Bu-Shen-Huo-Xue ekstrakta neiroprotektīvā iedarbība pret augstu glikozes izraisītu apoptozi PC12 šūnās

Lai iegūtu vairāk informācijas:ali.ma@wecistanche.com

Shao-Yang Zhao, Xin Dong, Peng-Fei Tu, Ke-Wu Zeng, Xue-Mei Wang

1 Tradicionālās un Rietumu medicīnas integrācijas pētījumu studija, pirmā slimnīca, Pekinas universitāte, Pekina, Ķīna.

2 Valsts galvenā dabisko un biomimētisko zāļu laboratorija, Farmācijas zinātņu skola, Pekinas Universitāte, Pekina, Ķīna.

Izceļ

Augsta glikozes (HG) izraisīta neirotoksicitāte ir saistīta ar patoloģijudiabētiķisencefalopātija (DE). Mūsu pētījumā ir parādīts Bu-Shen-Huo-Xue ekstrakts (BSHX), kas ir daudzveidīga augu formulaneiroprotektīvsaktivitāte uz HG inducētām PC12 šūnām un iespējamie mehānismi var būt saistīti ar reaktīvo skābekļa sugu (ROS) veidošanās, kā arī mitohondriju mediētās kaspāzes un JNK/p38 MAPK signalizācijas ceļu nomākšanu. Šis pētījums ir daudzsološs līdzeklis DE ārstēšanai klīniskos lietojumos.

Noklikšķiniet, lai iegūtu cistanche ekstrakta priekšrocības un Cistanche nierēm

Cistancheir labi zināms tonizējošs augs, kas var barot un aizsargātnieres. Tradicionālās ķīniešu medicīnas teorijāCistancheir labākais garšaugsnieres.Cistancheir bagāts ar ehinakozīdu, akteozīdu un flavonoīdiem. Šīs efektīvās sastāvdaļasCistanchevar samazinātnieresšūnu apoptozi un pieaugumunieresšūnu proliferācija. TāpēcCistancheirdabīgs nieru papildinājums.

Abstrakts

Mērķis: izpētīt Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX) ekstrakta, daudzu augu formulas, neiroprotektīvo iedarbību pret augsta glikozes (HG) izraisītu neirotoksicitāti PC12 šūnās. Metodes: Tika veikts šūnu dzīvotspējas tests, laktātdehidrogenāzes (LDH) tests, reaktīvo skābekļa sugu (ROS) noteikšana, Hoechst 33258, akridīna oranža (AO)/etīdija bromīda (EB) dubultkrāsošana un mitohondriju membrānas potenciāla (MMP) pārbaude. Turklāt ar Western blot tika atklātas Bax, Bcl-2, kaspāzes-3, šķeltās kaspāzes-3, PARP, šķeltās PARP, citohroma c un mitogēna aktivētās proteīna kināzes (MAPK). Rezultāti: BSHX ekstrakts palielināja šūnu dzīvotspēju un samazināja LDH noplūdi no koncentrācijas atkarīgā veidā HG inducētās PC12 šūnās. Turklāt BSHX ekstrakts samazināja intracelulāro ROS līmeni, palielināja mitohondriju membrānas potenciālu, regulēja Bax un Bcl -2 izpausmes un kavēja citohroma c izdalīšanos no mitohondrijiem. Turklāt BSHX ekstrakts vājināja kaspāzes -3 un PARP aktivāciju un inhibēja c-Jun N-termināla kināzes (JNK) un p38 MAPK fosforilēšanos. Secinājums: BSHX ekstraktam bija ievērojama neiroprotektīva iedarbība uz HG izraisītu apoptozi PC12 šūnās. Šis efekts var būt saistīts ar ROS veidošanās, kā arī ar mitohondriju mediēto kaspāzes un JNK / p38 MAPK signalizācijas ceļu nomākšanu.

Atslēgvārdi:diabētiskā encefalopātija, tradicionālā ķīniešu medicīna, Bu-Shen-Huo-Xue ekstrakts,neiroprotektīvs, augsts glikozes līmenis

Saīsinājums: AO: akridīna oranžs; BSHX: Bu-Shen-Huo-Xue; DE: diabētiskā encefalopātija; DM: cukura diabēts; DMSO: dimetilsulfoksīds; EB: etīdija bromīds; ERK: ārpusšūnu regulētās proteīna kināzes; HG: augsts glikozes līmenis; JNK: c-Jun N-termināla kināze; LDH: laktātdehidrogenāze; MAPK: mitogēnu aktivētās proteīna kināzes; MWP: Wu-Zi-Yan-Zong recepte; MTT: 3-[4, 5-dimetiltiazol-2-il] 2, 5-difeniltetrazolija bromīds; PBS: fosfāta buferšķīdums; PBST: fosfātu buferšķīdums, 0,1 procents Tween 20; ROS: reaktīvā skābekļa sugas; T2DM: 2. tipa cukura diabēts; TCM: tradicionālās ķīniešu zāles

Fons

Pēdējos gados plašu uzmanību ir saņēmusi diabētiskā encefalopātija (DE), kas ir cukura diabēta (DM) komplikācija, kas rodas centrālajā nervu sistēmā (CNS). DE var būt saistīta ar vairākiem riska faktoriem, piemēram, diabēta vecumu, ilgumu un glikēmijas kontroli [1, 2]. DE klīniskās izpausmes ir morfoloģiskas un fizioloģiskas izmaiņas smadzenēs un no tām izrietoša kognitīvā disfunkcija. Hiperglikēmija, oksidatīvais stress un hronisks iekaisums var būt nozīmīgi DE patogēni [3]. Lai gan arvien vairāk eksperimentu ir parādījis, ka ilgstoša ilgstoša hiperglikēmija var paātrināt smadzeņu novecošanos, precīza DE patoģenēze nav izpētīta.

