Izotiocianātu neiroprotektīvais potenciāls neiroinfekcijas in vitro modelī

Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Tiziana Latronico1 · Marilena Larocca2 · Serafna Milella1 · Anna Fasano1 · Rocco Rossano2 · Grazia Maria Liuzzi1

Saņemts: 2020. gada 10. jūlijā / Pieņemts: 2020. gada 25. oktobrī / Publicēts tiešsaistē: 2020. gada 16. novembrī

© Autors(-i) 2020

Cistanche augu pulvera funkcija: ir ļoti labsneiroprotektīva iedarbība

Abstrakts

Izotiocianāti (ITC), kas atrodas kā glikozinolāta prekursori krustziežu dārzeņos, ir parādījušipretiekaisuma, antioksidantu un pretkancerogēnu darbību. Šeit mēs salīdzinājām trīs dažādu ITC ietekmi uz ROS ražošanu un matricas metaloproteināzes (MMP) -2 un -9 ekspresiju, kas ir nozīmīgi dažādu neiroloģisko slimību patoģenētiskie faktori. Primārās žurku astrocītu kultūras tika aktivizētas ar LPS un vienlaikus apstrādātas ar dažādām alilizotiocianāta (AITC), 2-fenetilizotiocianāta (PEITC) un 2-sulforafāna (SFN) devām. Rezultāti parādīja, ka SFN un PEITC spēja neitralizēt H2O2 izraisīto ROS veidošanos. Šūnu kultūru supernatantu zimogrāfiskā analīze pierādīja, ka PEITC un SFN bija visefektīvākie MMP-9 inhibitori, turpretim tikai SFN būtiski inhibēja MMP-2 aktivitāti. PCR analīze parādīja, ka visi izmantotie ITC būtiski inhibēja gan MMP{8}}, gan MMP-9 ekspresiju. Pētījums par mitogēnu aktivētās proteīnkināzes (MAPK) signalizācijas ceļu parādīja, ka ITC modulē MMP transkripciju, inhibējot ārpusšūnu regulētās proteīnkināzes (ERK) aktivitāti. Šī pētījuma rezultāti liecina, ka ITC varētu būt daudzsološi uztura līdzekļi tādu neiroloģisko slimību profilaksei un papildu ārstēšanai, kas saistītas ar MMP iesaistīšanos.

AtslēgvārdiAntioksidants · Pretiekaisuma līdzeklis · Izotiocianāts · Matricas metaloproteināzes · Neirodeģeneratīvas slimības

Ievads

Neiroiekaisums ir sarežģīta reakcija uz smadzeņu traumu, kas ietver bioķīmisku notikumu kaskādi, kas izraisa centrālās nervu sistēmas (CNS) rezidentu šūnu aktivāciju. Astrocītu novirzes aktivācija apdraud to neiroprotektīvo lomu, izraisot iekaisuma mediatoru, piemēram, reaktīvo skābekļa sugu (ROS), slāpekļa oksīda (NO), citokīnu, kemokīnu un matricas metaloproteināžu, izdalīšanos.

(MMP).

MMP ir liela neitrālu, no Zn2 plus atkarīgu endopeptidāžu saime, kuras galvenie mērķi ir ekstracelulārās matricas (ECM) komponenti, piemēram, fibronektīns, kolagēns, elastīns un laminīns (Latronico un Liuzzi 2017).

Tiziana Latroniko

tiziana.latronico@uniba.it

Bari Universitātes Biozinātņu, biotehnoloģiju un biofarmācijas katedra "Aldo Moro",

Bari, Italy

Bazilikatas Universitātes Zinātņu nodaļa, Potenca,

Itālija

CNS MMP ir iesaistīti dažādās fizioloģiskās reakcijās, piemēram, morfoģenēzē, apgrozībā un ECM pārveidošanā, embrioģenēzē un brūču labošanā; tomēr, kad MMP izvairās no regulējošiem mehānismiem, tie kļūst kaitīgi (Rosenberg, 2009; Agrawal et al. 2008).

Šajā ziņā ir zināms, ka izmaiņas MMP ekspresijā un aktivitātē ir galvenie patoģenētiskie notikumi vairākos neiroloģiskos traucējumos (Latronico un Liuzzi 2017; Mastroianni un Liuzzi 2007; Brkic et al. 2015). Eksperimentālie pierādījumi liecina, ka starp MMP želatināzes A (MMP-2) un B (MMP-9) ir īpaši iesaistītas neiroiekaisumos, jo to regulēšana var apdraudēt asins-smadzeņu barjeras (BBB) ​​integritāti. Tas izraisa pastiprinātu imūno perifēro asins šūnu piesaisti un infiltrāciju smadzeņu parenhīmā, saglabājot iekaisuma procesu, kas izraisa progresējošu neironu zudumu un traucētu neironu funkciju (Rivest 2009). Vairāki in vitro un in vivo pētījumi ir parādījuši, ka ROS veidošanās ir viens no faktoriem, kas iesaistīts MMP-9 ekspresijas regulēšanā smadzeņu šūnās, izmantojot no mitogēnu aktivētās proteīnkināzes (MAPK) signalizācijas ceļa atkarīgos mehānismus (Hsieh un Jaņ 2013).

Pamatojoties uz šiem pierādījumiem, ir skaidrs, ka neirotoksisko faktoru pazemināšanās, kā rezultātā samazinās neiroiekaisuma reakcijas, var būt efektīva terapeitiskā stratēģija, lai novērstu smadzeņu slimību rašanos vai atvieglotu to progresēšanu.

Pēdējos gados biomedicīnas interese par neiroloģisko jomu arvien vairāk ir vērsta uz tādu dabisko savienojumu izpēti, kas spēj modulēt ar neiroinflammatoriskām reakcijām saistītos procesus. Šajā ziņā vairāki pētījumi ir parādījuši, ka fitoķīmiskiem savienojumiem, piemēram, polifenoliem, izotiocianātiem (ITC) un citiem, piemīt neiroprotektīvs potenciāls, kas izriet arī no to spējas kavēt MMP ekspresiju un neitralizēt ROS veidošanos (Dinkova-Kostova un Kostov). 2012; Liuzzi et al., 2007, 2011).

