Ehinakozīda neirotrofiskā un neirorescue ietekme Parkinsona slimības subakūtā MPTP peles modelī

Kontaktpersona: ali.ma@wecistanche.com

Qing Zhao u.c

Abstrakts

Daudzi eksperimenti apstiprina domu, ka neirotrofisko faktoru (NTFS) aktivitātes palielināšana, jo īpaši no glia šūnu līnijas iegūtā neirotrofiskā faktora (GDNF) un smadzeņu izcelsmes neirotrofiskā faktora (BDNF), var novērst vai apturēt neirodeģenerācijas progresu.Parkinsona slimībaslimība(PD). Tomēr NTFS kā terapeitisku līdzekļu izmantošana PD(Parkinsona slimībaslimība)apgrūtina grūtības tos droši un efektīvi nogādāt noteiktos smadzeņu reģionos. Vēl viena iespējamā stratēģija ir stimulēt NTFS endogēno ekspresiju. Šajā pētījumā mēs pētījām ietekmi uzEhinakozīds(ECH), monomērs, kas iegūts no augiem, lai glābtu dopamīnerģisko funkciju 1-metil-4-fenil-1, 2, 3, 6-tetrahidropiridīna (MPTP) bojātām pelēm. Mēs atklājām, ka ECH perorāla ievadīšana(ehinakozīds)(30 mg/kg/dienā 14 dienas) ar MPTP ārstētām pelēm, sākot pēc nigrostriatālās sistēmas traucējumiem, nomāca nigrālo dopamīnerģisko neironu, striatālo šķiedru, dopamīna un dopamīna transportētāja samazināšanos līdz 134,24 procentiem, 203,517 procentiem. un attiecīgi 154,72 ar MPTP bojātiem dzīvniekiem (lpp< 0.05).="" there="" was="" a="" relative="" elevation="" in="" the="" expression="" of="" gdnf="" and="" bdnf="" mrna="" (2.94="" and="" 3.75-fold)="" and="" protein="" (184.34%="" and="" 185.93%)="" in="" ech="" treated="" mice="" compared="" with="" vehicle-treated="" mptp-lesioned="" mice="">< 0.05).="" in="" addition,="" the="" apoptosis="" cells="" and="" bax/bcl-2="" ratio="" of="" mrna="" and="" protein="" in="" mptp-lesioned="" mice="" significantly="" increased,="" and="" these="" effects="" could="" be="" prevented="" by="" ech.="" at="" the="" 7th="" and="" 14th="" days="" of="" ech="" treatment,="" the="" gait="" disorder="" displayed="" obvious="" improvement="">< 0.05).="" these="" findings="" demonstrate="" that="" ech="" is="" probably="" a="" novel,="" orally="" active,="" a="" non-peptide="" inducer="" of="" ntfs="" and="" inhibitor="" of="" apoptosis,="" and="" they="" provide="" preclinical="" support="" for="" the="" therapeutic="" potential="" of="" this="" compound="" in="" the="" treatment="" of="">

Atslēgvārdi: Parkinsona slimība, MPTP, ehinakozīds, GDNF, BDNF, neirorescue

EhinakozīdsCistančā irNeirotrofisksunneiroglābšanaietekme uzParkinsona slimībaslimība

Noklikšķiniet, lai iegūtu cistanche ekstrakta priekšrocības Parkinsona slimības gadījumā

1. Ievads

Parkinsona slimībaslimība(PD) raksturo progresējoša dopamīnerģisko neironu šūnu nāve nigrā, kā rezultātā rodas nopietns motora deficīts. Atšķirībā no neiroprotektīvajām stratēģijām, kuru mērķis ir palēnināt deģenerāciju un tādējādi tās jāuzsāk pirms būtisku bojājumu nodarīšanas, neironu glābšanas vai atjaunojošās terapijas mērķis ir novērst neironu deficītu un deģenerāciju pēc traucējumu rašanās. Neirotrofiskie faktori (NTF) ir izdalītie proteīni, kas regulē neironu šūnu izdzīvošanu, funkcionālo uzturēšanu un fenotipisko attīstību, jo īpaši no glia šūnu līnijas iegūtais neirotrofiskais faktors (GDNF) un no smadzenēm iegūtais neirotrofiskais faktors (BDNF) ir plaši atzīti par spēcīgiem. izdzīvošanas faktori dopamīnerģiskiem neironiem un nigrostriatālajam ceļam, kas deģenerējas PD(Parkinsona slimībaslimība). Lai gan šo NTF neiroprotektīvās vai neironu glābšanas aktivitātes ir pierādītas vairākos in vitro un in vivo eksperimentos (Peterson and Nutt, 2008), to izmantošanu kā terapeitiskus līdzekļus PD apgrūtināja grūtības to ievadīšanā smadzenēs, jo makromolekulu peptīdi nevar šķērsot smadzeņu-asins barjeru (BBB). Tādējādi klīniskie pētījumi pārbauda PD ārstēšanu(Parkinsona slimībaslimība)izmantojot operāciju vai gēnu terapiju, jāatrisina efektīvas NTF piegādes un ekspresijas problēma (Dietz et al., 2006; Torp et al., 2006). Kā alternatīva šādām invazīvām pieejām potenciālā stratēģija ir stimulēt NTF endogēno ekspresiju. Nesen ir pierādīts, ka vairāki nepeptīdu NTF induktori, piemēram, XIB4035 un PYM50028, mazina dopamīnerģisko neironu zudumu un tiem var būt labvēlīga ietekme PD ārstēšanā (Tokugawa et al., 2003; Visanji et al., 2008). . Šos mazmolekulāros līdzekļus var ievadīt sistēmiski, un tādējādi tie pārvarētu lielāko daļu problēmu, kas saistītas ar NTFS ievadīšanas smadzenēs efektivitāti un drošību, izmantojot tādas metodes kā NTF ekspresijas indukcija ar vīrusu vektoriem vai iekapsulētu NTF veidojošo līdzekļu izmantošana. šūnas (Bespalov un Saarma, 2007). Tādējādi molekulām, kas inducē NTF endogēno ekspresiju vai uzlabo to signalizāciju, arvien lielāka uzmanība tiek pievērsta kā alternatīvām PD terapijas iespējām.(Parkinsona slimībaslimība).

