavē globālo šūnu proteīnu sintēzi. Ir ziņots, ka COX-2, IL-8 un MMP veidošanos ar TNF- starpniecību cilvēka hondrocītos nodrošina PKR ceļš [32].

Iepriekšējā pētījumā mēs arī pierādījām, ka UVB izraisītu iekaisumu var regulēt, izmantojot nc886-PKR ceļu keratinocītos [10]. Turklāt PKR ir saistīts ar oksidatīvā stresa izraisītiem bojājumiem jaundzimušo sirds miocītos. PKR inhibīcija aizsargā pret H2O2-inducētiem ievainojumiem, mazinot apoptozi un iekaisumu [33]. Iekaisums un oksidatīvais stress ir galvenie faktori, kas izraisa novecošanās procesu. Tādējādi PKR ceļš var būt starpnieks fibroblastu šūnu novecošanai, ko izraisa nc886 izsīkums. Lai noskaidrotu detalizēto regulējošo mehānismu, kas saistīts ar nc886 ietekmi uz fibroblastu šūnu novecošanos, ir nepieciešami turpmāki pētījumi.

Iepriekšējos pētījumos plaši ziņots par zaļās tējas ekstrakta pretnovecošanās iedarbību. Zaļās tējas antioksidanta un pretiekaisuma iedarbība ir labi zināmi mehānismi, kas veicina tās pretnovecošanās efektu. Sākotnējā pārbaudē mēs atklājām, ka ATC ievērojami palielināja nc886 ekspresiju par vairāk nekā 70 procentiem zaļās tējas etanola ekstrakta (papildu attēls S1A). Šis rezultāts liecina, ka koncentrēti katehīni, tostarp 3" Me-EGCG, var būt saistīti ar nc886 ekspresijas regulēšanu. Lai noteiktu, vai nc886 stimulējošais līdzeklis var novērst šūnu novecošanos, mēs novērojām ATC ietekmi uz novecojošiem fibroblastiem. ATC palielināja nc886 ekspresiju par inhibējot nc886 gēna metilēšanas līmeni novecojošos fibroblastos (3.B, C attēls). ATC arī atviegloja šūnu novecošanos, mediējot novecojošus biomarķierus, piemēram, SA- -gal aktivitāti, LaminB1, p16INK4A un p21Waf1/Cip1 (3E. attēls). ). Turklāt ATC atjaunoja palielinātu MMP-1 un samazinātu kolagēna veidošanos, ko izraisīja šūnu novecošanās (attēls 4B). SASP faktori nedaudz atšķiras atkarībā no šūnas veida un novecošanās izraisītā stresa veida, tie parasti ir pazīstami kā NF-κB mērķa gēni, kas regulē pro-iekaisuma citokīnus, piemēram, IL-6 un IL-8.

Šajā pētījumā mēs apstiprinājām, ka ATC nomāca paaugstinātu IL-1, IL_6 un IL-8 ekspresiju novecojošās šūnās (4.C attēls). Mēs nevaram izslēgt iespēju, ka zaļās tējas uzlabojošā ietekme uz šūnu novecošanos tiek panākta ar vairākiem mehānismiem, tostarp nc886 regulēšanu, antioksidāciju un pretiekaisuma iedarbību. Tomēr mūsu rezultāti liecina, ka ATC palielinātajam nc886 līmenim ir izšķiroša loma šūnu novecošanās nomākšanā, kas pēc tam ietekmē fibroblastu ECM ražošanu.