Izotiocianāti ir metabolīti, ko ražo vairāki augi, kas pieder Brassicaceae dzimtai, lai aizsargātu pret patogēnu uzbrukumu (Bones un Rossiter 2006). Tie rodas no glikozinolātu (GSL) fermentatīvās sadalīšanās, ko veic enzīms mirozināze. ITC ir sastopami parasti patērētos krustziežu dārzeņos, piemēram, brokoļos, Briseles kāpostos, kāpostos, rāceņos, mārrutkos, kolrābjos, sinepēs, redīsos, kresēs un kāpostos. To daudzums pārtikā ir ļoti mainīgs un atkarīgs no pārtikas pārstrādes un pagatavošanas.

Nesen ir pierādīts, ka ITC piemīt dažādas terapeitiskās iedarbības, tostarp antioksidanta, antibakteriāla, pretiekaisuma un ķīmiski profilaktiska iedarbība (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015).

ITC aizsargājošā aktivitāte tiek veikta, modulējot dažādus signalizācijas ceļus, kas saistīti ar detoksikāciju, iekaisumu, apoptozi un šūnu cikla regulēšanu. Vairāki pierādījumi liecina, ka ITC pretkancerogēnās un pretiekaisuma īpašības galvenokārt varētu būt saistītas ar to spēju aktivizēt ar kodolfaktoru eritroīdo 2- saistīto 2. faktora (Nrf2) ceļu. Nrf2 ir redoksjutīgs transkripcijas faktors, kas elektrofīlo aģentu klātbūtnē un oksidatīvā stresa apstākļos pārvēršas kodolā, kur saistās ar antioksidantu atbildes elementiem (ARE), izraisot citoprotektīvo gēnu ekspresiju, kas iesaistīti detoksikācijā un oksidatīvo apstākļu modulācijā un iekaisuma procesi (Heiss et al 2001). Šajā ziņā ir ziņots, ka ITC spēj palielināt cilvēka šūnu antioksidantu spēju, inducējot II fāzes detoksikācijas enzīmu ekspresiju un regulējot GSH ražošanu (Wagner et al 2010). Turklāt ir ziņots, ka pastāv savstarpēja saruna starp Nrf2 un kodolfaktora (NF)-κB ceļu, kas izraisa iekaisuma modulāciju (Sturm and Wagner 2017; Lee and Johnson 2004). Šajā ziņā dažādi eksperimentāli neiroiekaisuma modeļi in vitro un in vivo ir pierādījuši, ka ITC spēj ievērojami samazināt NF-κB translokāciju, tādējādi inhibējot proinflammatoriskos citokīnus un MMP (Lee et al. 2015; Subedi et al. 2017).

Šajā rakstā mēs pētījām trīs ITC, ti, alilizotiocianāta (AITC), 2-fenetilizotiocianāta (PEITC) un 2-sulforafāna (SFN) ietekmi uz MMP izdalīšanos-2 un -9, kā arī ar LPS aktivētu astrocītu ROS ražošanu. Mūsu rezultāti pierādīja, ka PEITC, SFN un AITC spēj in vitro inhibēt MMP-9 un MMP-2 ekspresiju LPS aktivētos astrocītos un neitralizēt H2O2 izraisīto ROS veidošanos. Turklāt mēs parādījām, ka ITC modulē MMP pārmērīgu ekspresiju ar mehānismiem, kas saistīti ar ārpusšūnu regulētās proteīnkināzes (ERK) aktivitātes inhibīciju. Šie rezultāti liecina, ka ar krustziežu dārzeņiem bagāta diēta var dot potenciālu labumu neiroloģisko slimību profilaksei un papildu ārstēšanai.

materiāli un metodes

Ķīmiskās vielas un reaģenti

Dulbecco modificēto Eagle barotni (DMEM), liellopu augļa serumu (FBS), penicilīnu un streptomicīnu nodrošināja GIBCO (Paislija, Skotija). Želatīns, DNāze 1, poli-L-lizīns

(PLL), tripsīns, lipopolisaharīds (LPS), tripāna zils un 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2.5-difeniltetrazolija bromīds (MTT) ), Alilizotiocianāts (AITC) [menca. 377 430, tīrība 95 procenti (HPLC)], 2-fenetilizotiocianāts (PEITC) [menca. 253 731, tīrība 99 procenti )], 2-Sulforafāns (SFN) [menca. S6317, tīrība ir lielāka vai vienāda ar 95 procentiem (HPLC)], tika piegādāti no Sigma (St. Louis, MO, ASV). 2′,7′-dihlorfluoresceīna diacetāts (DCFH-DA) tika iegādāts no Calbiochem. Standarta proteīni un R-250 Coomassie Brilliant Blue bija no Bio-Rad (Hercules, CA, ASV). Anti-glial fibrillary acidic protein (GFAP) antivielas (RRID: AB_2294571) tika iegādātas no Serotec (Oksforda, Apvienotā Karaliste). Antivielas pret ārpusšūnu regulētām proteīnkināzēm (ERK) 1/2 un fosforilēto ERK 1/2 (p-ERK 1/2) bija no Santakrusas biotehnoloģijas (Santakruza, Kalifornija). Hybond-P PVDF membrānas, uzlabotās hemiluminiscences (ECL) Western blotēšanas analīzes sistēma un anti-peles-HRP sekundārā antiviela bija no GE

Veselības aprūpes dzīvības zinātnes (Little Chalfont, Bekingemšīra,

Apvienotā Karaliste). Primeru pāri, kas raksturīgi MMP-2, MMP-9 un 18S rRNS, bija no Sigma Genosys (Cambs, UK). RNeasy mini komplekts un QuantiTect reversās transkripcijas komplekts tika iegādāti no Qiagen (Valensija, Kalifornija, ASV). Econo-Taq PLUS GREEN 2X Master Mix reaģenti PCR tika iegādāti no Lucigen Corporation (Middltona, WI, ASV).

Ētikas paziņojums

Eksperimenti ar dzīvniekiem tika veikti saskaņā ar ieteikumiem NIH Laboratorijas dzīvnieku kopšanas un lietošanas rokasgrāmatā un ar Bari Universitātes (Itālija) Institucionālās dzīvnieku aprūpes un lietošanas komitejas apstiprinājumu (atļaujas numurs: 23-98- A).