Ehinakozīds(ECH, 1. att.) ir viena no galvenajām feniletanoīdu glikozīdu (PhG) sastāvdaļām, kas iegūtas no slavenās tradicionālās ķīniešu medicīnas Herba Cistanches (Cistanche deserticola, Cistanche salsa vai Cistanche tubulosa stublāji). Tas ir arī galvenais fenola komponents Echinacea Angustifolia un E. pallida saknēs (Pellati et al., 2004), ko plaši izmanto Eiropā un Ziemeļamerikā to imūnregulācijas īpašību dēļ (Hostettmann, 2003). Kā polifenola dabīgs produkts, ECH(ehinakozīds)piemīt dažādas bioaktivitātes, piemēram, spēcīgs antioksidants (Sloley et al., 2001; Dalby-Brown et al., 2005), brīvo radikāļu attīrīšanas līdzeklis un samazina aktivēto makrofāgu radīto NO radikāļu daudzumu (Xiong et al., 2000). ka tas var aizsargāt pret hepatotoksicitāti (Wu et al., 2007) un akūtu plaušu bojājumu žurkām (Zhang et al., 2007, Xiong et al., 1998). Tam ir arī pretiekaisuma, pretaudzēju, pretnovecošanās un mācīšanās atmiņas uzlabošanas aktivitātes (pārskatīja He et al., 2009). Vairāki pētījumi ir ziņojuši par ECH(ehinakozīds)piemīt anti-apoptotiskas un neiroprotektīvas īpašības neirodeģeneratīvās slimībās, piemēram, ECH(ehinakozīds)uzrāda nozīmīgu neiroprotektīvu iedarbību uz H2O2 ievainotajām PC-12 šūnām un izglābj SH-SY5Y neironu šūnas no TNF izraisītas apoptozes caur mitohondriju ceļu (Kuang et al., 2009; Deng et al., 2004). In vivo savienojums ir aizsargājis dopamīnerģiskos neironus 6-hidroksidopamīna (6-OHDA) bojātās žurkās, mazinot dopamīna (DA) un tā starpproduktu samazināšanos (Chen et al., 2007a, b). Citā pētījumā tika ziņots, ka ECH ir neiroprotektīva iedarbība un uzvedības uzlabojumi MPTP izraisītu dopamīnerģisko neironu bojājumu peles modelī, savukārt turpmākā izpēte atklāja, ka ECH izraisīja kaspāzes{14}} un kaspāzes-8 aktivācijas pazemināšanos MPP. plus-inducēta smadzenīšu granulu neironu apoptoze (Geng et al., 2007). Bet šajos pētījumos tika pētītas tikai ECH anti-apoptotiskās vai neiroprotektīvās lomas ar pirmapstrādes metodi. Jautājumi par to, vai ECH ietekmē citus dopamīnerģiskos neironu izdzīvošanas un ar nāvi saistītus faktorus (piemēram, NTF un Bcl{21}} saimi) un vai tai ir neironu glābšanas ietekme, vēl nav izskatīti. Pārskatot nelielo literatūru par NTF indukciju, ko izraisa augi vai augu savienojumi, mēs atklājām, ka Rehmannia glutinosa un catalpol, divi augi, kuriem saskaņā ar tradicionālās ķīniešu medicīnas teoriju ir līdzīgas funkcijas Cistanches, var izraisīt GDNF gēnu un olbaltumvielu ekspresiju gan in vitro, gan in vivo. tad vājina MPTP izraisītu nigrālā-striatālā dopamīnerģiskā ceļa neironu deģenerāciju (Yu et al., 2006; Xu et al., 2010). Tāpēc mēs izvirzījām hipotēzi, ka ECH var būt arī līdzīga efektivitāte. No otras puses, subakūts MPTP peles modelis ir diezgan populārs režīms, kas ietver vienu 30 mg/kg injekciju dienā piecas dienas pēc kārtas. Šis režīms izraisa apoptozi un par 40–50 procentiem samazina striatālā dopamīnu jaunām pieaugušām C57BL/6 pelēm, un dopamīnerģiskais bojājums stabilizējas 21 dienu pēc MPTP ievadīšanas (Tatton un Kish, 1997; Jackson-Lewis un Przedborski, 2007). Tātad mūsu pašreizējais pētījums izvēlas šo modeli un pēta ECH ietekmi uz GDNF un BDNF izpausmēm, kas ir divi no spēcīgākajiem NTF, kas saistīti ar dopamīnerģisko neironu izdzīvošanu, un tas vēl vairāk parāda šī savienojuma neironu glābšanas un anti-apoptotiskās spējas pēc subakūta MPTP bojājuma. indukcija PD peles modelī(Parkinsona slimībaslimība).

2. Rezultāti

2.1. ECH(ehinakozīds)uzlabo gaitas disfunkcijas PD subakūtā MPTP peles modelī(Parkinsona slimībaslimība)

Saīsināts soļa garums ir viena no galvenajām neparastas gaitas īpašībām PD(Parkinsona slimībaslimība). Mūsu pētījuma rezultāti liecina par būtisku priekšējo un pakaļējo ekstremitāšu soļa garuma samazināšanos ar MPTP bojātām pelēm, kuras tika ārstētas ar nesēju (fizioloģisko šķīdumu) 9. dienā pēc pēdējās MPTP ievadīšanas, ti, 7. dienā, kad tika veikta apstrāde ar nesēju, salīdzinot ar parastā kontroles grupa (p= 0.023, 0,014, 2.A, B att.). Tikmēr peļu soļa garums lielas devas ECH(ehinakozīds)(30 mg/kg/dienā) ārstēšanas grupa ir garāka nekā MPTP nesēju dzīvniekiem, īpaši pakaļējām ekstremitātēm (p= 0.024, 0.009). Turklāt uzlabojumi, kas saistīti ar lielas devas ECH(ehinakozīds)tika novērota arī 14. ārstēšanas dienā (p= 0.015, 0,012), lai gan MPTP bojātajām pelēm bija arī neliela spontāna atveseļošanās. Vidēja (20 mg/kg/dienā) un zema (10 mg/kg/dienā) deva ECH(ehinakozīds)ārstētajām grupām bija tendence uz garāku soļu garumu, tomēr atšķirības starp tām un ar MPTP nesēju ārstētajām pelēm nebija nozīmīgas.

2. att. – ECH(ehinakozīds)uzlaboja gaitas traucējumus, ko izraisīja subakūtas MPTP injekcijas. A: Priekškājas soļa garums. Priekšējo kāju garums gaitas analīzes testā uzrādīja būtisku samazinājumu MPTP plus NS (fizioloģiskā šķīduma) grupā, salīdzinot ar NS plus NS grupu MPTP transportlīdzekļa ārstēšanas 7. dienā, taču šos trūkumus novērsa lielā ECH deva.(ehinakozīds)(30 mg/kg/dienā), mērot 7. un 14. ārstēšanas dienā. B: pakaļējās ekstremitātes soļa garums. MPTP bojājuma peļu pakaļējo ekstremitāšu soļa garums acīmredzami samazinājās, salīdzinot ar fizioloģiskā šķīduma kontroli 7. dienā pēc ārstēšanas ar MPTP nesēju, un to arī ievērojami uzlaboja lielā ECH deva.(ehinakozīds). Dati ir izteikti kā vidējie ± SEM (n{0}} katrs). * lpp< 0.05="" vs.="" ns+ns="" group;="" #="">< 0.05="" vs.="" mptp+ns="">

EhinakozīdsCistančā irNeirotrofisksunneiroglābšanaietekme uzParkinsona slimībaslimība

2.2. ECH(ehinakozīds)samazina nigrālo TH pozitīvo neironu un striatuma TH pozitīvo aksonu zudumu subakūtās MPTP bojātās pelēs