Apoptoze ir ieprogrammēta šūnu nāve, ko kontrolē gēni, lai saglabātu mikrovides stabilitāti. Apoptozē iesaistītās olbaltumvielas ietver Bcl-2 saimi, kaspāzes, p53 utt. Bcl-2 saime ir sadalīta divās kategorijās, no kurām viena veicina šūnu nāvi, piemēram, Bax, un otra pretojas apoptozei. piemēram, Bcl-2. Tie var regulēt apoptozi, izmantojot kaspāzes signalizācijas ceļu, kas ir kaskādes amplifikācijas reakcija neatgriezeniskā galīgā kaspāzes hidrolīzes substrātam [4-6]. Turklāt pētījumi ir parādījuši, ka augsta glikozes (HG) izraisīta apoptoze ir saistīta ar mitohondriju disfunkciju, DNS bojājumiem un pārmērīgu reaktīvo skābekļa sugu (ROS) veidošanos [7]. Pētījums ar diabētiskām pelēm parādīja, ka adenozīna 5'-monofosfāta (AMP) aktivētā proteīna kināze (AMPK), intracelulārais enerģijas un stresa receptors, var inhibēt ROS mediētu apoptozi. Turklāt arvien vairāk pierādījumu liecina, ka mitogēna aktivēto proteīna kināžu (MAPK) inhibīcija varētu būt noderīga neironu apoptozes kavēšanai. Cits ziņojums parādīja, ka c-Jun N-termināla kināze (JNK), ārpusšūnu regulētās proteīna kināzes (ERK), p38 MAPK signalizācijas ceļi var potenciāli regulēt neironu apoptozi [8, 9].

Balstoties uz tradicionālās ķīniešu medicīnas teoriju,nieresesences deficīts un asins stāze tiek uzskatīti par DE pamata patoģenēzi. Tāpēc barošanas stratēģijanieresun aktivizējošās asinis parasti izmanto DE klīniskos lietojumos. Iepriekšējie pētījumi varētu apstiprināt, ka modificētā Wu-Zi-Yan-Zong recepte (MWP), recepte, kuras mērķis ir barotnieres, var uzlabot kognitīvos traucējumus un aizsargāt neironus, samazinot A toksicitāti [10, 11]. Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX) recepte, kurā tiek pievienota dēle, pamatojoties uz MWP, ir īpaši izstrādāta, laibarotnieresun aktivizēt asinis. Nesenie pētījumi liecina, ka BSHX recepte var uzlabot DM pacientu atmiņas pasliktināšanās sindromu, kas liecina par spēcīgām neiroprotektīvām īpašībām [12]. Tomēr detalizēts BSHX farmakoloģiskais mehānisms joprojām nav skaidrs. Šajā pētījumā mūsu mērķis ir novērot BSHX ekstrakta aizsargājošo iedarbību uz HG inducētām PC12 šūnām un izpētīt iespējamos molekulāros mehānismus.

Metodes

Materiāli un reaģenti

Visi augi tika iegādāti no Kang Ren Tang Chinese Medicine Co., Ltd. (Pekina, Ķīna), un saskaņā ar Ķīnas farmakopeju (ĶTR Farmakopejas komisija, 2010. gads) to autentiskumu apstiprināja farmakognosists Dr. PF Tu. 3- [4, 5-Dimetiltiazol-2-il] 2, 5-difeniltetrazolija bromīds (MTT) bija no Sigma Chemical Co. (Senluisa, MO, ASV). No Nanjing Jiancheng Bioinženierijas institūta tika iegādāts laktāta dehidrogenāzes (LDH) testa komplekts. (Nanjing, Jiangsu, Ķīna). Akridīna oranža (AO) / etīdija bromīda (EB) dubultā traipu komplekts un Hoechst 33258 tika iegūti no Solar Co., Ltd. (Pekina, Ķīna). Mitohondriju membrānas potenciāla noteikšanas komplekts ar JC-1, 2, 7-dihlorfluoresceīna diacetātu (DCFH-DA) tika iegādāts no Beyotime Biotehnoloģijas institūta (Šanhaja, Ķīna). Primārās antivielas pret kaspāzi-3, šķelto kaspāzi-3, PARP, šķelto PARP, citohromu C, Bax, Bcl-2, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p -JNK un -tubulīns tika iegūti no šūnu signalizācijas tehnoloģijas (Bostona, MA, ASV).

BSHX ekstrakta sagatavošana

BSHX sastāv no septiņām zāļu sastāvdaļām (1. tabula). BSHX ekstrakta pagatavošanai Tsizi (Cuscuta Chinensis Lam.), Gouqi (Lycium barbarum L.), Fupenzi (Rubus chingii Hu), Wuweizi (Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill.), Cheqiancao (Plantago Asiatica L.), Shuizhi (Shuizhi). Hirudo nipponica Whitman.) un Yinyanghuo (Epimedium brevican Maxim.) sajauca proporcijā 8:8:4:1:2:1:8 un iegremdēja 10 reizes (v/w) destilētā ūdenī 30 minūtes. , pēc tam vāra 1 h un vēlreiz 1 stundu vāra 5 reizes (v/w) destilētā ūdenī. Supernatanti tika apvienoti un žāvēti ar liofilizāciju. Galīgais žāvētais ekstrakts bija 25 procenti (w/w) no neapstrādātu garšaugu svara, un kupona paraugs tika deponēts Mūsdienu tradicionālās ķīniešu medicīnas pētniecības centrā, Pekinas Universitātes Veselības zinātnes centrā, Pekinā, Ķīnā.