Astrocītu kultūru sagatavošana

Astrocīti tika sagatavoti no {{0}}dienu vecu Wistar žurku (RRID: RGD_737960, Harlan Laboratories srl, Udine, Itālija) neokortikālajiem audiem. Astrocītu sagatavošanai tika izmantoti 6 metieni pa 12 mazuļiem, katrs no abiem dzimumiem. Dzīvnieki tika eitanāzēti, pakļaujot tiem oglekļa dioksīdu (CO2), un tika nogalināti, ātri nogriežot galvas. Neokortikālie audi tika sadalīti un izmantoti primāro glia šūnu kultūru attīrīšanai pēc metodes, ko ziņoja Latronico et al. (2018). Īsumā, pēc sadalīšanas žurku smadzenēs tika iztukšotas smadzeņu apvalks un asinsvadi, mehāniski sasmalcinātas un sagremotas ar 0,25 procentiem tripsīna 0,01 procenta DNāzes klātbūtnē. Pēc centrifugēšanas un šūnu dzīvotspējas novērtēšanas šūnas tika izklātas ar PLL pārklātās kolbās (75 cm2) ar blīvumu 1,5 × 107 šūnas/kolbā DMEM, 10 procenti FBS, 100 SV ml –1 penicilīna, 100 µg ml –1 streptomicīna. un uzturēta 37 grādu temperatūrā 5 procentu CO2. Pēc 7 dienām kolbas sakrata, lai noņemtu oligodendrocītus un mikrogliju. Astrocītu tīrība, kas iegūta ar tripsīnu (0,25 procenti tripsīna / 0,02 procenti EDTA), tika novērtēta ar GFAP imūnkrāsošanu.

LPS aktivētu astrocītu apstrāde ar alilizotiocianātu, fenetilizotiocianātu vai 2-sulforafānu

Saplūstošie astrocīti, kas iesēti 96 iedobēs, tika stimulēti ar 10 µg ml-1 LPS un vienlaikus apstrādāti ar dažādu koncentrāciju alilizotiocianātu (AITC), 2-fenetilizotiocianātu (PEITC) vai 2-sulfafānu. (SFN) serumu nesaturošā DMEM. Astrocīti bez seruma DMEM un LPS aktivizētos astrocītos bija attiecīgi negatīva un pozitīva kontrole. Turklāt, tā kā AITC (100 µM), PEITC (67 µM) un SFN (56,4 µM) izejas šķīdumi tika izgatavoti DMSO, devas-atbildes līkne uz DMSO, kas atšķaidīta barotnē ar tādu pašu šķīdinātāja koncentrāciju analizētie paraugi tika palaisti, lai novērtētu savienojuma toksicitāti. Pēc 20 h inkubācijas 37 grādu temperatūrā, 5% CO2, supernatanti tika savākti un uzglabāti -20 grādos līdz lietošanai, turpretim šūnām tika veikts MTT tests, lai novērtētu šūnu dzīvotspēju.

MTT šūnu dzīvotspējas tests

AITC, PEITC un SFN citotoksicitāte uz astrocītiem tika noteikta, izmantojot MTT [{{0}}(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,{{5 }}difeniltetrazolija bromīda] tests. Šis tests ir balstīts uz MTT reducēšanu ar mitohondriju sukcināta dehidrogenāzi dzīvotspējīgās šūnās līdz nešķīstošam zilam formazāna produktam, ko var izmērīt spektrofotometriski. Īsumā, pēc 20 stundu ilgas apstrādes ar AITC, PEITC vai SFN, barotne tika noņemta un šūnas tika ielādētas ar 0, 5 mg ml-1 MTT. Pēc 2 stundu inkubācijas 37 grādu temperatūrā 5% CO2 barotne tika noņemta, un formāzāna kristāli šūnās tika izšķīdināti ar 90% etanolu. Pēc plākšņu kratīšanas 15 minūtes, lai panāktu pilnīgu kristālu izšķīdināšanu, formazāna produkta daudzums tika noteikts pēc optiskās absorbcijas pie 560 nm ar atsauces viļņa garumu 690 nm. Šūnu dzīvotspēja tika izteikta procentos no kontroles (CTRL), ko attēlo neapstrādātas šūnas, kas tika iestatīta uz 100 procentiem. Katram savienojumam tika iegūta šūnu dzīvotspējas devas-atbildes līkne.

Reaktīvo skābekļa sugu noteikšana

Reaktīvo skābekļa sugu (ROS) noteikšana tika veikta, ielādējot astrocītus ar 10 μM 2′,7′-dihlorfluoresceīna diacetāta (DCFH-DA) fenolsarkano nesaturošā DMEM 37 grādu temperatūrā 30 minūtes. Pēc tam DCFH-DA tika izņemts no iedobēm un šūnas 1 stundu apstrādāja ar AITC (400 μM), PEITC (10 μM) vai SFN (25 μM) fenolsarkano nesaturošā DMEM H2O2 klātbūtnē ar galīgo koncentrāciju 100 μM. . Šūnas, kas apstrādātas tikai ar DCFH-DA vai H2O2, pārstāvēja attiecīgi negatīvās (CTRL) un pozitīvās kontroles (H2O2). Pēc inkubācijas šūnas tika izskalotas ar PBS un lizētas ar

Tris-HCl 10 mM/NaCl 150 mM/Triton X-100 0,5 procenti, pH 7,5,

pēc tam centrifugē pie 10,000×g, 4 grādiem 10 minūtes. Supernatanti tika savākti un to spektrofluorimetriskā analīze tika veikta pie 525 nm, ierosinot pie 485 nm. Rezultāti tika normalizēti līdz kopējam olbaltumvielu saturam, un ROS produkcija tika izteikta kā fotoluminiscences (PL) intensitātes relatīvā procentuālā attiecība pret pozitīvo kontroli.