Pēc 14 dienu ilgas ārstēšanas ar ECH(ehinakozīds)vai nesējs un uzvedības novērtējuma pabeigšana, puse no pelēm katrā grupā tika upurētas Nissl un TH imūnreaktīvās noteikšanai. Attēlos ir parādītas reprezentatīvās koronālās mesencefalona sekcijas, kas satur TH pozitīvus neironus un šķiedras peļu substantia nigra compacta (SNpc) un striatumā. 3A, B, C, D. Bija ievērojams Nissl pozitīvo neironu (tikai krezilvioleti pozitīvi) un TH pozitīvo neironu (gan TH, gan krezilvioletā pozitīvo neironu) skaita samazinājums SNpc ar nesēju ārstētajā MPTP bojātajā grupā. salīdzinot ar nebojātām kontroles pelēm (71,89 procenti un 67,97 procenti fizioloģiskā šķīduma kontroles, p= 0.000, 0.000, 3.A, B, E zīm.) . Pelēm, kas katru dienu saņem lielu ECH devu perorāli(ehinakozīds)Nissl pozitīvo un TH pozitīvo neironu skaits bija ievērojami lielāks nekā ar MPTP nesēju ārstētiem dzīvniekiem (135,39 procenti un 134,24 procenti MPTP kontroles, p= 0.000), un tas bija vienmērīgs. tuvu nebojāto kontroles pelēm (97,34 procenti un 91,25 procenti). Līdzīgs, bet vājāks efekts tika novērots arī vidējas devas ECH terapijas grupā (125,39 procenti un 124,59 procenti no MPTP kontroles, p= 0.002, 0,004). Bet zemas devas ECH ārstēšana nesniedza būtisku glābšanas efektu. No otras puses, līdzīgā Nissl-pozitīvo un TH-pozitīvo neironu izmaiņu tendence SNpc izslēdza traucējumus rezultātos TH enzīma regulēšanas dēļ.

Kopā ar DA neironu zudumu PD MPTP modelī(Parkinsona slimībaslimība)ir TH pozitīvo šķiedru samazināšanās caur striatumu. Mēs novērojām acīmredzamu TH pozitīvo aksonu sadrumstalotību MPTP bojāto dzīvnieku striatumā, bet bojājumi tika uzlaboti ECH.(ehinakozīds)ārstēšanas grupā, īpaši lielas ECH devas gadījumā(ehinakozīds)(3. D attēls). Turklāt TH pozitīvo šķiedru optiskā blīvuma (OD) analīze atklāja ievērojamu DA terminālu zudumu grupā, kas apstrādāta ar MPTP transportlīdzekli (47,37 procenti no fizioloģiskā šķīduma kontroles, p= 0.001, 3.F attēls). Turpretim pelēm, kuras saņēma lielu ECH devu, tika novērots acīmredzams relatīvs TH pozitīvo šķiedru blīvuma pieaugums.(ehinakozīds)ārstēšanu, salīdzinot ar MPTP bojātiem kontroles dzīvniekiem (203,17 procenti no MPTP kontroles, p= 0.003, 3.C, F att.), palielinot to līdz 96,24 procentiem no parastā kontroles līmeņa. Tikmēr mērenas devas ECH grupai bija arī ievērojams, bet vājāks neironu glābšanas efekts (177,78 procenti no MPTP kontroles, p= 0.022), savukārt mazās devas ieguvumu nebija.

2.3. ECH(ehinakozīds)kavē striatālā DA samazināšanos PD subakūtā MPTP peles modelī(Parkinsona slimībaslimība)

Eksperimenta beigās DA saturs striatumā ar nesēju apstrādātā MPTP modelī bija tikai 31,25 procenti no parastās kontroles (p= 0.000, 1. tabula). Pēc lielu ECH devu ievadīšanas(ehinakozīds)2 nedēļas DA saturs palielinājās līdz 47,97 procentiem no normas un bija ievērojami augstāks nekā ar MPTP bojātām pelēm (p= 0.015). No otras puses, ECH palielināja arī metabolītu DOPAC saturu, kas samazināts MPTP modelī.(ehinakozīds)so that the ratio of DOPAC/DA was not significantly changed (p>0.05). Likās, ka ECH(ehinakozīds)nav acīmredzamu noteikumu par DA katabolismu.

2.4. ECH(ehinakozīds)paaugstina striatālo DAT proteīnu subakūtās MPTP bojātās pelēs

Western blot analīze parādīja, ka MPTP izraisīta izteikta dopamīna transportētāja (DAT) proteīna samazināšanās striatuma audos salīdzinājumā ar fizioloģiskā šķīduma kontroli 14 dienas pēc pēdējās injekcijas (p=0.000, 4.A, B att. ). Tomēr MPTP bojātie dzīvnieki tika ārstēti ar lielām un mērenām ECH devām(ehinakozīds)kavēja DAT proteīna samazināšanos (p{0}},001, 0,046). Zema ECH deva neuzrādīja nekādu aktivitāti DAT ekspresijas paaugstināšanā.

2.5. ECH(ehinakozīds)samazina apoptozes šūnas subakūtu MPTP bojātu peļu nigrālē

Ar terminālās dezoksinukleotidiltransferāzes mediētās dUTP-biotīna nick end marķēšanas (TUNEL) tehnikas palīdzību subakūtu MPTP bojātu peļu SNpc tika atklāts vairāk apoptotisku šūnu, kurās bija intensīvi tumši brūni krāsojoši kodoli un ievērojami sarūkoša soma, salīdzinot ar parasto kontroli ( p= 0.000, 5.A, B, C zīm.). Tomēr ar MPTP injicētais dzīvnieks tika ārstēts ar lielām un mērenām ECH devām(ehinakozīds)uzrādīja būtisku TUNEL pozitīvo šūnu samazināšanos, salīdzinot ar ar fizioloģisko šķīdumu apstrādāto MPTP modeli (p= 0.000, 0,003).

2.6. ECH(ehinakozīds)palielina GDNF un BDNF relatīvo mRNS un proteīna līmeni subakūtu MPTP bojātu peļu melnā krāsā

To define the changes in GDNF and BDNF expression at both transcriptional and protein levels after the different treatments real-time PCR and Western blot analysis were used. There were no significant differences in mRNA and protein levels of GDNF and BDNF in the ventral midbrain between the MPTP-vehicle treated animals and the saline control group at the end of the experiment (p>0.05, Fig. 6A, B, C). Tomēr pēc divu nedēļu ilgas ārstēšanas ar lielu ECH devu(ehinakozīds), GDNF relatīvais mRNS un proteīna līmenis bija ievērojami paaugstināts, salīdzinot ar nesēju ārstētām ar MPTP bojātām pelēm (294-reizes mRNS un 184,34 procenti MPTP kontroles proteīnā, p=0.{{ 8}}05, 0.000). Šie paaugstinājumi bija arī nozīmīgi, salīdzinot ar fizioloģiskā šķīduma kontroles dzīvniekiem (1.{11}}reize un 142,63 procenti no fizioloģiskā šķīduma kontroles, p=0,003, 0,001, 6.A, C att.). Tikmēr mērenās devas ECH(ehinakozīds)uzrādīja vājāku, bet joprojām acīmredzamu GDNF mRNS un proteīna līmeņa paaugstināšanos (213-reizes un 160,55 procenti no MPTP kontroles, p= 0.012, 0,001). Līdzīgas izmaiņas bija arī BDNF ekspresijā, kam bija ievērojami augstāks relatīvais mRNS un olbaltumvielu līmenis lielas devas ECH.(ehinakozīds)ārstēto grupu, salīdzinot ar MPTP bojātām vai normālām kontroles pelēm (3,75 reizes un 185,93 procenti no MPTP kontroles, p= 0.001, 0.000; 2,33 reizes un 154,39 procenti fizioloģiskā šķīduma kontroles, p= 0,002, 0,001, 6.A, C att.). Ārstēšana ar mērenu devu ECH(ehinakozīds)paaugstināta gan BDNF mRNS, gan proteīna ekspresija (2,51 reizes un 162,69 procenti no MPTP kontroles, p= 0.044, 0,002). Tādējādi ECH(ehinakozīds)spēja palielināt gan mRNS, gan GDNF un BDNF proteīnu ekspresiju no devas atkarīgā veidā.