4. Materiāli un metodes

4.1. ATC sagatavošana

Šajā pētījumā izmantotās kaltētas zaļās tējas lapas (Camellia sinensis var. sinensis cv. Jangwon Nr. 3) tika iegūtas no tējas augiem, kas audzēti Dolsongi tējas dārzā (33◦16023.900 N 126◦28058.300 E), Jeju, Dienvidkoreja. Sausās tējas lapas (170 g) ekstrahēja ar 70% EtOH (v/v) istabas temperatūrā 16 stundas. Pēc tam ekstrakts tika pulverizēts, izmantojot liofilizatoru (TF10D, TEFIC BIOTECH, Xian, Ķīna). Lai sagatavotu ATC, EtOH ekstrakts tika desmitkārtīgi koncentrēts ar rotācijas iztvaicētāju un ievietots kolonnā, kas pildīta ar AB-8 sveķiem (iekšējais diametrs 5 cm, garums 45 cm). Kolonnas šķīdinātāja eluēšana tika veikta ar 4 reizes lielāku gultas tilpumu (BV) 20%, 30% un 100% EtOH (v/v). Šajā pētījumā atlikušie šķīdinātāji kolonnā tika noņemti ar gaisa kompresoru pirms eluēšanas. 30% EtOH eluāts tika koncentrēts divdesmit reizes un tika uzklāts uz poliamīda kolonnas (iekšējais diametrs 2,5 cm, garums 40 cm). Poliamīda kolonna tika eluēta 5 reizes BV no 10 procentiem un 100 procentiem EtOH. 100% EtOH eluāts tika rūpīgi koncentrēts un liofilizēts.

4.2. Šūnu kultūra un šūnu apstrāde ar ATC

Cilvēka ādas fibroblasti (HDF) tika iegādāti no ATCC (Manassas, VA, ASV). Šūnu kultivēšana tika veikta kontrolētos apstākļos 37 ◦C ar 5 procentiem CO2, izmantojot Dulbecco modificēto Eagle barotni (WELGENE, Daegu, Korea), kas papildināta ar 10 procentiem liellopu augļa seruma (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV) un 1 procentu penicilīna. -streptomicīns (WELGENE, Daegu, Koreja). Šūnas tika iesētas 6-iedobju plāksnēs ar blīvumu 2 × 105 šūnas uz plāksni. Pēc 60 procentu saplūšanas sasniegšanas tie tika apstrādāti ar norādīto ATC koncentrāciju 72 stundas.

4.3. SA- -Gal krāsošanas un plūsmas citometrijas analīze

Šūnas tika iekrāsotas, izmantojot SPiDER- -Gal (Dojindo, Kumamoto, Japāna) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Šūnas tika analizētas ar EVOS® FL šūnu attēlveidošanas sistēmu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV) un BD FACS Calibur plūsmas citometru (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, ASV).

4.4. Intracelulārais ROS mērījums

Intracelulārās ROS veidošanās tika uzraudzīta, izmantojot C20, 70 -dihlordihidrofluoresceīna diacetātu (H2DCFDA; Molecular Probes), fluorescējošu ROS indikatoru. Šūnas tika inkubētas ar H2DCFDA (5 µM) 30 minūtes 37 °C temperatūrā. Ar šūnām saistītā fluorescence tika noteikta ar BD FACS Calibur plūsmas citometru (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, ASV).

4.5. Reāllaika PCR un metilēšanai specifiska PCR

Kopējā RNS tika ekstrahēta, izmantojot TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV). RNS kvantitatīvie mērījumi tika veikti, izmantojot Epoch mikroplates spektrofotometru (BioTek, Winooski, VT, ASV). cDNS tika sintezēts, izmantojot am-fiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GenDEPOT, Barker, TX, ASV). Genomiskā DNS tika ekstrahēta, izmantojot AccuPrep® Genomic DNS ekstrakcijas komplektu (BIONEER, Daejeon, Koreja). Bisulfīta konversija tika veikta, izmantojot EZ DNS metilēšanas komplektu (Zymo Research, CA, ASV). Lai veiktu qRT-PCR, tika izmantots AMPIGENE® cDNS sintēzes komplekts (Enzo Life Sciences Inc., Farming-dale, NY, ASV) un ABI7500 reāllaika PCR sistēma (Ambion Inc, Austin, TX, ASV). Šajā pētījumā izmantotās primeru sekvences ir aprakstītas 1. tabulā.