Želatināžu noteikšana

Želatināzes aktivitāte šūnu supernatantos (SN) tika noteikta ar zimogrāfisko analīzi, kā ziņoja Latronico et al. (2013). Īsumā, SN daudzums, kas atbilst aptuveni 10 µg kopējo proteīnu, tika izšķīdināts ar 30 µl Laemmli parauga buferšķīduma bez merkaptoetanola. Paraugi tika palaisti 7,5% poliakrilamīda gēlā, kas kopolimerizēts ar 0,1% (masas / tilpuma) želatīnu. Pēc elektroforēzes želejas divas reizes skaloja ar 2,5% Triton X-100/10 mM CaCl2 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, un inkubēja 24 stundas 37 grādu temperatūrā 1% Triton X-100 /50 mM Tris–HCl/10 mM CaCl2, pH 7,4. Gēli tika iekrāsoti ar Coomassie briljantzilo R-250 un attīrīti metanolā/etiķskābē/H2O (4:1:5 tilp./tilp.). Želatināzes aktivitāte tika vizualizēta kā skaidra sagremošanas josla uz zila gēla fona un tika kvantificēta ar datorizētu densitometrisko attēla analīzi, izmantojot Image LabTM programmatūru (Bio-Rad Laboratories). Želatināze

aktivitāte tika izteikta kā optiskais blīvums (OD) × mm2, kas attēlo skenēšanas laukumu zem līknēm, kas ņem vērā gan substrāta līzes zonas spilgtumu, gan platumu. Dati tika izteikti, izmantojot šādu vienādojumu: procentuālā inhibīcija=[100 − (OD paraugs/OD pozitīva kontrole) × 100].

Reversās transkripcijas-polimerāzes ķēdes reakcija (RT-PCR)

Astrocīti, kas iesēti 6 iedobju plāksnēs, tika aktivizēti ar LPS (10 µg ml-1) un vienlaikus apstrādāti ar ITC ar maksimālo netoksisko koncentrāciju. Pēc 20 h inkubācijas kopējā RNS tika ekstrahēta no astrocītiem, izmantojot Qiagen RNeasy mini komplektu saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Komplementārā DNS (cDNS) tika sintezēta no 500 ng RNS, izmantojot QuantiTect reversās transkripcijas komplektu saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Kopā tika izmantoti 25 ng reversās transkripcijas produktu, lai amplificētu 591 bp fragmentu, izmantojot specifiskus primerus (sense 5'-GTC ACT CCG CTG CGC TTT TCT CG-3'; antisense 5'-GAC ACA TGG GGC ACC TTC TGA-3′) žurku MMP-2 secībai un 541 bp fragmentam, izmantojot specifiskus praimerus (sense 5′-CGG AGC ACG GGG ACG GGT ATC 3′; anti-sense 5′-AAG ACG AAG GGG AAG ACG CAC ATC 3′) žurku MMP-9 secībai. Paralēli tika veikta žurku 18S rRNS (sense 5′-GCCTAGATA CCGCAGCTAGGA-3′; antisense 5′-TCATGGCCTCAG TTCCGAA-3′), relatīvi nemainīga iekšējā atsauces gēna, 308 bp fragmenta amplifikācija. . Praimeru komplekti, kas jau ir apstiprināti citos pētījumos (Latronico et al. 2013; Liuzzi et al. 2004; Gramegna et al. 2011), īpaši atpazīst tikai interesējošos gēnus, par ko liecina vienas PCR paredzamā izmēra joslas amplifikācija. produktiem. PCR amplifikācija tika veikta 25 ciklos, katrs no tiem sastāvēja no denaturācijas 94 grādos, atkvēlināšanas 59 grādos un pagarināšanas 72 grādos. Pēc amplifikācijas produkti tika analizēti 1,5 procentu agarozes želejos. Pēc gēlu densitometriskās analīzes mērķa gēnu amplifikācija tika normalizēta līdz 18S rRNS ekspresijai, un rezultāti tika izteikti kā inhibīcijas procenti salīdzinājumā ar pozitīvo kontroli, kā ziņots želatināzes kvantitatīvai noteikšanai.

ERK 1/2 fosforilācijas noteikšana ar Western blot analīzi

ERK 1/2 tika atklāti ar imūnblota analīzi, kā ziņots Latronico et al. (2018). Īsumā, saplūstošā primārā

astrocīti, kas tika izklāti {{0}}iedobju plāksnēs, 24 h tika klusināti barotnē, kas nesatur serumu, tika iepriekš apstrādāta 1 stundu ar AITC (400 μM), PEITC (10 μM), vai SFN (25 μM) fenolsarkano nesaturošā DMEM. Pēc 2 stundu ilgas stimulēšanas ar 10 ug ml-1 LPS šūnas tika lizētas ar 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2,5 mM Na-pirofosfātu, 1 mM -glicerofosfātu, 1 procents Triton X-100, 1 mM. fenilmetilsulfonilfuorīds, 20 ug/ml aprotinīna, 1 mM EGTA, 1 mM Na-fuorīda, 1 mM Na3VO4, pH 7,5. Sešdesmit ug katra parauga kopējo proteīnu tika izšķīdināti ar 10% SDS-poliakrilamīda gēla elektroforēzi, un pēc tam olbaltumvielas tika imūnblotētas uz polivinilidēna difluorīda membrānām. Pēc nakts bloķēšanas 4 grādos ar 0,05% Tween 20, 1% piena, 1% liellopu seruma albumīna 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), membrānas nakti zondēja 4 grādos ar monoklonālu anti-p- ERK 1/2 antiviela (1:500). Pēc tam membrānas trīs reizes nomazgāja ar 0,05 procentiem Tween 20 Tris buferšķīdumā, zondēja ar anti-peļu mārrutku peroksidāzes sekundāro antivielu (1:20,{56}}) 2-h 24 grādu temperatūrā un noteica. ar pastiprinātu hemiluminiscenci. Lai novērtētu kopējo ERK daudzumu, membrānas tika noņemtas un inkubētas ar antivielu, kas specifiska nefosforilētam ERK 1/2 (1:500). Joslu intensitāte tika kvantitatīvi noteikta ar blotu densitometrisko skenēšanu, un ERK 1/2 fosforilācijas līmeņi tika normalizēti līdz nefosforilētam ERK 1/2 un izteikti procentos, salīdzinot ar pozitīvo kontroli (astrocīti, kas apstrādāti ar LPS), saskaņā ar šāds vienādojums:

procenti pERK 1/2=(OD paraugs/ODpozitīva kontrole) × 100.