Šūnu kultūra

Žurku feohromocitomas šūnu līnijas (PC12 šūnas) tika iegūtas no Pekinas Savienības Medicīnas koledžas šūnu bankas (Pekina, Ķīna) un audzētas Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Macgene, Pekina, Ķīna), kas papildināts ar 10% liellopu augļa serumu (Biowest, Francija). ) un 1 procentu penicilīna-streptomicīna (100×, Macgene, Pekina, Ķīna) mitrinātā inkubatorā, kas satur 95 procentus gaisa un 5 procentus CO2 37 grādu temperatūrā.

Parauga apstrāde

Sākotnējā testā PC12 šūnas tika apstrādātas tikai ar BSHX ekstraktu (20, 50, 100 mg / l) 48 stundas, lai novērtētu citotoksicitāti. Lai analizētu BSHX ekstrakta neiroprotektīvo iedarbību pret augstu glikozes (HG) izraisītu neirotoksicitāti, PC12 šūnas 48 stundas apstrādāja ar BSHX ekstraktu (20, 50, 100 mg/L) un HG (75 mM), kam sekoja MTT tests. šūnu dzīvotspējai. Visi pārējie testi tika veikti tādos pašos apstākļos ar BSHX ekstrakta koncentrācijas diapazonu no 20 līdz 100 mg / l.

Šūnu dzīvotspējas tests

PC12 šūnas tika iesētas 96-iedobju plāksnēs ar blīvumu 3,5 × 103 šūnas katrā iedobē. Pēc inkubācijas ar BSHX ekstraktu (ar vai bez HG) 48 stundas, supernatants tika noņemts un pievienots MTT šķīdums (0, 5 mg / ml). Pēc 4 stundu inkubācijas 37 grādu temperatūrā MTT šķīdums tika noņemts un šūnas tika izšķīdinātas dimetilsulfoksīdā (DMSO), lai kratītu 5 minūtes. Optiskais blīvums (OD) tika mērīts pie 570 nm, izmantojot mikroplašu lasītāju. Šūnu dzīvotspēja (procentos)=[OD (apstrāde) – OD (tukšā)]/ [OD (neapstrādāta kontrole) – OD (tukšā)] × 100 procenti .

LDH tests

PC12 šūnas tika kultivētas un stimulētas HG un BSHX ekstrakta apstrādei, kā aprakstīts iepriekš. Pēc tam no šūnām atbrīvotais LDH tika noteikts, izmantojot komerciālu LDH komplektu saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Absorbcija tika mērīta pie 450 nm. LDH (U/L)=[OD (apstrāde) – OD (tukšā)] / [OD (standarta) – OD (tukšā)] × 0,2 (mmol/L) × 1000.

Hoechst 33258 krāsošana un AO/EB krāsošana

Hoechst 33258 krāsošanai šūnas tika fiksētas ar 4% paraformaldehīdu 30 minūtes. Pēc tam šūnas 3 reizes mazgāja ar fosfāta buferšķīdumu (PBS) un inkubēja ar Hoechst 33258 darba šķīdumu (1 ug/ml) tumsā 30 minūtes istabas temperatūrā. Attēli tika uzņemti, izmantojot fluorescences mikroskopu (IX73, Olympus, Japāna) ar ierosmes viļņa garumu 352 nm / emisijas viļņa garumā 461 nm. Lai krāsotu AO/EB, noņemiet barotni no 96-iedobju plāksnēm un pievienojiet AO/EB maisījumu (100 ug/mL AO un 100 ug/mL EB sajaucot) 5 minūtes tumsā istabas temperatūrā. Pēc tam šūnas 3 reizes mazgāja ar PBS. Šūnas tika vizualizētas, izmantojot fluorescences mikroskopu ar ierosmes viļņa garumu 490 nm / emisijas viļņa garums 530 nm AO krāsošanai un ierosmes viļņa garums 520 nm / emisijas viļņa garums 590 nm EB krāsošanai.

Intracelulārā ROS noteikšana

Intracelulārai ROS noteikšanai PC12 šūnas tika iesētas 6-iedobumu plāksnēs ar blīvumu 5 × 105 un pakļautas HG un BSHX ekstrakta apstrādei 24 stundas. Pēc 24 stundu inkubācijas PC12 šūnas tika mazgātas ar serumu nesaturošu Dulbecco modificēto ērgļa barotni 3 reizes un pievienotas 10 μΜ 2', 7'-dihlorfluoresceīna diacetātam (DCF-DA), kas tiek oksidēts līdz fluorescējošam 2', 7'-dihlorfluorescēnam. (DCF) ar hidroperoksīdiem, 37 grādu temperatūrā 30 minūtes tumsā. Pēc tam šūnas 3 reizes mazgāja ar aukstu PBS un atkārtoti suspendēja PBS. ROS intracelulārais līmenis tika noteikts, mērot vidējo fluorescences intensitāti ar plūsmas citometriju (BD FACSCaliburTM, ASV). Ierosmes/emisijas viļņu garumi bija pie 488/525 nm. Katram paraugam tika uzskaitīti vismaz 10,{23}} notikumi. Vērtības tika izteiktas kā vidējā absorbcija, kas normalizēta līdz kontroles vērtības procentuālajai daļai.

Mitohondriju membrānas potenciāla pārbaude

Mitohondriju depolarizācija tika novērtēta, izmantojot komerciālu JC-1 testa komplektu. Pēc apstrādes ar HG un BSHX ekstraktu šūnas tika inkubētas ar JC-1 darba šķīdumu (1 ×) 37 grādu temperatūrā 15 minūtes tumsā. Pēc tam noņemiet supernatantu un 2 reizes mazgājiet šūnas ar JC-1 buferšķīdumu (1 ×). Šūnas tika vizualizētas, izmantojot fluorescences mikroskopu ar ierosmes viļņa garumu 460 nm/emisijas viļņa garums 530 nm JC-1 monomēram (konstatēts šūnās ar depolarizētiem mitohondrijiem) un ierosmes viļņa garumu 520 nm/emisijas viļņa garums JC-1 530 nm. }} polimērs (atrodas polarizētos mitohondrijos). Tika uzskatīts, ka šūnām ar zaļu (monomēru) fluorescenci ir depolarizēti mitohondriji; tika uzskatīts, ka šūnām ar sarkanu (polimēru) fluorescenci ir normāli mitohondriji.