4.6. Laktāta dehidrogenāzes tests

LDH tests tika izmantots, lai noteiktu citotoksicitāti, mērot laktāta dehidrogenāzes (LDH) aktivitāti, kas izdalās no bojātām šūnām. Pārbaude tika veikta, izmantojot LDH citotoksicitātes WST testa komplektu (Enzo life sciences, Farmingdale, NY, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem.

4.7. DNS transfekcija nc886 pārmērīgai ekspresijai un siRNS transfekcija nc886 notriekšanai

Lai iegūtu DNS nc886 pārmērīgai ekspresijai šūnās, DNS tika pastiprināta ar AccuPower® PCR PreMix (BIONEER, Daejeon, Korea), izmantojot HDF genoma DNS kā veidni un šādus primerus, kas aprakstīti 2.

Pastiprinātā DNS tika attīrīta, izmantojot QIAquick PCR attīrīšanas komplektu (QIAGEN, Hilden, Vācija). Attīrītā DNS tika transficēta ar LipofectamineTM 3000 reaģentu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV). Lai iznīcinātu nc886, šūnas tika transficētas ar anti-oligos (si-ctrl un si-nc886) koncentrācijā 250 pM, izmantojot Lipofectamine™ RNAiMAX reaģentu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV).

4.8. Western blotēšana

Šūnu lizāti tika sagatavoti ar PRO-PREP™ proteīna ekstrakcijas šķīdumu (iNtRON Biotechnology, Gyeonggi do, Koreja). Kopējie proteīni tika atdalīti ar NuPAGE elektroforēzes sistēmu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV) un pārnesti uz polivinilidēna difluorīda (PVDF) membrānām. Imunoblotēšana tika veikta, izmantojot primāro antivielu pret p16INK4A, p21Waf1/Cip1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, ASV), MMP1, Col1A2 un -aktīnu (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dalasa, TX, ASV). Joslu skenēšanas densitometriskās vērtības tika analizētas, izmantojot ImageJ, programmatūras versiju 1.52a (Nacionālais veselības institūts, Bethesda, MD, ASV).

4.9. Ar enzīmiem saistīta imūnsorbcijas pārbaude

Pēc norādītās inkubācijas kolagēns (Procollagen Type I C-Peptide EIA Kit, Takara, Shiga, Japāna) un MMP-1 (R&D Systems, Mineapolis, MN, ASV) kultūras supernatantā tika mērīts, izmantojot ar enzīmu saistīto imūnsorbcijas testu. (ELISA) komplektu, ievērojot ražotāja norādījumus.

4.10. Statistiskā analīze

Visi rezultāti ir parādīti kā vidējā ± standarta novirze (SD). Atšķirības starp abām grupām tika novērtētas ar t-testu vai dispersijas analīzi (ANOVA), izmantojot GraphPad Prism. Statistiskā nozīmība tika norādīta kā p < 0.05 vai p < 0,01.

5. Secinājumi

Visbeidzot, nc886 ekspresijas regulēšana var būt potenciāls šūnu novecošanās mērķis fibroblastos, un ATC var būt spēcīga epiģenētiska pretnovecošanās sastāvdaļa.

Autora ieguldījums:

Konceptualizācija, YK, KH un EJ; metodika YK, HJ, N.-HP un K.-SL; datu apkopošana, YK, HJ un EC; izmeklēšana, YK, HJ, EC, K.-SL, N.-HP un EJ; projektu administrēšana, WP, DP un EJ; resursi, WP un DP; uzraudzība, DP un EJ; rakstīšana — oriģināls melnraksts, YK; rakstīšana — pārskatīšana un rediģēšana, N.-HP, KH, WP, DP un EJ Visi autori ir izlasījuši un piekrituši publicētajai manuskripta versijai.

Finansējums:

Šis pētījums nesaņēma ārēju finansējumu.

Institucionālās pārbaudes padomes paziņojums:

Nav piemērojams.

Informētas piekrišanas paziņojums:

Nav piemērojams.

Paziņojums par datu pieejamību:

Dati būs pieejami pēc pieprasījuma.

Interešu konflikti:

Autori paziņo, ka nav interešu konflikta.