Statistiskā analīze

Datu analīze tika veikta, izmantojot GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., Sandjego, CA, ASV). Dati tika izteikti kā vidējās vērtības ± SD. Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA), kam sekoja Dunnett's Multiple Comparison post hoc tests.

Rezultāti

Izotiocianāta savienojumu ietekme uz astrocītu dzīvotspēju

Tika veikti sākotnējie eksperimenti, lai novērtētu AITC, PEITC vai SFN citotoksicitāti. Šim nolūkam attīrītus astrocītus 20 stundas apstrādāja ar ITC savienojumiem koncentrācijās no 5 līdz 400 µM vai ar DMSO, kas atšķaidīts barotnē, kā aprakstīts sadaļā Metodes. Kā parādīts 1. attēlā, DMSO nebija toksisks nevienā izmantotajā koncentrācijā, kas atbilst pārbaudīto ITC šķīdumu koncentrācijai. Starp izmeklētajām ITC AITC

1. att. Ar izotiocianāta savienojumiem apstrādātu astrocītu šūnu dzīvotspēja. Saplūstošie primārie astrocīti tika apstrādāti 20 stundas ar alilizotiocianātu (AITC), 2-fenetilizotiocianātu (PEITC) vai 2-sulforafānu (SFN) norādītajās koncentrācijās, pēc tam tika pakļauti MTT pārbaudei. Turklāt, tā kā tas ir izejas šķīdumos, tika izšķīdināts dimetilsulfoksīdā (DMSO), katrā eksperimentā tika izmantota DMSO devas-atbildes līkne, kas atšķaidīta barotnē ar tādu pašu šķīdinātāja koncentrāciju (procentos), kas bija ITC paraugos, lai iegūtu uzticams ITC toksicitātes novērtējums. Kontrole (CTRL) tika atkārtota

aromatizēts no neapstrādātiem astrocītiem DMEM bez seruma. Diagrammas attēlo šūnu dzīvotspējas devas-atbildes līknes, kas izteiktas procentos no šūnu izdzīvošanas, salīdzinot ar kontroli. Savienojumu devas, kas noteica šūnu dzīvotspēju virs 60 procentiem, tika izvēlētas kā maksimālās netoksiskās koncentrācijas. Vērtības ir vidējās ± SD no n=3 eksperimentiem, kas veikti ar dažādām šūnu populācijām. Mikrogrāfi parāda reprezentatīvus šūnu morfoloģijas rezultātus, kas novēroti fāzes kontrasta mikroskopā (50x palielinājumā) pēc apstrādes ar dažādiem savienojumiem.

bija mazāk toksisks astrocītiem. Jo īpaši AITC nebija toksisks šūnām līdz 400 µM, savukārt PEITC un SFN bija toksiskas koncentrācijās, kas attiecīgi pārsniedza 10 un 25 µM. Mikroskopiskais novērojums apstiprināja MTT testa rezultātus, kas liecina, ka PEITC un SFN toksiskajās koncentrācijās astrocītu skaits samazinājās, un tiem, kas palika, citoplazmā bija citotoksiskas izmaiņas.

ITC savienojumu aizsargājošā iedarbība uz ROS veidošanos ar ūdeņraža peroksīdu apstrādātos astrocītos

Lai novērtētu ITC aizsargājošo iedarbību pret oksidatīvo stresu, astrocīti tika iepriekš apstrādāti ar PEITC, AITC un SFN ar maksimālo netoksisko koncentrāciju, pēc tam stimulēti ar H2O2. Intracelulāro ROS veidošanos, ko inducēja H2O2, pārbaudīja ar DCFH-DA. Kā parādīts 2. attēlā, H2O2 iedarbība pastiprināja fluorescējošu signālu

2. attēls. Reaktīvo skābekļa sugu (ROS) veidošanās astrocītos, kas apstrādāti ar ITC. ROS klātbūtne tika pārbaudīta, mērot 2′,7′-dihlorfluoresceīna (DCFA) fluorescējošā signāla izmaiņas, kā ziņots sadaļā Materiāli un metodes. Astrocīti, kas iesēti 6 iedobju plāksnēs, tika iepriekš apstrādāti 30 min ar DCFA, pēc tam 1 stundu apstrādāti ar 10 μM PEITC, 400 μM AITC vai 25 μM SFN H2O2 klātbūtnē pie galīgās koncentrācijas 100 μM. . Astrocīti, kas apstrādāti tikai ar DCFA (CTRL) vai ar 100 μM H2O2, bija attiecīgi negatīva un pozitīva kontrole. Šūnu lizātos konstatētais fluorescējošais signāls tika mērīts ar fluorometru pie 525 nm, ierosinot pie 485 nm. ROS produkcija tika izteikta procentos (procentos) no fotoluminiscences (PL) intensitātes salīdzinājumā ar pozitīvo kontroli. Vērtības ir vidējās ± SD no n=3 eksperimentiem, kas veikti ar dažādām šūnu populācijām. Statistiski nozīmīgu samazinājumu salīdzinājumā ar H2O2 norāda ar zvaigznītēm (vienvirziena ANOVA, kam seko Danneta post-hoc tests; *p <>

astrocīti salīdzinājumā ar kontroli (CTRL). Kā liecina DCF fluorescences intensitātes samazināšanās, astrocītu iepriekšēja apstrāde ar ITC savienojumiem neitralizēja H2O2 izraisīto ROS veidošanos. No pārbaudītajiem ITC tikai PEITC un SFN spēja ievērojami samazināt ROS ražošanu attiecīgi par aptuveni 20 un 24 procentiem, salīdzinot ar pozitīvo kontroli (H2O2).