2.7. ECH(ehinakozīds)samazina Bax/Bcl-2 relatīvo mRNS un olbaltumvielu attiecību subakūtu MPTP bojātu peļu melnajā substantia

ECH ietekme(ehinakozīds)par apoptozi, kas, kā zināms, ir vēl viens svarīgs faktors, kas saistīts ar nigrālo dopamīnerģisko neironu zudumu PD(Parkinsona slimībaslimība), were assessed by analyzing the Bax and Bcl-2 expression by Real-time PCR and Western Blot. The relative mRNA levels of the pro-apoptotic factor Bax increased in SN of MPTP-lesioned mice (2.14-fold of saline control, p=0.036), while those of the anti-apoptotic factor Bcl-2 were not significantly different with normal control mice (p>0.05, 7. att.). Tomēr mRNS attiecība Bax/Bcl-2 tika ievērojami palielināta bojātajām pelēm (1.99-fizioloģiskā šķīduma kontroles reize, p=0,002), un šo pieaugumu varēja mainīt. ar lielu ECH devu(ehinakozīds) after 14 days of treatment (37.12% of MPTP control, p=0.000, Fig. 7A) due to a slight down-regulation of Bax (82.71% of MPTP control, p>0.05) un acīmredzama Bcl-2 gēna ekspresijas regulēšana (2.39-MPTP kontroles reize, p=0.000). Mērenas devas ECH bija līdzīga, bet vājāka ietekme uz Bax/Bcl-2 mRNS attiecību.(ehinakozīds)salīdzinot ar ar nesēju ārstētām MPTP bojātām pelēm (63,88 procenti MPTP kontroles, p=0.016, 7.A attēls). Vienprātīgi, proteīna attiecība Bax/Bcl-2 tika ievērojami palielināta ar MPTP bojātām pelēm (265,97 procenti no fizioloģiskā šķīduma kontroles, p=0.000), un to mainīja augstais un mērenas ECH devas(ehinakozīds)(52,33 procenti , 67,25 procenti no MPTP kontroles, p=0.000, 0.001 7.B, C att.), bet ne pēc ECH devas 10 mg/kg, atspoguļojot ietekme uz mRNS Bax/Bcl{10}} attiecību.

3. Diskusija

Šajā pētījumā mēs pirmo reizi parādām, ka ECH(ehinakozīds), monomērs, kas iegūts no tradicionālā ķīniešu auga, ir neirorescue aktivitātes subakūtā MPTP peles modelī PD(Parkinsona slimībaslimība)kā arī potenciāls izraisīt NTF ekspresiju gan transkripcijas, gan olbaltumvielu līmenī. Pēc 14 dienu iekšķīgas lietošanas ECH(ehinakozīds)demonstrēja daudzfunkcionālu ietekmi uz dopamīnerģisko neironu funkcijas glābšanu, DAT samazināšanās atvieglošanu, vairāku apoptozes šūnu augšanas kavēšanu SNpc un gaitas traucējumu uzlabošanu, salīdzinot ar ar fizioloģisko šķīdumu apstrādātajām MPTP bojātajām pelēm. Mēs pieņemam, ka ECH neirorescue aktivitātes ir vismaz daļēji saistītas ar mRNS un proteīnu ekspresijas relatīvo paaugstināšanos GDNF un BDNF, kā arī regulējumu par Bax un Bcl-2, divām galvenajām Bcl{{3 molekulām. }} ģimene, kas iesaistīta dopamīnerģisko neironu apoptozē SN.

Lai gan konstatējumi par dažādiem terapeitiskiem veidiem no dažādiem in vitro un in vivo PD(Parkinsona slimībaslimība)modeļi ir daudzsološi, neiroaizsardzība PD(Parkinsona slimībaslimība)joprojām ir nenotverams mērķis. Salīdzinot ar identificētajām neiroprotekcijas stratēģijām, kurām gandrīz vienmēr bija nepieciešama iepriekšēja ārstēšana (ti, ievadīšana pirms traumas), neiroglābšanas vai atjaunošanas stratēģijas vairāk atbilst klīniski farmakoloģiskās iejaukšanās veidam PD agrīnā stadijā. Mūsu pētījumā ECH(ehinakozīds)ievadīšana tika uzsākta pēc MPTP bojājuma, kas atšķiras no iepriekšējiem pētījumiem, un tai bija skaidras priekšrocības. Vēl viens novēlotās ārstēšanas uzsākšanas mērķis bija nodrošināt, ka jebkādas novērotās sekas nav saistītas nedz ar savienojumu, kas traucē MPTP pārvēršanos par tā aktīvo metabolītu MPP plus, nedz MAO-B izraisītu reakciju, nedz iespējamu strauju samazinātu DAT funkciju un tad bloķē MPP plus uzņemšanu (Sagi et al., 2007; Lai et al., 2009).