Western blot analīze

PC12 šūnas tika savāktas un lizētas aukstā RIPA buferšķīdumā ar 1 × kokteiļa proteāzes inhibitoru. Supernatants tika savākts ar liela ātruma centrifugēšanu ar ātrumu 12, 000 apgr./min 10 min 4 grādu temperatūrā. Olbaltumvielu koncentrācija tika noteikta ar Bredforda testu. Citohroma c analīzei ar citosolu un mitohondrijiem bagātinātās frakcijas tika izolētas ar Mitohondriju izolācijas komplektu (Pierce, Rockford, ASV). Citu proteīnu kopējie šūnu lizāti tika atdalīti ar SDS-PAGE (10 procenti -15 procenti) un pārnesti uz polivinilidēna fluorīda (PVDF) membrānām. Pēc tam polivinilidēna fluorīda membrānas tika bloķētas ar 5% beztauku pienu un inkubētas ar norādītajām primārajām antivielām 4 grādu temperatūrā nakti. Membrānas trīs reizes nomazgāja ar PBST (fosfātu buferšķīdums, 0, 1 procents Tween 20) un inkubēja ar sekundārajām antivielām istabas temperatūrā 2 stundas. Pēc tam membrānas vēl trīs reizes nomazgāja ar PBST un vizualizēja, izmantojot uzlabotu hemiluminiscējošu substrātu, un skenēja ar Kodak Digital Imaging System (Gel Logic 2200Pro, Kodak, ASV).

Statistiskā analīze

Visas vērtības ir izteiktas kā vidējā ± standarta novirze (SD). Vidējo vērtību atšķirību nozīmīgums tika noteikts ar vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA), izmantojot Statistical Package for Social Sciences (SPSS 16.0 programmatūru). P < 0,05,="" salīdzinot="" ar="" kontroles="" grupu,="" tika="" uzskatīts="" par="" statistiski="">

Rezultāti

BSHX ekstrakts aizsargā PC12 šūnas pret HG izraisītiem šūnu bojājumiem

Lai noskaidrotu, vai BSHX ekstrakts varētu aizsargāt PC12 šūnas no HG apvainojuma, mēs apstrādājām PC12 šūnas ar virkni BSHX ekstrakta koncentrāciju (20, 50 un 100 mg / l) 48 stundas HG (75 mM) apstākļos. Šūnu dzīvotspējas novērtēšana, izmantojot MTT testu, parādīja, ka HG apvainojums izraisīja ievērojamu PC12 šūnu dzīvotspējas samazināšanos (šūnu dzīvotspēja bija aptuveni 56,9 ± 6,7 procenti) un ka BSHX ekstrakta apstrāde ievērojami novērsa šūnu nāvi atkarībā no koncentrācijas. Šūnu dzīvotspēja palielinājās līdz 87,8 ± 9,2 procentiem, kad šūnas tika vienlaikus apstrādātas ar BSHX ekstraktu (100 mg/l) (1.A attēls). Laktāta dehidrogenāze (LDH) izdalās no bojātām šūnām, un tāpēc to var izmantot arī kā šūnu toksicitātes indikatoru. Saskaņā ar MTT testa rezultātiem mēs atklājām, ka HG apvainojums ievērojami palielināja LDH izdalīšanos no PC12 šūnām un ka BSHX ekstrakta apstrāde novērsa LDH izdalīšanos no koncentrācijas atkarīgā veidā (1.B attēls). Šie rezultāti liecina, ka BSHX ekstrakts palielina šūnu dzīvotspēju. HG inducētās PC12 šūnās.

BSHX ekstrakts inhibē PC12 šūnu apoptozi caur kaspāzes-9/3-atkarīgo ceļu

Lai noteiktu BSHX ekstrakta ietekmi uz šūnu apoptozi, mēs izmantojām DNS krāsvielu Hoechst 33258 kā jutīgu apoptozes testu. Normālo šūnu kodoli, kas iekrāsoti ar Hoechst 33258, uzrādīja vienmērīgu zilu fluorescenci, savukārt apoptotiskajām šūnām, kas kodolhromatīna mākoņa piknozi, bija hiperhromatiskas un blīvas fluorescējošas daļiņas. Apoptozes procentuālais daudzums tika aprēķināts atbilstoši apoptotisko šūnu skaitam pret kopējo šūnu skaitu. Mūsu dati atklāja, ka HG (75 mM) apvainojums dramatiski palielināja apoptotisko šūnu īpatsvaru (51,7 ± 4,3 procenti) un BSHX ekstrakta apstrāde ievērojami aizsargāja pret HG izraisītu apoptozi PC12 šūnās (2.A attēls). Šos rezultātus vēl vairāk apstiprināja AO / EB dubultās krāsošanas analīze. AO iekļūst gan normālās, gan apoptotiskās šūnās un izstaro zaļo fluorescenci, turpretim EB iekļūst tikai apoptotiskās šūnās un izstaro sarkano fluorescenci [13]. AO/EB tests parādīja, ka apoptotisko šūnu procentuālais daudzums ievērojami palielinājās pēc HG (75 mM) apvainojuma (47,8,7 ± 2,6 procenti) un samazinājās pēc BSHX ekstrakta apstrādes PC12 šūnās (2.B attēls), kas liecina, ka BSHX ekstrakts varētu efektīvi inhibē HG izraisīto PC12 šūnu apoptozi.