Izotiocianāta savienojumi inhibē MMP-2 un MMP-9 līmeni LPS aktivētos astrocītos

ITC savienojumu ietekme uz MMP-2 un MMP-9 līmeni tika novērtēta uz astrocītiem, kas aktivizēti ar LPS, kas, kā zināms, inducē želatināžu ekspresiju (Gottschall un Deb, 1996), un vienlaikus apstrādāti ar AITC. PEITC vai SFN koncentrāciju diapazonā, kas nebija toksisks šūnām. Kā parādīts 3.a attēlā, gēlā bija divas skaidras 72 un 92 kDa gremošanas joslas, kas attiecīgi atbilst MMP-2 un MMP-9. Astrocītu aktivizēšana ar LPS palielināja MMP-2 līmeni un izraisīja MMP-9 sintēzi. Ārstēšana ar AITC (3.b att.), PEITC (3.c att.) vai SFN (3.d att.) noteica no devas atkarīgu

MMP{0}} līmeņa samazināšanās, kas mainījās atkarībā no izmantotā savienojuma. Konkrēti, starp izmantotajiem ITC SFN bija visefektīvākais MMP inhibīcijā-9, jo tas noteica 70 procentu inhibīciju 10 μM devā un 100 procentu inhibīciju pie 25 μM devas. Turklāt tikai SFN maksimālā netoksiskā koncentrācijā spēja būtiski inhibēt MMP-2 (2.d attēls).

Izotiocianāta savienojumi inhibē MMP-2 un MMP-9 gēnu ekspresiju LPS aktivētos astrocītos

Lai noteiktu, vai pētītie ITC savienojumi spēj inhibēt MMP-2 un MMP-9 ekspresiju, tika veikta RT-PCR ar LPS aktivētiem astrocītiem, kas apstrādāti ar maksimālo netoksisko ITC koncentrāciju. Kā parādīts reprezentatīvajos gēlos 4.a attēlā, LPS aktivētu astrocītu apstrāde ar atsevišķiem ITC spēja neitralizēt MMP-2 un MMP-9 mRNS palielināto ekspresiju. Kā parādīts 4.b attēlā, rezultātu kvantitatīvā analīze pierādīja, ka pie maksimālās netoksiskās koncentrācijas ITC savienojumi noteica statistiski nozīmīgu MMP-2 un MMP-9 ekspresijas inhibīciju salīdzinājumā. uz pozitīvu kontroli (LPS). Konkrēti, PEITC un SFN iedarbojas vienādi procentuāli MMP{13}} (85 procenti) un MMP{15}} (100 procenti) inhibīcijas, turpretim AITC MMP inhibēšanā bija mazāk efektīva nekā PEITC un SFN{17} } (65 procenti) un MMP-9 (90 procenti) izteiksmi.

ERK 1/2 ir iesaistīts MMP ekspresijas kavēšanā ar ITC

Tā kā ERK 1/2 ir galvenais signālu pārvades ceļš, kas iesaistīts MMP-2 un MMP-9 ekspresijas regulēšanā LPS aktivētos astrocītos (Lee et al. 2003), ITC savienojumu ietekme uz tika pārbaudīta ekstracelulāri regulēto proteīnkināžu (ERK) aktivācija 1/2.

Kā parādīts 5. attēlā, LPS izraisīja statistiski nozīmīgu fosforilētā ERK 1/2 (p-ERK) līmeņa paaugstināšanos, ko neitralizēja iepriekšēja apstrāde ar ITC savienojumiem.

Diskusija

Plaši tiek uzskatīts, ka galvenās aizsardzības stratēģijas pret daudzām slimībām galvenokārt ir izvairīšanās no riska faktoriem un pareiza dzīvesveida pieņemšana. Ir daudz zinātnisku pierādījumu, kas apstiprina hipotēzi, ka daži dabiskie metabolīti, ko parasti ražo dažāda veida augļi un dārzeņi, spēj modulēt patoloģiskas parādības, piemēram, vēzi, neiroloģiskas slimības un citas daudzfaktorālas slimības. Šajā scenārijā izotiocianāti (ITC) izraisīja lielu interesi, ņemot vērā to pretsēnīšu, antibakteriālo,

3. att. Izotiocianātu savienojumu ietekme uz MMP-2 un MMP-9 līmeni LPS aktivētos astrocītos. Ir ziņots par reprezentatīvu zimogrāfisko gēlu, kas analizē kultūru supernatantus no astrocītiem, kas aktivizēti ar LPS (10 ug ml-1) un vienlaikus 20 stundas apstrādāti ar AITC, PEITC vai SFN norādītajās koncentrācijās (μM). Negatīvās un pozitīvās kontroles tika iegūtas no nestimulētiem un neapstrādātiem astrocītiem barotnē bez seruma (CTRL) un LPS-

attiecīgi aktivizētās šūnas (LPS). Histogrammas b–d attēlo rezultātus (vidēji ± SD) no n {{0}} eksperimentiem, kas veikti ar dažādām šūnu populācijām, izteikti kā MMP inhibīcijas procenti salīdzinājumā ar LPS, kas aprēķināti pēc skenēšanas densitometrijas un gēlu datorizētas analīzes. . Statistiski nozīmīgu samazinājumu salīdzinājumā ar LPS norāda ar zvaigznītēm (vienvirziena ANOVA, kam seko Daneta post hoc tests; *p < 0.05,="" **p=""><>

antikancerogēna, antimutagēna, antioksidanta un pretiekaisuma bioloģiskās īpašības (Dufour et al. 2015; Marzocco et al. 2015; Vig et al., 2009; Talalay un Fahey 2001). Izotiocianāti rodas no glikozinolātu (GSL) fermentatīvās sadalīšanās, kas ir sekundāri metabolīti, kas atrodas 15 Capparales kārtas botāniskajās ģimenēs un ir ļoti daudz Brassicaceae ģimenē (Fahey et al. 2001). GSL hidrolizē mirozināze (-tioglikozīda glikohidrolāze e; EC 3.2.3.147) dažādos komponentos, piemēram, ITC, nitrītos, tiocianātos, epitionitrilos, SFGate, glikozē un oksazolidīnos (Li un Kushad2005). Lai gan ITC ir plaši pētīti ķīmijterapijas jomā (Grundemann un Huber 2018), ir veikti daži pētījumi par to terapeitisko potenciālu neiroloģisko slimību gadījumā, neskatoties uz to, ka ir pierādīta SFN un AITC spēja šķērsot BBB un uzkrāties smadzeņu parenhīmā. (Clarke et al. 2011; Jazwa et al. 2011; Zhang 2010). Šajā rakstā mēs salīdzinājām trīs ITC ietekmi,