Ir labi zināms, ka neironu izdzīvošanai nepieciešams trofisks atbalsts. GDNF un BDNF ir visdaudzsološākie trofiskie faktori neirodeģeneratīvo slimību neiroglābšanā vai atjaunojošā ārstēšanā, jo īpaši PD(Parkinsona slimībaslimība). Līdz šim ir veikti vairāki klīniskie pētījumi, lai pētītu trofisko faktoru, īpaši GDNF, piegādi tieši PD smadzenēm, taču tie ir devuši dažādus rezultātus. Problēma var būt saistīta ar piegādes vietu un metodi, proti, GDNF sadalījumu pēc dažādām injekcijas vai infūzijas metodēm (Lang et al., 2006; Morrison et al., 2007; Nutt et al., 2003; Slevin et al. , 2007). Ārstējot uz šūnām balstītas ievadīšanas sistēmas vai gēnu terapiju, ko izmanto ar vīrusu vektoriem, GDNF gēna un proteīna pārmērīga ekspresija varētu veicināt šūnu dzīvotspēju dopamīnerģiskajos vidussmadzeņu neironos un izraisīt simptomātisku uzlabošanos žurkām ar 6-OHDA bojājumiem un ārstētajiem pērtiķiem. ar MPTP (Andereggen et al., 2009; Kong et al., 2008). Tomēr šīm terapijām joprojām ir kritiskas problēmas saistībā ar to klīnisko pielietojumu, jo ir jautājumi par gēnu pārneses efektivitāti un stabilitāti un imūnās atbildes iespējamību (Mochizuki, 2009).
Lai gan ir bijuši centieni pārvarēt problēmas šūnu vai gēnu terapijā, kas saistītas ar piegādi ar neiroķirurģijas palīdzību, arvien lielāka uzmanība tagad tiek pievērsta stratēģijām, kas izraisa endogēno trofisko faktoru izpausmi vai uzlabo to signalizāciju kā alternatīvas PD terapijas iespējas.(Parkinsona slimībaslimība)(Chen et al., 2007a,b; Saavedra et al., 2008). Šajā pētījumā mēs pirmo reizi ziņojam, ka ECH(ehinakozīds)ir neirorescue un neirotrofiska iedarbība PD(Parkinsona slimībaslimība)peles modeli, un šie efekti ir saistīti ar GDNF un BDNF regulēšanu mRNS un olbaltumvielu līmenī. Būtiskā atšķirība starp aksonu vai šķiedru skaitu ECH(ehinakozīds)ārstētās peles, salīdzinot ar nesējvielu ārstētām MPTP bojātām pelēm, parādīja, ka šis savienojums veicināja neirīta izaugšanu un reģenerāciju. Proti, šķiedru blīvums ārstētajās pelēs tuvojās normālam netraumētam līmenim (∼ 96,24 procenti lielas ECH devas gadījumā). Iespējamais skaidrojums šķietami lielākajam TH pozitīvo neironu skaitam ar ECH ārstētām bojātām pelēm ir tas, ka ECH atdarina vai uzlabo GDNF un BDNF lomu, jo īpaši GDNF var spēcīgi modulēt dopamīna ventrālo mezenfālisko neironu dzīvotspēju un fenotipisko ekspresiju un var kompensēt šūnu zudumu (Palfi et al., 2002). Citiem vārdiem sakot, iespējams, ka ECH pārregulē TH gēna transkripciju līdzīgi kā GDNF (Xiao et al., 2002). Tāpēc mūsu pētījums ne tikai apstiprināja, ka ECH ir labvēlīga kā dabiskas zemas molekulmasas zāles MPTP peles modelī, bet arī parādīja iespējamos šo efektu mehānismus, kas atbilst trofisko faktoru starpniecībai.

EhinakozīdsiekšāCistancheirNeirotrofisksunneiroglābšanaietekme uzParkinsona slimībaslimība

Vēl viens interesants atklājums mūsu pētījumā ir tas, ka nav acīmredzamu MAPK/ERK1/2 vai Ras-PI3K-Akt izdzīvošanas ceļa aktivizācijas pazīmju, kas, kā ziņots, veicina NTF neironu glābšanas efektus (Yu et al., 2006; Sagi et al. ., 2007). Tā kā p-ERK1/2 (aktivētā MAPK fosforilētā forma) un p-Akt (Ras-PI3K-Akt ceļa aktivētā zīme) ar Western blot analīzi netika atklāti ar MPTP bojāto dzīvnieku vidussmadzenēs, kuri tika ārstēti ar lielu ECH devu. (dati netiek rādīti). Viens no iespējamiem skaidrojumiem ir novēlots noteikšanas laiks, jo ERK aktivitāte parasti tiek strauji palielināta pēc zāļu stimulācijas (Hisaoka et al., 2007), un vēl viena iespēja ir šo signalizācijas ceļu neiesaistīšanās ECH neiroglābšanas vai neirotrofiskajai iedarbībai subakūtā MPTP peles modelī. no PD(Parkinsona slimībaslimība)kas ir jāizmeklē tālāk.

Mūsu pētījumā subakūts MPTP režīms PD(Parkinsona slimībaslimība)peles modelis izraisa apoptozi un dopamīnerģiskos bojājumus, kas stabilizējas 21 dienu pēc MPTP ievadīšanas, kas atbilst iepriekšējās literatūras ierakstiem (Jackson-Lewis un Przedborski, 2007). Apoptozes nomākšana var aizsargāt neironus pret ievainojumiem, sākot no trofisko faktoru atņemšanas līdz patoloģiskiem stimuliem (Yuan un Yankner, 2000). Turklāt NTF var aizsargāt neironus pret mitohondriju izraisītu apoptozi, kas rodas, aktivizējoties fosfatidilinozitola{5}} kināzes ceļam (Toth et al., 2002). Ir zināms, ka apoptozi regulē vairāki ceļi. Iepriekšējie pētījumi par Bcl-2 proteīniem apstiprina domu, ka šādi proapoptotiski ģimenes locekļi piedalās neironu nāvē dažādās PD(Parkinsona slimībaslimība)modeļi (Levy et al., 2009). Apoptozi veicinošie proteīni, tostarp Bax, iedarbojas uz citohromu mitohondriju membrānā, savukārt apoptozi novēršošie proteīni, piemēram, Bcl-2, darbojas, heterodimerizējoties ar Bax proteīniem un novēršot to aktivitāti. Tāpēc ir zināms, ka Bax/Bcl-2 attiecība nosaka, vai dažas šūnas dzīvos vai mirs (Tanaka et al., 2004). Iepriekšējie mūsu laboratorijas pētījumi ir parādījuši ECH iespējamo neiroprotektīvo un anti-apoptotisko lomu(ehinakozīds)uz MPP plus inducētām SH-SY5Y šūnām, izmantojot plūsmas citometriju un citus ar apoptozi saistītus testus (Wang et al., 2007). Tādējādi mēs turpinājām analizēt ECH anti-apoptotiskās iedarbības molekulāro bāzi(ehinakozīds)in vivo šajā pētījumā. Mēs atklājam, ka lielas un mērenas ECH terapijas devas kavē gan TUNEL pozitīvo apoptozes šūnu skaita pieaugumu SNpc, gan Bax/Bcl-2 attiecību gēnu un olbaltumvielu līmenī, salīdzinot ar MPTP bojāto grupu. Šie novērojumi sniedz dažas norādes par iespējamiem ECH anti-apoptotiskiem mehānismiem ārpus ietekmes uz kaspāzes ģimenēm. Lai gan mūsu sākotnējais pētījums nav noteicis apoptotisko šūnu fenotipu, iepriekšējie pētījumi liecina, ka TH pozitīvie neironi iziet apoptotisku deģenerāciju un zaudē savu TH aktivitāti, bet ne glia šūnas PD neakūtā MPTP peles modelī (Novikova et al., 2006). . Turklāt mūsu pētījums vēl vairāk apstiprina Bcl-2 ģimenes locekļu iesaistīšanos subakūtā MPTP izraisītā PD peles modeļa patoģenēzē.(Parkinsona slimībaslimība). Joprojām nav skaidrs, vai pastāv kopīgas attiecības starp Bcl-2 ģimenes locekļiem un NTF. Tomēr mūsu pašreizējie rezultāti liecina, ka endogēnā GDNF un/vai BDNF līmeņa paaugstināšana un Bcl-2 proapoptotisko ģimenes locekļu izpausmju regulēšana var būt noderīga neironu reģenerācijas terapijas stratēģija.