Pēc tam mēs pētījām BSHX ekstrakta ietekmi uz kaspāzes -3/PARP ceļu, kas ir svarīgs ar mitohondrijiem saistītas apoptozes ceļš [14]. Western blot atklāja, ka HG (75 mM) apvainojums ievērojami palielināja kaspāzes -3 un PARP aktīvo formu izpausmes un samazināja kopējās kaspāzes-3 un PARP izpausmes PC12 šūnās, un šis efekts tika ievērojami apgriezts. ar BSHX ekstrakta apstrādi (2.C attēls), kas liecina, ka BSHX ekstrakts efektīvi aizsargāja PC12 šūnas pret apoptozi, regulējot no mitohondriju atkarīgo kaspāzes-3/PARP ceļu.

BSHX ekstrakts kavē intracelulāro ROS veidošanos HG inducētās PC12 šūnās

Tā kā HG varētu uzlabot intracelulāro ROS veidošanos [15], mēs pārbaudījām intracelulārās ROS līmeni, lai noteiktu, vai BSHX ekstrakts varētu kavēt ROS veidošanos. PC12 šūnās, kuras 48 stundas tika pakļautas 75 mM HG, tika novērota vidējā fluorescences intensitātes palielināšanās 323- reizes, salīdzinot ar kontroli. Turpretim vienlaicīga apstrāde ar BSHX ekstraktu ievērojami samazināja vidējo fluorescences intensitāti līdz aptuveni 0.76-, 0.{{10}} un 0.{101} {12}} reizes, attiecīgi, norādot, ka BSHX ekstrakts var kavēt HG izraisīto ROS veidošanos (3.A, B attēli).

BSHX ekstrakts uztur mitohondriju homeostāzi HG inducētās PC12 šūnās, regulējot Bax un Bcl-2 ekspresiju

Mitohondriju membrānas potenciāls ir svarīgs mitohondriju funkcijas parametrs, ko izmanto kā šūnu veselības indikatoru. JC-1 ir lipofīla, katjonu krāsviela, kas var selektīvi iekļūt mitohondrijās un, palielinoties membrānas potenciālam, atgriezeniski mainīt krāsu no zaļas uz sarkanu. Veselās šūnās ar augstu mitohondriju membrānas potenciālu JC-1 spontāni veido kompleksus, kas pazīstami kā J-agregāti ar intensīvu sarkano fluorescenci. No otras puses, apoptotiskajās šūnās ar zemu mitohondriju membrānas potenciālu JC-1 saglabājas monomēra formā, kas parāda tikai zaļu fluorescenci [16, 17]. Tāpēc zaļās fluorescences un sarkanās fluorescences attiecība var atspoguļot mitohondriju depolarizāciju. Mūsu pētījumā šūnu skaits ar depolarizētiem mitohondrijiem (zaļā fluorescence) ievērojami palielinājās pēc HG (75 mM) 48 stundas, un šis pieaugums tika mainīts, apstrādājot BSHX ekstraktu atkarībā no koncentrācijas (4.A attēls).

Pēc tam mēs atklājām citohroma c mitohondriju un citoplazmas sadalījumu, kas ir galvenais dalībnieks aktivācijas kaspāzes atkarīgajā apoptozes ceļā. Mēs noskaidrojām, ka HG (75 mM) apvainojums 48 stundu garumā izraisīja dramatisku citohroma c pārvietošanos no mitohondrijiem uz citoplazmu, un šī pārvietošana tika ievērojami novērsta ar BSHX ekstraktu (attēls.4B), norādot, ka BSHX ekstrakts var kavēt citohroms c no mitohondrijiem.

Turklāt Bcl-2 ģimenes proteīni ir svarīgi dažādu apoptozes ceļu regulatori. Bcl-2 var inhibēt šūnu apoptozi, ko izraisa dažādi citotoksiskie faktori, un ir citohroma c izdalīšanās no mitohondrijiem citoplazmā inhibitors. Tomēr Bakss kā Bcl-2 ģimenes loceklis ir proapoptozes faktors. Kad tiek ierosināta apoptoze, Bakss migrē no citoplazmas uz mitohondrijiem un iznīcina mitohondriju integritāti [5, 18]. Mūsu pētījumā Bcl-2 proteīna līmenis tika pazemināts un Bax tika paaugstināts ar HG (75 mM) apvainojumu 48 stundas. BSHX ekstrakts šo efektu no koncentrācijas atkarīgi mainīja (4C. attēls). Visi iepriekš minētie rezultāti liecināja, ka BSHX ekstrakts aizsargāja PC12 šūnas pret HG izraisītu mitohondriju depolarizāciju, regulējot Bax un Bcl ekspresiju-2.

BSHX ekstrakta ietekme uz šūnu apoptozi, izmantojot JNK / p38 MAPK signalizācijas ceļus

Daži pētījumi ir parādījuši, ka palielināta ROS ražošana ir saistīta ar MAPK ceļu aktivizēšanu, lai izraisītu šūnu apoptozi9 [19, 20]. Tāpēc mēs pētījām BSHX ekstrakta ietekmi uz mitogēna aktivētās proteīna kināzes (MAPK) signalizācijas ceļu, lai noteiktu, vai BSHX ekstrakts var vājināt HG izraisītu apoptozi. Kā parādīts 5. attēlā, HG (75 mM) apvainojums 48 stundu laikā palielināja c-Jun NH2- termināla kināzes (JNK) un p38 fosforilēšanos PC12 šūnās, ko ievērojami inhibēja BSHX ekstrakts koncentrācijā- atkarīgā veidā. Tomēr līdzīgs rezultāts netika novērots ar ārpusšūnu regulētās proteīna kināzes (ERK) MAPK. Rezultāti liecina, ka BSHX ekstrakts var inhibēt HG izraisītu šūnu apoptozi, izmantojot JNK / p38 MAPK signalizācijas ceļus.