Atsauces

1. Campisi, J.; d'Adda di Fagagna, F. Šūnu novecošanās: Kad sliktas lietas notiek ar labām šūnām. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007, 8, 729–740. [CrossRef] [PubMed]

2. Kapūrs, VK; Dureja, J. Novecošana: pieejas tās kontrolei. Narkotiku disks. Šodien Ther. stratēģija. 2010, 7, 43–44. [CrossRef]

3. Fišers, Dž. Kangs, S.; Varāni, J.; Bata-Csorgo, Z.; Van, Y.; Datta, S.; Voorhees, JJ Fotonovecošanās un hronoloģiskās ādas novecošanas mehānismi. Arch. Derm. 2002, 138, 1462–1470. [CrossRef]

4. Tigžs, Dž.; Krutmans, J.; Fritsche, E.; Hendelers, J.; Schaal, H.; Fišers, JW; Kalfala, F.; Reinke, H.; Reifenbergers, G.; Stūlers, K.; un citi. Fibroblastu novecošanās pazīmes. Meh. Aging Dev. 2014, 138., 26.–44. [CrossRef]

5. Brunete, A.; Berger, SL Novecošanās un ar novecošanu saistītu slimību epigenētika. J. Gerontols. A Biol. Sci. Med. Sci. 2014, 69, S17–S20. [CrossRef] [PubMed]

6. Moskaļevs, AA; Aliper, AM; Smits Makbraids, Z.; Buzdiņš, A.; Žavoronkovs, A. Novecošanās un ilgmūžības ģenētika un epiģenētika. Šūnu cikls 2014, 13, 1063–1077. [CrossRef]

7. Lī, K.; Kunkeaw, N.; Džeons, SH; Lī, I.; Džonsons, BH; Kangs, GY; Bang, JY; Parks, HS; Leelayuwat, C.; Lee, YS Precursor miR-886, jauna nekodējoša RNS, kas tiek represēta vēža gadījumā, saistās ar PKR un modulē tā darbību. RNS 2011, 17, 1076–1089. [CrossRef] [PubMed]

8. Parks, JL; Lī, YS; Dziesma, MJ; Hong, SH; Ahn, JH; SEO, EH; Shin, SP; Lī, SJ; Džonsons, BH; Stampfer, MR; un citi. RNS polimerāzes III transkripciju epiģenētiskā regulēšana agrīnā krūts audzēja ģenēzē. Onkogēns 2017, 36, 6793–6804. [CrossRef] [PubMed]

9. Lī, KS; Šīns, S.; Čo, E.; Im, WK; Džeons, SH; Kims, Y.; Parks, D.; Frešē, M.; Čadžra, H.; Jung, E. nc886, nekodējoša RNS, inhibē UVB izraisītu MMP-9 un COX-2 ekspresiju caur PKR ceļu cilvēka keratinocītos. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2019, 512, 647–652. [CrossRef] [PubMed]

10. Lī, KS; Čo, E.; Veons, JB; Parks, D.; Frešē, M.; Čadžra, H.; Jung, E. Laminaria japonica ekstrakta izraisīta UVB izraisīta iekaisuma inhibīcija, regulējot nc886-PKR ceļu. Uzturvielas 2020, 12, 1958. [CrossRef]

11. Ji, HG; Lī, YR; Lī, MS; Hvanga, KH; Kima, EH; Parks, JS; Hong, YS Epigallokatehīna-3-O-(3-Ometil)-galāta (EGCG300Me) un aminoskābju profilu identifikācija dažādās tējas (Camellia sinensis L.) šķirnēs. Datu īss apraksts. 2017, 14, 607–611. [CrossRef]

12. Kims, E.; Han, SY; Hvangs, K.; Kims, D.; Kims, EM; Hossain, MA; Kims, Dž. Cho, JY (-)-epigallokatehīna-3-(300-O-metil)gallāta antioksidanta un citoprotektīvā iedarbība. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 3993. [CrossRef]