Visbeidzot ECH ietekme(ehinakozīds)par gaitas traucējumu atvieglošanu MPTP peles modelī ilustrē tās potenciālu kā simptomātisku medikamentu, koncentrējoties uz nedopamīnerģiskiem mērķiem, kas pašlaik ir daudzsološu pētījumu uzmanības centrā klīniskajos pētījumos. PD(Parkinsona slimībaslimība), motoriskie simptomi, piemēram, bradikinēzija un stīvums, labi reaģē uz dopamīna aizstājējiem. Līdzsvara un gaitas problēmas var novērst arī ar dopamīnerģiskiem līdzekļiem slimības sākumā, taču tās parasti kļūst rezistentas slimības progresēšanas laikā (Meredith un Kang, 2006). Mūsu pētījumā īslaicīga (7 dienas) ievadīšana ar lielu ECH devu(ehinakozīds)bija pozitīva ietekme uz peļu soļa garumu, kas liecina, ka tas varētu būt daudzsološs papildinājums dopamīna aizstājējzālēm.

Jāatzīmē, ka mūsu pētījumā tika pētīta arī glia šūnu ekspresija, izmantojot imunofluorescenci, bet MPTP bojātām pelēm, kuras tika ārstētas ar ECH, netika novērotas astrogliālās vai aktivētās mikroglia ekspresijas izmaiņas.(ehinakozīds)salīdzinot ar ar fizioloģisko šķīdumu apstrādātām MPTP pelēm (dati nav parādīti). Neskatoties uz to, mēs varam domāt, ka ECH ietekme(ehinakozīds)neaprobežojas tikai ar iepriekš minētajiem dopamīnerģiskās sistēmas poliem, un nākamie pētījumi būs nepieciešami, lai definētu visas ECH lomas un mehānismus PD grauzēju vai primātu modeļos.(Parkinsona slimībaslimība).

Noslēgumā jāsaka, ka šis pētījums parāda, ka ECH(ehinakozīds)uzrādīja neirorescue ietekmi uz MPTP izraisītu dopamīnerģisko neironu un šķiedru zudumu in vivo, kā arī uz uzvedības traucējumiem. Šķiet, ka šie efekti ir saistīti ar šī savienojuma daudzfaktoru aktivitātēm, tostarp MPTP toksicitātes mazināšanu pret DAT, neirotrofisko faktoru GDNF/BDNF izpausmes pastiprināšanu un patoloģiskas apoptozes nomākšanu subakūtu MPTP bojātu peļu ventrālajā vidussmadzenēs, regulējot Bcl{{ 1}} ģimenes locekļi. Apvienojumā ar mūsu iepriekšējā pētījuma rezultātiem par ECH neiroprotektīvo iedarbību(ehinakozīds)in vitro mēs pieņemam, ka šim savienojumam ir potenciāls ne tikai aizkavēt PD progresēšanu(Parkinsona slimībaslimība)bet arī novērst esošos neirodeģeneratīvos bojājumus un pat uzlabot simptomus. Kopumā šie dati liecina, ka ECH(ehinakozīds)ir daudzsološa, klīniski piemērojama pieeja PD ārstēšanai(Parkinsona slimībaslimība).

4. Eksperimentālās procedūras

4.1. Dzīvnieku protokoli

Visas procedūras apstiprināja Zhongshan slimnīcas Fudaņas universitātes Dzīvnieku ētikas komiteja, un tās tika veiktas saskaņā ar Nacionālo veselības institūtu rokasgrāmatu par laboratorijas dzīvnieku aprūpi un lietošanu.

Eksperimenti tika veikti, izmantojot C57BL/6 peļu tēviņus, kas iegādāti no Shanghai Slac Laboratory Animal Company (Šanhaja, Ķīna) 10 nedēļu vecumā un sver 24–26 g. Dzīvnieki tika turēti standarta apstākļos (12 ⁄ 12 h gaismas ⁄ tumšs cikls, 21 ± 2 grādi un relatīvais mitrums 40 procenti) un tiem tika nodrošināta piekļuve barībai un ūdenim ad libitum.

4.2. MPTP administrēšana

Peles katru dienu saņēma intraperitoneālas (ip) nesēja (fizioloģiskā šķīduma) vai MPTP (30 mg/kg/dienā; Sigma, ASV) injekcijas, kas izšķīdinātas fizioloģiskā šķīdumā piecas dienas pēc kārtas, lai izraisītu parkinsonismu. Katrā ārstēšanas grupā bija desmit peles. ECH tika iegādāts no Chengdu Push Bio-Technology Co. Ltd (Sichuan, Ķīna). Ekstrakts atbilst uzņēmuma standartam un tika pārbaudīts ar HPLC, kas ir lielāks vai vienāds ar 98 procentiem. ECH(ehinakozīds)tika izšķīdināts fizioloģiskā fizioloģiskā šķīdumā un noregulēja pH līdz 7,4, pirms tas tika ievadīts ar intragastriskas (ig) ievadīšanas palīdzību. ECH ietekme(ehinakozīds)par MPTP izraisītu parkinsonismu tika pētīti šādās eksperimentālās grupās: I grupa, NS (fizioloģiskais šķīdums, ip) plus NS (ig); II grupa, MPTP (ip) plus NS (ig); III grupa, MPTP (ip) plus ECH 10 mg/kg/dienā (ig); IV grupa, MPTP (ip) plus ECH 20 mg/kg/dienā (ig); V grupa, MPTP (ip) plus ECH 30 mg/kg/dienā (ig); VI grupa, NS (ip) plus ECH 30 mg/kg/dienā (ig).

I–VI grupas dzīvnieki saņēma fizioloģisko šķīdumu vai MPTP (ip) katru dienu 5 dienas; transportlīdzeklis (fizioloģiskais šķīdums) vai ECH(ehinakozīds)ārstēšana (ig) tika uzsākta 72 stundas pēc pēdējās MPTP ievadīšanas un tika veikta katru dienu 14 dienas. Peles tika nogalinātas ar dzemdes kakla dislokāciju vai perfūziju pēc pēdējās nesēja vai ECH ievadīšanas un uzvedības novērošanas.

4.3. Gaitas pārbaude

Gaitas tests tika veikts pēc iepriekš publicētām metodēm (Fernagut et al., 2002; Fleming et al., 2004; Tillerson et al., 2002) ar nelielu modifikāciju. Aparāts sastāvēja no skrejceļa, 4,5 cm (platums) × 40 cm (garums) × 12 cm (augstums), ko apgaismoja gaisma (60 W) un melnas koka kastes, 20 cm (platums) × 17 cm (garums) × 10 cm (augstums), kas novietots vienā skrejceļa galā. Dzīvnieku priekšējās un pakaļējās ķepas tika saslapinātas ar zīmuļzilu tinti, un tiem ļāva rikšot uz papīra strēmeles (platums 4,5 cm, garums 40 cm) pa spilgti apgaismoto skrejceļu pretī tumšajai vārtu laukumam. Soļa garums tika mērīts manuāli kā attālums starp diviem ķepu nospiedumiem. Trīs garākie soļa garumi (atbilst maksimālajam ātrumam) tika izmērīti katrā skrējienā. Ķepu nospiedumi, kas tika veikti skrējiena sākumā (7 cm) un beigās (7 cm), tika izslēgti ātruma izmaiņu dēļ. No analīzes tika izslēgti braucieni, kuros eksperimentētājs novēroja peles apstāšanos vai acīmredzamu palēninājumu. Uzvedības novērtējums tika veikts 3 dienas pirms pirmās MPTP injekcijas un ECH 7. un 14. dienā(ehinakozīds)vai transportlīdzekļa apstrāde.