Diskusija

Diabētiskā encefalopātija (DE) ir izplatīta 2. tipa cukura diabēta (T2DM) komplikācija. Tas var izraisīt smadzeņu kognitīvos traucējumus un ir svarīgs mirstības un invaliditātes riska faktors 2. tipa cukura diabēta pacientiem visā pasaulē [3]. Tādējādi ir ļoti svarīgi izpētīt DE mehānismu, kā arī tā profilakses un ārstēšanas stratēģijas.

Ķīnā tradicionālās ķīniešu zāles (TCM) ir izmantotas DM ārstēšanai daudzus gadus, un tām ir ārstnieciska iedarbība. Daži klīniskie pētījumi liecina, ka TCM, kuru pamatā ir barojošas nieres un aktivizējošas asins stratēģijas, var pazemināt glikozes līmeni asinīs, veicināt asinsriti un uzlabot smadzeņu kognitīvo disfunkciju. BSHX recepte ir šo TCM pārstāvis. Mūsu sākotnējais klīniskais pētījums parādīja, ka BSHX recepte var efektīvi uzlabot glikozes, homocisteīna (HCY) un augstas jutības C-reaktīvā proteīna (hs-CPR) līmeni serumā un uzlabot kognitīvo funkciju diabēta pacientiem ar viegliem kognitīviem traucējumiem (MCI). [12]. Tomēr līdz šim trūkst pierādījumu, lai pierādītu efektivitāti un farmakoloģisko mehānismu.

Šajā pētījumā mēs atklājām, ka BSHX ekstrakts var vājināt HG izraisīto šūnu dzīvotspējas samazināšanos, ko mēra ar MTT, LDH testu. Lai turpinātu izpētīt BSHX ekstrakta aizsargājošo iedarbību uz šūnu dzīvotspēju, mēs pētījām apoptozi ar Hoechst 33258 un AO / EB krāsošanas analīzi. Rezultāti parādīja, ka BSHX ekstrakts var ievērojami samazināt HG izraisīto apoptozi. Kā apoptozes marķieris, kaspāze-3 un PARP tika ievērojami palielināti pēc ārstēšanas ar HG, bet BSHX ekstrakts no koncentrācijas atkarīgā veidā kavēja šo proapoptotisko faktoru aktivāciju. Iepriekš minētie rezultāti norādīja, ka BSHX ekstraktam bija aizsargājoša iedarbība uz PC12 šūnu bojājumiem, ko izraisīja HG.

ROS veidojas šūnu oksidatīvās fosforilēšanās procesā, un tā ražošanas palielināšanās vai antioksidantu sistēmu bojājums var izraisīt oksidatīvo stresu šūnās [21]. Pētījumi ir parādījuši, ka augsts glikozes līmenis var izraisīt intracelulāro ROS uzkrāšanos un galu galā aktīvu apoptotisko signālu ceļu. Un parastais diabēta komplikāciju mehānisms ir oksidatīvais stress [22, 23]. Mūsu rezultāti parādīja, ka augsts glikozes līmenis var izraisīt ROS palielināšanos PC12 šūnās, kas atbilst iepriekšējiem pētījumiem [24]. Tiek spekulēts, ka augstas glikozes toksicitāti šūnām var panākt ar ROS izraisītu apoptozi. Mitohondriji ir galvenās intracelulārās ROS ražošanas vietas un arī galvenais ROS uzbrukuma mērķa orgāns [25]. Patoloģiskos apstākļos straujš ROS pieaugums var izraisīt mitohondriju disfunkciju, mitohondriju membrānas potenciāla sabrukumu un galu galā izraisīt šūnu apoptozi [26]. Tātad mēs atklājām mitohondriju integritāti. Mūsu rezultāti parādīja, ka augsts glikozes līmenis ievērojami samazināja mitohondriju membrānas potenciālu, palielināja Bax/Bcl-2 attiecību, kas kontrolēja mitohondriju caurlaidības pārejas poru (MPTP) maiņu, un veicināja citohroma c noplūdi, savukārt BSHX ekstrakts varēja. mainīt šīs izmaiņas. Tie liecina, ka BSHX ekstrakta neiroprotektīvs līdzeklis pret HG inducētām PC12 šūnām var rasties, saglabājot mitohondriju integritāti.