13. Huana, LH; Liu, CY; Vanga, LY; Huangs, CJ; Hsu, CH Zaļās tējas ekstrakta ietekme uz sievietēm ar lieko svaru un aptaukošanos ar augstu zema blīvuma lipoproteīnu holesterīna (ZBL-C) līmeni: Randomizēts, dubultmaskēts un krusteniski placebo kontrolēts klīniskais pētījums. BMC papildinājums. Altern. Med. 2018, 18, 294. [CrossRef] [PubMed]

14. Soares, S.; Soares, S.; Brandao, E.; Gerreiro, C.; Mateus, N.; de Freitas, V. Perorāla mijiedarbība starp zaļās tējas flavanola ekstraktu un sarkanvīna antocianīna ekstraktu, izmantojot jaunu uz šūnām balstītu modeli: Ieskats dažādu mutes epitēlija ietekmē. Sci. Rep. 2020, 10, 12638. [CrossRef] [PubMed]

15. Levijs, N.; Papismadovs, N.; Solomonovs, I.; Sagi, I.; Križanovskis, V. ECM novecošanās ceļš novecošanā: komponenti un modifikatori. FEBS J. 2020, 287, 2636–2646. [CrossRef] [PubMed]

16. Pitoci, V.; Mocali, A.; Laurenzāna, A.; Džanoni, E.; Cifola, I.; Battaglija, C.; Kjarudži, P.; Dolāra, P.; Giovannelli, L. Hroniska resveratrola ārstēšana uzlabo šūnu adhēziju un mazina iekaisuma fenotipu novecojošos cilvēka fibroblastos. J. Gerontols. Ser. 2013, 68, 371–381. [CrossRef] [PubMed]

17. Kope, JP; Patils, CK; Rodjē, F.; Saule, Y.; Munozs, DP; Goldšteins, J.; Nelsons, PS; Desprē, PY; Campisi, J. Ar novecošanos saistītie sekrēcijas fenotipi atklāj onkogēnās RAS un p53 audzēja supresora šūnu neautonomās funkcijas. PLoS Biol. 2008, 6, 2853–2868. [CrossRef]

18. Čkonija, T.; Žu, Y.; van Deursens, J.; Campisi, J.; Kirkland, JL. Šūnu novecošanās un novecojošais sekrēcijas fenotips: terapeitiskās iespējas. Dž.Klins. Izpētīt. 2013, 123, 966–972. [CrossRef] [PubMed]

19. Munozs-Espins, D.; Serrano, M. Šūnu novecošanās: no fizioloģijas līdz patoloģijai. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2014, 15, 482–496. [CrossRef]

20. Lāgers, G.; O'Kerols, D.; Rembolds, M.; Khier, H.; Tišlers, J.; Veicers, G.; Šūtengrūbers, B.; Hauzers, C.; Brunmeirs, R.; Jenuveins, T.; un citi. Histona dezacetilāzes 1 būtiska funkcija proliferācijas kontrolē un CDK inhibitoru apspiešanā. EMBO J. 2002, 21, 2672–2681. [CrossRef] [PubMed]

21. Freitasa-Rodrigeza, S.; Folgueras, AR; Lopez-Otin, C. Matricas metaloproteināžu loma novecošanā: audu remodelēšana un tālāk. Biochim. Biophys. Acta Mol. Cell Res. 2017., 1864., 2015.–2025. [CrossRef]

22. Viktorelli, S.; Passos, JF Reaktīvā skābekļa sugu noteikšana novecojošās šūnās. Metodes Mol. Biol. 2019, 1896, 21.–29. [PubMed]

23. Puvvula, PK LncRNAs Regulatory Networks in Cellular Senescence. Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 2615. [CrossRef] [PubMed]

24. Čens, YN; Cai, MANS; Sju, S.; Mengs, M.; Ren, X.; Yang, JW; Dongs, YQ; Liu, X.; Jans, Dž. M.; Xiong, XD LncRNS AK156230 identificēšana kā jauns šūnu novecošanās regulators peles embriju fibroblastos. Oncotarget 2016, 7, 52673–52684. [CrossRef] [PubMed]