4.4. Perfūzija un audu apstrāde

Eksperimenta beigās puse dzīvnieku (n{{0}}) katrā grupā tika nogalināti 10% hlorālhidrāta pārdozēšanas anestēzijā (360 mg/kg). ), pēc tam intrakardiālas infūzijas veidā ar fizioloģisko šķīdumu (0,9 procenti), kam seko 4 procenti paraformaldehīda (PFA), pH 7,4. Pēc intrakardiālās perfūzijas smadzenes tika savāktas un pēcfiksētas 4% PFA 24 stundas 4 grādos, iestrādātas parafīnā un sagrieztas 5 µm koronālās daļās, kas aptver visu melnās vielas kompakto daļu (SNpc) un striatumu (ST) (anteroposterior). līmeņi: Bregma -2,92 mm līdz -3,64 mm un plus 0,02 līdz plus 086 mm) ar peles smadzeņu atlanta palīdzību (Franklin and Paxinos, 1996).

Vēl 5 dzīvnieki katrā grupā tika nogalināti ar dzemdes kakla izmežģījumu, un to ventrālās vidussmadzeņu un striatuma audi tika ātri sadalīti uz ledus (Jackson-Lewis un Przedborski, 2007), sasaldēti šķidrā slāpeklī un uzglabāti –80 grādu temperatūrā līdz izmantošanai.

EhinakozīdsiekšāCistancheirNeirotrofisksunneiroglābšanaietekme uzParkinsona slimībaslimība

4.5. Tirozīna hidroksilāze un Nissl imūnhistoķīmija

Smadzeņu audu imūnhistoķīmija tika veikta, kā aprakstīts iepriekš (He et al., 2008; Yokoyama et al., 2008) ar nelielām modifikācijām. Īsumā, viens sekciju komplekts caur SNpc (sastāv no 14–15 sekcijām) tika sagatavots Nissl krāsošanai (krezilvioleti), izmantojot parastās procedūras, savukārt otrs komplekts caur SNpc un viens komplekts caur ST (kas sastāv no 15–16 sekcijām) tika apstrādāts. tirozīna hidroksilāzes (TH) imūnhistoķīmijai. Pēdējās sekcijas tika inkubētas ar 0,3 procentiem ūdeņraža peroksīdu (H2O2) 10 min istabas temperatūrā, lai noņemtu endogēno peroksidāzes aktivitāti, un pēc tam ievietoja bloķējošā buferšķīdumā, kas satur 10 procentu kazas serums ar 0,2 procentiem Triton X-100 0,01 M PBS (pH 7,2) 30 minūtes 37 grādu temperatūrā. Katrā apstrādē priekšmetstikliņi tika mazgāti vismaz trīs reizes ar 0, 01 M PBS katru 5 minūtes. Pēc tam tos nakti inkubēja 4 grādu temperatūrā ar peles anti-TH monoklonālo antivielu (Sigma, ASV) 1:2000 atšķaidījumā 0,01 M PBS, kas satur 1 procentu kazas seruma un 0,2 procentus Triton X-100. Otrajā dienā sekcijas tika apstrādātas 30 minūtes ar biotinilētu anti-peles IgG un pēc tam apstrādātas ar streptavidīna-peroksidāzes kompleksu (ABC komplekts, Vector, ASV). Peroksidāzes reakcija tika vizualizēta ar 0,05 procentiem diaminobenzidīna (DAB) ar 0,03 procentiem H2O2 Tris-HCl buferšķīdumā. Sekcijas caur SNpc tika iekrāsotas ar krezilvioletu (Sigma, ASV), kā arī anatomiskai atsaucei. Kontrolēm sekcijas tika apstrādātas, kā aprakstīts iepriekš, izņemot to, ka netika izmantota primārā antiviela. Kontroles sekcijas bija imūnnegatīvas

4.6. TH-imūnreaktīvo neironu un šķiedru kvantitatīva noteikšana

Katra 10. sadaļa (kopā 14–15 sekcijas) caur SNpc, kas atbilst Bregma –2,92 mm līdz –3,64 mm, tika analizēta, izmantojot Olympus BX51 mikroskopu ar DP71 kameru (Olympus, ASV). Pēc SNpc noteikšanas zemā palielinājumā (4x objektīvs) saskaņā ar peles smadzeņu atlantu divi novērotāji, kuri bija akli pret ārstēšanu ar lielāku palielinājumu (20x objektīvs), saskaitīja ar Nissl iekrāsotās un TH imūnreaktīvās šūnas labajā pusē. . Tika skaitītas gan TH pozitīvās (TH un krezilvioletas pozitīvas) un Nissl krāsotas (krezilvioletas pozitīvas) šūnas ar kodolu, lai nodrošinātu, ka ārstēšanas efekti ir saistīti ar TH šūnu palielināšanos, nevis fermenta augšupregulāciju. Ņemiet vērā, ka TH-imūnreaktīvo profilu analīzes aprobežojās ar SNpc un tādējādi izslēdza ventrālo tegmentālo zonu.

Striatālo dopamīnerģisko šķiedru optiskais blīvums (OD) tika analizēts datorā, izmantojot programmatūru Image-Pro Plus, pēc iepriekš aprakstītās optiskā sadalīšanas metodes (Burke, et al., 1990; Wu et al., 2{). {5}}02). Katras zonas vidējais marķējums tika aprēķināts piecām automātiski saskaņotām viena un tā paša dzīvnieka smadzeņu sekcijām, kas atbilst Bregma plus 0,38 mm– plus 0,50 mm peles smadzeņu atlantā (n{7}} katrā grupā). Striatālo attēlu labā puse tika iegūta ar tādu pašu palielinājumu (10 × objektīvs), un tādējādi krāsošanas OD tika novērtēts visam sekciju reģionam automātiski. Fona intensitāte, kas iegūta no corpus callosum bez TH iekrāsošanās, tika atņemta no katra mērījuma.

4.7. TUNEL tests

Sērijveida smadzeņu koronālās sekcijas caur SNpc, kas atbilst Bregma –2,92 mm līdz –3,64 mm, tika savāktas, izmantojot peles smadzeņu atlantu (Franklin and Paxinos, 1996). Vismaz viena no katrām 10 sekcijām (kopā 14–15 sekcijas) no katra dzīvnieka tika apstrādāta fragmentētas DNS krāsošanas (TUNEL) in situ beigu marķēšanai, izmantojot In Situ šūnu nāves noteikšanas komplektu, AP (Roche, Vācija) saskaņā ar ražotāja instrukcijas un literatūra ar nelielām izmaiņām (Novikova et al., 2006; He et al., 2008). Negatīvās kontroles tika veiktas paralēli bez terminālās dezoksinukleotidiltransferāzes. Sekcijas beidzot tika iekrāsotas ar hematoksilīnu. Kopējais TUNEL pozitīvo šūnu skaits uz viena priekšmetstikliņa (kopā 14–15 sekcijas, labajā pusē) no katra dzīvnieka tika akli skaitīts gaismas mikroskopā ar 20x objektīva palielinājumu SNpc anatomiskajās robežās.