MAPK signalizācijas ceļam ir arī svarīga loma šūnu apoptozē. JNK, ERK un p38 MAPK ir visvairāk pētītie MAPK ģimenes locekļi. To galvenais darbības veids ir to specifisko vietu fosforilēšana, tādējādi regulējot šūnu apoptozi [8, 27, 28]. Turklāt pētījumi ir parādījuši, ka pārmērīga ROS ražošana var izraisīt p38MAPK fosforilēšanos [29-31], un ROS var izraisīt MAPK ceļu aktivizēšanu vai starpniecību [32]. Vairāki šūnu stimuli, kas inducē ROS ražošanu arī paralēli, var aktivizēt MAPK ceļus vairākos šūnu tipos [32, 33]. Iespējamie mehānismi MAPK aktivācijai ar ROS var ietvert MAPK fosfatāžu inaktivāciju un degradāciju, kas uztur ceļu neaktīvā stāvoklī [19]. No otras puses, lai vēl vairāk apstiprinātu, vai ROS ģenerēšanas rezultātā tika aktivizēti MAPK ceļi, šūnas tika iepriekš apstrādātas ar antioksidantiem (piemēram, NAC, ROS savācējs), lai novērstu ROS uzkrāšanos. Un rezultāti parādīja, ka MAPK aktivācija tika gandrīz inhibēta pēc šūnu stimulācijas ar šūnu stimuliem [32, 33], kas norāda uz MAPK ceļu ROS inaktivācijas iesaistīšanos. Turklāt pētījumi parādīja, ka, apstrādājot šūnas ar specifisku JNK inhibitoru SP600125, Cardiotoxin III izraisītā apoptoze var tikt bloķēta [34]. Mūsu iepriekšējais pētījums atklāja, ka modificēta Wu-Zi-Yan-Zong recepte (MWP) var kavēt ERK/p38 MAPK aktivāciju A aktivētā BV2 mikroglijā [10]. Tomēr šajā pētījumā mēs atklājām, ka BSHX ekstrakts var kavēt JNK un p38 MAPK fosforilāciju, un mēs nesasniedzām tādu pašu rezultātu ar p-ERK. Mēs domājam, ka dēlēm ir atšķirīga loma BSHX ekstraktā. Rezultāti liecina, ka vēl viens BSHX ekstrakta aizsardzības mehānisms pret apoptozi HG inducētās PC12 šūnās var būt JNK / p38 MAPK signalizācijas ceļu regulēšana.

Secinājums

BSHX ekstrakts, daudzu augu formula, parāda neiroprotektīvu iedarbību uz PC12 šūnām pret HG apvainojumu. BSHX ekstrakts efektīvi inhibēja HG izraisītu PC12 šūnu apoptozi, samazinot intracelulāro ROS veidošanos, saglabājot mitohondriju membrānas integritāti un bloķējot kaspāzes -3 un JNK/p38 MAPK signālu ceļus (6. attēls). Kopumā mūsu atklājumi liecina, ka BSHX ekstrakts ir daudzsološs līdzeklis DE ārstēšanai klīniskos lietojumos.

Autoru ieguldījums

Izgudroja un izstrādāja eksperimentus: Zeng KW, Wang XM. Eksperimentu veica: Zhao SY. Analizēti dati: Zhao SY, Zeng KW un Wang XM. Ieguldītie reaģenti/materiāli/analīzes rīki: Zhao SY, Dong X, Tu PF, Zeng KW un Wang XM. Uzrakstīja pater: Zhao SY.

Atsauces

1 Riederer P, Korczyn AD, Ali SS u.c. Diabēta smadzenes un izziņa. J Neural Transm 2017, 124: 1-24.

2. Hamed SA. Smadzeņu traumas ar cukura diabētu: pierādījumi, mehānismi un ārstēšanas ietekme. Eksperts Rev Clin Phar 2017, 10: 409-428.

3. Testa R, Bonfigli AR, Prattichizzo F, et al. "Metaboliskās atmiņas" teorija un agrīna hiperglikēmijas ārstēšana diabēta komplikāciju profilaksē. Nutr 2017, 9: 437-445.

4. Ly JD, Grubb DR, Lawen A. Mitohondriju membrānas potenciāls (Δψm) apoptozē; atjauninājums. Apoptosis 2003, 8: 115-128.

5. Aouacheria A, Baghdiguian S, Lamb HM, Huska JD, Pineda FJ, Harwick J M. Mitohondriju dinamikas un dzīvības vai nāves notikumu savienošana, izmantojot Bcl-2 ģimenes proteīnus. Neurochem Int 2017, 109: 141-161.

6. Bernardi P, Scorrano L, Colonna R u.c. Mitohondriji un šūnu nāve. Mehāniskie aspekti un metodoloģiskie jautājumi. Feb J 1999, 264: 687-701.

7. Yang L, Wu L, Du S u.c. 1, 25- (OH) 2D3 inhibē augstu glikozes izraisītu apoptozi un ROS veidošanos cilvēka peritoneālās mezotēlija šūnās, izmantojot MAPK/P38 ceļu. Mol Med Rep 2016, 14: 839-844.

8. Tabakman R, Jiang H, Schaefer E u.c. Nervu augšanas faktora pirmapstrāde vājina skābekļa un glikozes atņemšanas izraisītu c-Jun aminotermināla kināzes 1 un stresa aktivētu kināžu p38 un p38 aktivāciju un nodrošina neiroprotezēšanu feohromocitomas PC12 modelī. J Mol Neurosci 2004, 22: 237-250.

9. Zou W, Zeng J, Zhuo M, Xu W, Sun L, Wang J u.c. Kaspāzes-3 un p38 mitogēnu aktivētās proteīnkināzes iesaistīšanās kobalta hlorīda izraisītā apoptozē PC12 šūnās. J Neurosci Res 2002, 67: 837–843.

10. Yu Q, Song FJ, Chen JF u.c. Modificētas Wu-Zi-Yan-Zong receptes pretneirokaisuma iedarbība amiloīdu stimulētā BV2 mikroglijā, izmantojot NF-κB un ERK/p38 MAPK signalizācijas ceļus. Uz pierādījumiem balstīts Compl Alt 2017, 2017: 1-10.

11. Zeng KW, Zhang T, Fu H u.c. Modificēta Wu-Zi-Yan-Zong recepte, tradicionāla ķīniešu daudzu augu formula, nomāc lipopolisaharīdu izraisītus neiro-iekaisuma procesus žurku astrocītos, izmantojot NF-κB un JNK/p38 MAPK signalizācijas ceļus. Phytomed 2012, 19: 122-129.

12. Fu H, Lin WW, Wang H u.c. Bushen Huoxue receptes ietekme uz 2. tipa diabēta vieglu izziņas traucējumu ārstēšanu. Chin J Integr Trad West Med 2017, 37: 661-665.