sastopams vairākos bieži patērētos krustziežu dārzeņos, reaktīvo skābekļa sugu (ROS) ražošanā un matricas metaloproteināzes (MMP) ekspresijā neiroiekaisuma in vitro modelī, ko attēlo astrocīti, kas aktivizēti ar lipopolisaharīdu (LPS) vai apstrādāti ar H2O2. Astrocīti, kas ir visizplatītākais CNS glia šūnu veids, spēlē izšķirošu lomu smadzeņu homeostāzes uzturēšanā un ir dažādu neiroloģisko slimību pazīmes (Cekanaviciute un Buckwalter 2016; Colombo un Farina 2016). Tie tiek uzskatīti par izšķirošiem iedzimtas imūnās atbildes regulatoriem, un to reakcija uz kaitīgiem apvainojumiem, piemēram, oksidatīvo stresu, var saasināt iekaisuma reakcijas un audu bojājumus vai veicināt audu atjaunošanos. Ir labi zināms, ka aktivizētie astrocīti rada neirotoksiskus faktorus, piemēram, MMP, kuriem ir galvenā loma neiroinflammācijas un progresējoša neironu zuduma veicināšanā neiroloģisko slimību gadījumā (Hsieh un Yang 2013). Tāpēc modulācija

4. attēls. ITC savienojumu ietekme uz MMP-2 un MMP-9 ekspresiju LPS aktivētos astrocītos. Astrocīti, kas iesēti 6 iedobju plāksnēs, tika aktivizēti ar LPS (10 µg ml-1) un vienlaikus 20 stundas apstrādāti ar AITC (400 µM), PEITC (10 µM) vai SFN (25 µM), pēc tam tika pakļauti RT-PCR. Par reprezentatīviem MMP-2 un MMP-9 ekspresijas agarozes gēliem ir ziņots (a). Histogrammas (b) attēlo rezultātus (vidēji ± SD) no n=3 eksperimentiem, kas veikti dažādās šūnās

notikumi, kas rodas pēc astrocītu aktivācijas, var mazināt iekaisuma reakciju un neironu bojājumus.

Šī pētījuma rezultāti norādīja, ka starp pētītajiem ITC AITC bija mazāk toksisks, jo tas neizraisīja šūnu dzīvotspējas samazināšanos visās izmantotajās koncentrācijās. Turpretim, līdzīgi kā citi autori ir novērojuši dažādu glia šūnu līnijās, PEITC un SFN uzrādīja šūnu toksicitāti koncentrācijās, kas attiecīgi lielākas par 10 un 25 µM (Lee et al. 2015; Eren et al. 2018; Su et al. . 2015).

Pašreizējā zinātniskajā literatūrā ir daudz pretrunīgu datu par molekulārajiem mehānismiem, kas ir pamatā ITC ietekmei uz šūnu dzīvotspēju. Šajā ziņā lielākā daļa pētījumu liecina, ka ITC kavē šūnu augšanu izraisošo apoptozi, šūnu cikla apstāšanos, ROS veidošanos vēža šūnās, bet ne normālās šūnās (Fofaria et al. 2015; Qin et al. al., 2018; Sestili un Fimognari, 2015). Mēs noskaidrojām, ka SFN un PEITC, bet ne AITC, ir aizsargājoša loma pret oksidatīvo stresu astrocītos, patiešām maksimālā netoksiskā koncentrācijā tie spēja neitralizēt ROS veidošanos, ko izraisa H2O2 iedarbība. CNS ir īpaši neaizsargāta pret oksidatīvo stresu, jo tai ir augsts skābekļa patēriņš, vājas antioksidantu sistēmas un augsts pret oksidāciju jutīgu biomakromolekulu saturs. Tiek uzskatīts, ka ROS veidošanās un oksidatīvie bojājumi ir iesaistīti tādu neiroloģisko traucējumu patoģenēzē kā Alcheimera slimība (AD), Parkinsona slimība (PD), amiotrofiskā laterālā skleroze (ALS) un Multiplā skleroze (MS) (Lee et al. 2015). Tāpēc, lai gan mūsu in vitro eksperimentos SFN un PEITC mērenā mērā neitralizēja ROS veidošanos, mēs varētu pieņemt, ka in vivo ilgstoša ITC ievadīšana var izraisīt būtiskāku ROS samazināšanos, kas laika gaitā var radīt nozīmīgu. populācijām, kas izteiktas procentos no MMP inhibīcijas salīdzinājumā ar pozitīvo kontroli (LPS), ko aprēķina pēc skenēšanas densitometrijas un datorizētas gēlu analīzes. Statistiski nozīmīgu MMP-2 un MMP-9 izteiksmes samazināšanos salīdzinājumā ar LPS norāda ar zvaigznītēm (vienvirziena ANOVA, kam seko Daneta post hoc tests; *p <>

smadzeņu slimību profilakse un modulēšana. ROS darbojas kā kritiska signalizācijas molekula, lai izraisītu iekaisuma reakcijas kaskādi CNS. Šajā ziņā ir labi zināms, ka ROS regulē daudzu neiroiekaisumā iesaistīto gēnu ekspresiju, aktivizējot pro-iekaisuma transkripcijas faktorus, piemēram, kodolfaktoru-κB (NF-κB) (Lee et al. 2015; Chiurchiù et al. 2016; Martorana et al. 2019). Šajā scenārijā svarīgu lomu spēlē MMP, kuru ekspresiju regulē ROS, aktivizējot NF-κB (Yan un Boyd 2007).