25. Abdelmohsens, K.; Panda, A.; Kangs, MJ; Sju, Dž.; Selimjans, R.; Yoon, JH; Martindeila, JL; De, S.; Koksne, WH, 3.; Bekers, KG; un citi. Ar novecošanos saistītas lncRNS: ar novecošanu saistītas garas nekodējošas RNS. Aging Cell 2013, 12, 890–900. [CrossRef]

26. Montess, M.; Lund, AH Jaunās lncRNS lomas novecošanās laikā. FEBS J. 2016, 283, 2414–2426. [CrossRef] [PubMed]

27. Carrieri, C.; Cimatti, L.; Biagioli, M.; Beignet, A.; Cučelli, S.; Fedele, S.; Pesce, E.; Ferers, I.; Kolavins, L.; Santoro, C.; un citi. Gara nekodējoša antisense RNS kontrolē Uchl1 translāciju, izmantojot iegulto SINEB2 atkārtojumu. Daba 2012, 491., 454.–457. [CrossRef]

28. Krecs, M.; Siprashvili, Z.; Chu, C.; Webster, DE; Zehnder, A.; Qu, K.; Lī, CS; Flockhart, RJ; Groff, AF; Čovs, Dž.; un citi. Somatisko audu diferenciācijas kontrole ar garu nekodējošu RNS TINCR. Daba 2013, 493, 231–235. [CrossRef] [PubMed]

30. Kumars, PP; Emechebe, U.; Smits, R.; Franklins, S.; Mūrs, B.; Jandels, M.; Lesnika, SL; Moon, AM Koordinēta novecošanās kontrole ar lncRNS un jaunu T-box3 līdzrepresora kompleksu. Elife 2014, 3, e02805. [CrossRef]

30. Freunds, A.; Laberģe, RM; Demarija, M.; Campisi, J. Lamin B1 zudums ir ar novecošanu saistīts biomarķieris. Mol. Biol. Šūna 2012, 23, 2066–2075. [CrossRef]

31. Gal-Ben-Ari, S.; Barera, I.; Ērlihs, M.; Rosenblum, K. PKR: Kināze, kas jāatceras. Priekšpuse. Mol. Neirosci. 2018, 11, 480. [CrossRef] [PubMed]

32. Ma, CH; Wu, CH; Jou, IM; Tu, YK; Pakārts, CH; Hsieh, PL; Tsai, KL PKR aktivācija izraisa iekaisumu un MMP-13 sekrēciju cilvēka deģenerētos locītavu hondrocītos. Redox Biol. 2018, 14, 72–81. [CrossRef] [PubMed]

33. Van, Y.; Vīrieši, M.; Xie, B.; Šans, Dž.; Vangs, C.; Liu, J.; Džens, H.; Jans, V.; Sjue, S.; Guo, C. PKR inhibīcija aizsargā pret H2O2 - izraisītiem jaundzimušo sirds miocītu bojājumiem, mazinot apoptozi un iekaisumu. Sci. Rep. 2016, 6, 38753–38763. [CrossRef] [PubMed]

Yuna Kim 1 , Hyanggi Ji 1 , Eunae Cho 1 , Nok-Hyun Park 2 , Kyeonghwan Hwang 2 , Wonseok Park 2 , Kwang-Soo Lee 1 , Deokhoon Park 1 un Eunsun Jung 1,*.

1 Biospectrum Life Science Institute, A-1805, U-TOWER, Yongin-si 16827, Koreja; bioyn@biospectrum.com (YK); biocr@biospectrum.com (HJ); biozr@biospectrum.com (EK); bioyc@biospectrum.com (K.-SL); pdh@biospectrum.com (DP)

2 Pamatpētījumu un inovāciju nodaļa, Amorepacific Corporation R&D centrs, Youngin-si 17074, Koreja; aquareve@amorepacific.com (N.-HP); khhwang@amorepacific.com (KH); wspark@amorepacific.com (WP)

* Correspondence: bioso@biospectrum.com

For more information:1950477648@nn.com