13. Baskičs D, Popovičs S, Rističs P u.c. Cikloheksimīda izraisītas apoptozes analīze cilvēka leikocītos: fluorescences mikroskopija, izmantojot aneksīnu V / propīdija jodīdu pret akridīna apelsīnu / etīdija bromīdu. Cell Biol. Int 2006, 30: 924–932.

14. Galluzzi L, Lópezsoto A, Kumar S u.c. Kaspāzes savieno šūnu nāves signālus ar organisma homeostāzi. Immunity 2016, 44: 221-231.

15. Hamed S, Brenner B, Roguin A. Slāpekļa oksīds: galvenais faktors, kas izraisa endotēlija cilmes šūnu disfunkcionalitāti cukura diabēta tipa gadījumā-2. Cardiovasc Res 2011, 91: 9-15.

16. Perelman A, Wachtel C, Cohen M u.c. JC-1: alternatīvi ierosmes viļņu garumi atvieglo mitohondriju membrānas potenciāla citometriju. Cell Death Dis 2012, 3: e430.

17. Perry SW, Norman JP, Barbieri J u.c. Mitohondriju membrānas potenciāla zondes un protonu gradients: praktiska lietošanas pamācība. Biotech 2011, 50: 98-115.

18. Chipuk JE, Green D R. Kā BCL-2 proteīni inducē mitohondriju ārējās membrānas caurlaidību? Trends Cell Biol 2008, 18:157-164.

19. Son Y, Cheong YK, Kim NH u.c. Mitogēna aktivētās proteīna kināzes un reaktīvās skābekļa sugas: kā ROS var aktivizēt MAPK ceļus? J Signal Transduct 2011: 792639.

20. Zhang L, Zhang Z, Chen F u.c. Podofilotoksīna aromātiskie heterocikliskie esteri iedarbojas pret MDR iedarbību cilvēka leikēmijas K562/ADR šūnās, izmantojot ROS/MAPK signalizācijas ceļu. Eur J Med Chem 2016, 123:226-235.

21. Kanninen K, White AR, Koistinaho J u.c. Glikogēna sintāzes kināzes-3 noteikšana terapeitiskai iedarbībai pret oksidatīvo stresu Alcheimera slimībā: Nrf2-ARE ceļa iesaistīšana. Int J Alzheimers Dis 2011, 2011: 985085.

22. Babižajevs MA, Strokovs IA, Novikovs V. V. u.c. Oksidatīvā stresa loma diabētiskās neiropātijas gadījumā: brīvo radikāļu sugu veidošanās glikācijas reakcijā un gēnu polimorfismi, kas kodē antioksidantu enzīmus ģenētiskai uzņēmībai pret diabētisko neiropātiju I tipa diabēta pacientu populācijā. Cell Biochem Biophys 2015, 71: 1425-1443.

23. Volpe C, Villardelfino PH, Dos PA u.c. Šūnu nāve, reaktīvās skābekļa sugas (ROS) un diabēta komplikācijas. Cell Death Dis 2018, 9: 119-127.

24. Chen K, Zhang M, Chen BD u.c. Ginkgolīds B inhibē apoptozi cilvēka nabas vēnu endotēlija šūnās, kuras stimulē augstu glikozes līmeni. Ķīniešu farmakoloģiskais biļetens 2017, 33: 378-383.

25. Goldsteins G, Keksa-Goldstein V, Ahtoniemi T, et al. Superoksīda dismutāzes kaitīgā loma mitohondriju starpmembrānu telpā. J Biol Chem 2008, 283: 8446-8452.

26. Cowan KJ, Storey KB. Mitogēnu aktivētas proteīna kināzes: jauni signalizācijas ceļi, kas darbojas šūnu reakcijās uz vides stresu. J Exp Bio 2003, 206: 1107.

27. Wu N, Lin X, Zhao X u.c. MiR-125b darbojas kā onkogēns glioblastomas šūnās un inhibē šūnu apoptozi caur p53 un p38MAPK neatkarīgiem ceļiem. Brit J Cancer 2013, 109: 2853.

28. Shi L, Yu X, Yang H u.c. Uzlabotie glikācijas galaprodukti izraisa cilvēka radzenes epitēlija šūnu apoptozi, ģenerējot reaktīvās skābekļa sugas un aktivizējot JNK un p38 MAPK ceļus. Plus One 2013, 8: e66781.

29. Chung H, Kim E, Lee DH u.c. Grelīns kavē apoptozi hipotalāma neironu šūnās skābekļa un glikozes trūkuma laikā. Endokrinoloģija 2007, 148: 148.

30. Palanivel K, Kanimozhi V, Kadalmani B. Verrucarin A maina šūnu cikla regulējošos proteīnus un inducē apoptozi, izmantojot reaktīvās skābekļa sugas atkarīgu p38MAPK aktivāciju cilvēka krūts vēža šūnu līnijā MCF-7. Audzēja bioloģija 2014, 35: 10159.

31. Hua X, Chi W, Su L u.c. ROS izraisīts oksidatīvs ievainojums, kas saistīts ar sēnīšu keratīta patoģenēzi, izmantojot p38 MAPK aktivāciju. Sci Rep 2017, 7: 10421.

32. Mcubrey JA, Lahair MM, Franklin RA. Reaktīvo skābekļa sugu izraisīta MAP kināzes signalizācijas ceļu aktivācija. Antioxid Redox Signal 2006, 8: 1775-1789.

33. Torres M, Forman H J. Redox signalizācijas un MAP kināzes ceļi. Biofactors 2003, 17: 287-296.

34. Chien CM, Yang SH, Yang CC, Chang LS, Lin SR. Kardiotoksīns III inducē c-jun N-termināla kināzes atkarīgu apoptozi HL-60 cilvēka leikēmijas šūnās. Cell Biochem Funct 2008, 26: 111-118.