Tā kā MMP disregulācija veicina daudzu neiroiekaisīgu un neirodeģeneratīvu slimību patoģenēzi, to inhibīcija ir svarīga terapeitiskā stratēģija. Šī iemesla dēļ pēdējā desmitgadē pieaug interese par zāļu un dabisko savienojumu potenciālu inhibēt MMP. Daudzi in vitro pētījumi ir pierādījuši, ka vairāku dārzeņos un jūras organismos esošo zāļu un bioaktīvo savienojumu pretiekaisuma un antioksidanta darbība ir saistīta ar to spēju kavēt MMP ekspresiju (Latronico et al. 2016, 2018; Di Bari et al. . 2015). Šajā pētījumā mēs parādījām, ka starp pārbaudītajiem ITC SFN un PEITC bija visefektīvākie MMP-2 un MMP-9 līmeņu un ekspresijas inhibēšanā LPS aktivētos astrocītos. Par MMP inhibīciju, ko veic ITC, ziņots citos in vivo un in vitro pētījumos. Jo īpaši Li et al. (2013) pierādīja, ka SFN spēj mazināt BBB bojājumus, inhibējot MMP-9 ekspresiju eksperimentālā autoimūnā encefalomielīta in vivo modelī. Citi autori ziņoja, ka SFN spēja vājināt MMP-9 ekspresiju pēc muguras smadzeņu traumas pelēm (Mao et al. 2010a). Turklāt in vitro pētījumi parādīja, ka ITC nomāc šūnu migrāciju un

5. att. Ekstracelulārā signāla regulētā kināze 1/2 (ERK 1/2) ir iesaistīta MMP ekspresijas inhibēšanā ar ITC savienojumiem. Reprezentatīvās autoradiogrāfiskās filmas Western blot analīzē lizātiem no astrocītiem, kas iepriekš apstrādāti 1 stundu ar AITC (400 μM), PEITC (10 μM) vai SFN (25 μM) un pēc tam aktivizēti 2 stundas ar LPS (10 ug mL{{). 13}}). Neapstrādātas un nestimulētas šūnas ir negatīvā kontrole (CTRL). Histogramma (b) parāda pERK1/2 līmeņa invāziju C6 gliomas šūnās, kas bija saistīta ar MMP-9 ekspresijas inhibīciju, ko mediē NF-κB (Lee et al. 2015).

Molekulārie mehānismi, ar kuriem ITC inhibē MMP, nav skaidri, un nav pētījumu, kas pētītu ITC antioksidantu un pretiekaisuma īpašības primārajās astrocītu kultūrās. Vairāki pētījumi apstiprina hipotēzi, ka ITC inhibējošā iedarbība ir sekas to spējai bloķēt NF-κB ar Nrf2 signalizācijas ceļu. Šajā ziņā in vivo pētījums liecina, ka Nrf2 nokautas peles bija jutīgākas pret NF-κB izraisītu muguras smadzeņu iekaisuma reakciju un no NFkB atkarīgo gēnu, tostarp MMP-9, pastiprinātu ekspresiju (Mao et al. 2010b). ). Lai gan NF-κB un Nrf2 ceļi varētu mijiedarboties, mēs parādījām, ka NF-κB regulēšana notiek arī, modulējot molekulāros mehānismus, kas ir neatkarīgi no Nrf2. Patiešām, mēs noskaidrojām, ka AITC, PEITC un SFN inhibēja ERK1 / 2 aktivāciju, kam ir galvenā loma signālu pārraides notikumu kaskādē, kas galu galā regulē MMP gēna transkripciju.

Tomēr eksperimentālie pierādījumi, ka SFN maksimālā netoksiskā koncentrācijā pilnībā inhibēja gan MMP-9 ekspresiju, gan līmeņus, turpretim AITC un PEITC inhibēja maksimāli paplašināt MMP-9 ekspresiju, bet tikai samazināja MMP{{3}. } līmeni līdz aptuveni 50 procentiem, varētu likt domāt, ka šie savienojumi modulē MMP-9 transkripciju ar dažādiem darbības mehānismiem. Šajā sakarā ir ziņots, ka SFN papildus LPS izraisītas NF-κB aktivācijas kavēšanai traucē LPS saistīšanos ar TLR4 receptoru (Koo et al 2013). SFN inhibējošā iedarbība uz TLR4 var novērst astrocītu aktivāciju ar LPS, un tas var izraisīt MMP-9 ekspresijas inhibīciju augšup, līdz ar to MMP-9 ražošanas trūkumu.

iegūts pēc autoradiogrāfisko plēvju densitometriskās skenēšanas un normalizēšanas uz nefosforilētu ERK 1/2. Dati atspoguļo vidējos ± SD no n=3 eksperimentiem, kas veikti ar dažādām šūnu populācijām. Zvaigznītes apzīmē vērtības, kas statistiski atšķiras no pozitīvās kontroles (LPS aktivēti astrocīti), kas tika iestatīti uz 100 procentiem (vienvirziena ANOVA, kam seko Daneta daudzkārtējais salīdzināšanas post hoc tests; *p <>

Secinājumi

Rezumējot, mūsu dati liecina, ka astrocītu apstrāde ar ITC samazina ROS veidošanos un kavē MMP-2 un MMP-9 izdalīšanos, sniedzot jaunu ieskatu par ITC antioksidanta un pretiekaisuma īpašībām uz glia. šūnas. Šie rezultāti liecina, ka ITC varētu būt daudzsološi uztura līdzekļi, lai izstrādātu neiro-uztura intervences, kuru pamatā ir veselīgas pārtikas lietošana, lai novērstu un papildinātu neiroloģisko slimību ārstēšanu.

Finansējums Atvērtās piekļuves finansējumu nodrošina Università Degli Studi di Bari Aldo Moro CRUI-CARE līguma ietvaros.

Atbilstība ētikas standartiem

Interešu konflikts Autori paziņo, ka nav interešu konflikta.

Atvērtā piekļuve Šis raksts ir licencēts saskaņā ar Creative Commons Attribution 4.0 Starptautisko licenci, kas ļauj izmantot, koplietot, pielāgot, izplatīt un reproducēt jebkurā datu nesējā vai formātā, ja vien jūs piešķirat oriģinālajam autoram atbilstošu atzinību. (s) un avotu, norādiet saiti uz Creative Commons licenci un norādiet, vai ir veiktas izmaiņas. Attēli vai citi trešās puses materiāli šajā rakstā ir iekļauti raksta Creative Commons licencē, ja vien materiāla kredītlīnijā nav norādīts citādi. Ja materiāls nav iekļauts raksta Creative Commons licencē un jūsu paredzētā izmantošana nav atļauta ar likumu vai pārsniedz atļauto izmantošanu, jums būs jāsaņem atļauja tieši no autortiesību īpašnieka. Lai skatītu šīs licences kopiju, apmeklējiet vietni http://creativecommons.org/licenses/by/4.{4}}/.