4.8. HPLC

Striatāla audos tika pārbaudīts DA un tā metabolītu līmenis, izmantojot augstspiediena šķidruma hromatogrāfijas (HPLC) Coulochem III sistēmas ar elektroķīmisko noteikšanu (ESA Inc., Chelmsford, MA), kā aprakstīts iepriekš ar nelielām izmaiņām (Petroske et al., 2{{). 4}}{{10}}1; Schneider et al., 2006). Īsumā, striatums tika izgriezts un nosvērts (kreisajā pusē), ievietots plastmasas mēģenēs, homogenizēts ar ultraskaņu 10 sekundes 0,4 M perhlorskābē un centrifugēts ar ātrumu 15, 000 apgr./min 20 minūtes 4 grādu temperatūrā. Supernatanti tika izlaisti caur 0{11}} μm miliporu filtru. Kustīgā fāze, kas sastāv no 100 mM NaH2PO4, 50 mM citronskābes, 6% metanola, 1,7 mM 1-oktānsulfonskābes, 50 μM EDTA, 10% acetonitrila, tika piegādāta ar plūsmas ātrumu 0,6 ml/min plkst. 25 grādi pret apgrieztās fāzes kolonnu. 20 ul supernatanta šķīduma alikvotas injicēja ar HPLC automātisko paraugu ņemšanas ierīci ar dzesēšanas moduli, kas iestatīts uz 4 grādiem. Dati tika kalibrēti ar ārēju standartu. Dopamīna un tā metabolītu līmenis tika aprēķināts un izteikts kā ng/mg mitro audu svara.

4.9. Reāllaika PCR

Kopējā RNS tika izolēta, homogenizējot vēdera vidussmadzeņu sasaldētus audus (kreisajā pusē) 1 ml Trizol reaģenta (Invitrogen, ASV), kam sekoja izopropanola izgulsnēšana (n= 5). Granulas tika mazgātas ar 70% etanolu un suspendētas ūdenī, kas nesatur RNāzi, un RNS koncentrācija tika noteikta, izmantojot GeneQuant RNS/DNS kalkulatoru (Amersham Biosciences, NJ). RNS (1 ug) tika ņemta par veidni, un kopējā cDNS sintēze tika veikta, izmantojot PrimeScriptTM RT reaģentu komplektu (Takara, Japāna). SYBR Green PCR amplifikācija tika veikta Realplex4 S Real-time PCR instrumentā (Eppendorf, vācu; Premix Ex TaqTM, Takara). Kā endogēna kontrole -aktīns tika marķēts ar reportierkrāsu. Termociklēšanas profila apstākļi bija šādi: 95 grādu 3 min sākotnējā denaturācija, pēc tam 40 cikli ar 95 grādu 15 s denaturāciju, 61 grādu 15 s atkausēšanu ar 72 grādu 45 s galīgo pagarinājumu. Relatīvās locījuma izmaiņas tika noteiktas ar 2−ΔΔCt metodi, kā aprakstīts iepriekš (Livak and Schmittgen, 2001). Praimeru secības bija šādas 2. tabulā. Visi praimeri tika izstrādāti saskaņā ar attiecīgo literatūru un sintezēti Genemed Company.

4.10. Western blot

Western blot analīzei izolēti audi no striatuma (DAT un -aktīna testam) vai ventrālās vidussmadzenes (GDNF, BDNF, Bax, Bcl-2 un -aktīna testam) tika homogenizēti RIPA buferšķīdumā (5{{9} } mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP–40, 0,5% nātrija deoksiholāta, 0,1% SDS un nātrija ortovanadāta, nātrija fluorīds, EDTA, leupeptīns) un centrifugēts pie 13,000 apgr./min pie 4 grādiem 5 min. Kopējais olbaltumvielu saturs supernatantā tika noteikts, izmantojot BCA Protein Assay Kit ar spektrofotometru, un tas tika atšķaidīts līdz atbilstošai galīgajai koncentrācijai ar homogenizācijas buferšķīdumu un olbaltumvielu šķīdināšanas šķīdumu. Paraugu vārīja 3 minūtes, un 20 ul (satur 30 ug proteīna) no katra parauga tika uzklāti uz SDS poliakrilamīda (10 procenti) gēla elektroforēzei. Gelu 2 stundas darbināja ar 80 V spriegumu, pēc tam elektroforētiski pārnesa uz nitrocelulozes membrānu pārneses buferšķīdumā, izmantojot Trans-Blot SD (Bio-Rad) pie 20 V 1,5 stundas, pēc tam 4 stundas bloķēja, iegremdējot TBST, kas satur 1 procentu BSA. RT un inkubēts 4 grādos nakti ar attiecīgajām primārajām antivielām: trušu anti-DAT (1:200, Chemicon International Inc, ASV), peles anti-GDNF, BDNF (1:200, Santa Cruz Biotechnology, ASV), peles anti-DAT. Bakss, Bcl-2, -aktīns (1:1000, Santakrusa). Pēc trīs reizes skalošanas TBST 10 minūtes, blotus inkubēja 2 stundas RT ar konjugētu anti-trušu IgG peroksidāzi (1:2000, Santakrusa). Imunoreaktivitāte tika vizualizēta ar ECL fluorescences noteikšanas sistēmu (GE, ASV). Blotus skenēja KODAK In-Vivo Multispectral Imaging Systems FX (Carestream Health, ASV) 5 minūšu ekspozīcijas laikā, un attēlus automātiski ieguva CCD. Olbaltumvielu joslu intensitāte tika mērīta ar densitometriju un izteikta kā attiecība pret aktīna intensitāti, lai nodrošinātu, ka olbaltumvielu līmeņa izmaiņas nav saistītas tikai ar atšķirībām parauga ielādes daudzumos (Matsunaga et al., 2006).

4.11. Statistiskās analīzes

Visi dati tika attēloti kā vidēji ± SEM. Statistikas nolūkos tika veikta vienvirziena ANOVA, kam sekoja Tukey HSD post-hoc analīze un Studenta–Ņūmena–Keula vairāku salīdzinājumu tests. Vērtība p< 0.05="" was="" considered="" statistically="">

Pateicības

Šo darbu atbalstīja Zinātniskā un tehniskā atbalsta programma, Ķīnas Zinātnes un tehnoloģiju ministrija (Nr. 2006BAI04A11-3) un Šanhajas pašvaldības valdības medicīnas vadītāja sponsors (Nr. 2007- 057). Mēs pateicamies profesoram Fang Huang un profesoram Danian Zhu par viņu norādījumiem par eksperimentiem un manuskriptu.

EhinakozīdsiekšāCistancheirNeirotrofisksunneiroglābšanaietekme uzParkinsona slimībaslimība

No: ' Neirotrofiskie un neiroglābšanas efektiEhinakozīdsgada subakūtā MPTP peles modelīParkinsona slimībaslimība' autorsQing Zhao u.c

---BRAIN RESEARCH 1346(2010)224-236