Oligosaharīdi uzlabo akūtu nieru bojājumu, mazinot diferenciācijas kopu 44-mediētas imūnās atbildes nieru kanāliņu šūnās

Abstract:Akūts nieru bojājums (AKI)ir pēkšņa epizodenieru bojājumikas parasti rodas pacientiem, kuri tiek hospitalizēti. Līdz šim nav izstrādāta ideāla ārstēšana, lai samazinātuAKI smagums. Oligo-fukoidāns(FC) traucē nieru kanāliņu šūnu virsmas proteīnu kopu ar diferenciāciju 44 (CD44), lai novērstu nieru intersticiālu fibrozi; tomēr oligosaharīdu ietekme uz AKI joprojām nav zināma. Šajā pētījumā tika izvēlēti FC, galakto-oligosaharīds (GOS) un frukto-oligosaharīds (FOS), lai izpētītu oligosaharīdu ietekmi uz AKI. Ir pierādīts, ka visi trīs oligosaharīdi daļēji uzsūcas zarnās. Mēs atklājām, ka oligosaharīdi atkarībā no devas samazināja CD44 antigenitāti un nomāca hipoksijas izraisīto CD44, fosfo-JNK, MCP-1, IL-1 un TNF- ekspresiju NRK-52E. nieru kanāliņu šūnas. Tikmēr CD44 siRNS transfekcija un JNK inhibitors SP600125 samazināja hipoksijas izraisīto fosfo-JNK un citokīnu ekspresiju. CD44 ligands, hialuronāns, neitralizēja oligosaharīdu ietekmi uz CD44 un fosfo-JNK. 2 dienas pēc operācijas išēmijas-reperfūzijas traumas dēļ oligosaharīdi samazināja nieru iekaisumu, samazināja kreatīna līmeni serumā, MCP-1, IL-1 un TNF- AKI pelēm. 7 dienas pēc operācijas tika veicināta nieru atveseļošanās. Šie rezultāti liecina, ka FC, GOS un FOS inhibē hipoksijas izraisīto CD44 / JNK kaskādi un citokīnus nieru kanāliņu šūnās, tādējādi uzlabojot AKI un nieru iekaisumu AKI pelēm. Tāpēcoligosaharīdu papildināšanair potenciāla veselības aprūpes stratēģija pacientiem ar AKI.

Atslēgvārdi: akūts nieru bojājums; diferenciācijas klasteris 44; frukto-oligosaharīds; galakto-oligosaharīds; oligo-fukoidāns; iekaisums

1. Ievads

Akūts nieru bojājums(AKI) raksturo pēkšņa glomerulārās filtrācijas ātruma samazināšanās un no tā izrietošā kreatinīna līmeņa paaugstināšanās serumā. Šis bojājums ir izplatīts pacientiem, kas ievietoti slimnīcās un intensīvās terapijas nodaļās, īpaši gados vecākiem cilvēkiem. Išēmija, sepse un nefrotoksicitāte ir galvenie AKI cēloņi, kas bieži vien pastāv līdzās un tādējādi sarežģī diagnostiku un ārstēšanu [1]. Smaga AKI pakļauj izrakstītajiem pacientiem nevēlamu notikumu, piemēram, hronisku nieru slimību, sirds un asinsvadu slimību, vēža un infekciju risku [2]. AKI ir strauji attīstās, un nav pieejama efektīva ārstēšana, lai izvairītos no tā vai samazinātu tās smagumu. Specifisku uzturvielu uzņemšana var samazināt nieru kanāliņu bojājumus AKI [3]. Tāpēc specifiska uztura ietekmes uz AKI izpēte palīdzēs uzlabot AKI un ar to saistītos riskus, ar kuriem saskaras izrakstīti pacienti.

Iekaisums un leikocītu uzkrāšanāsir galvenie AKI starpnieki. Nieres, īpaši nieru kanāliņu šūnas, ģenerēiekaisuma citokīniAKI laikā, piemēram, IL-1, IL-6, monocītu ķīmijatraktants proteīns-1 (MCP-1) un audzēja nekrozes faktors (TNF-) [4,5] . Šie citokīni vēl vairāk izraisa sistēmisku iekaisumu un leikocītu piesaisti. Lai gan vairākām leikocītu apakšgrupām ir aizsargājoša iedarbība uz AKI (piemēram, T-regulējošām šūnām), lielākā daļa neitrofilu, monocītu un dendritisko šūnu ir kaitīgi AKI atveseļošanai [6]. Sistēmisks iekaisums arī kaitē atveseļošanai no AKI augstā citokīnu līmeņa dēļ [7]. Starp citokīniem, ko izdala nieres, MCP-1 galvenokārt ir atbildīgs par leikocītu piesaisti, reaģē uz dažādiem citokīniem, tostarp IL-1 un TNF- [8,9], un tam ir svarīga loma patoģenēzē. dažādu nieru bojājumu gadījumā [10]. Cilvēka proksimālajās kanāliņu šūnās HK-2 hipoksijas izraisīto MCP-1 ekspresiju nodrošina c-Jun NH2- termināla kināzes (JNK) ceļš [11]. P38 ceļš ir iesaistīts arī albumīna izraisītā MCP-1 ekspresijā nieru kanāliņu epitēlija šūnās [12]. Tāpēc JNK un p38 ceļu regulēšana var ietekmēt iekaisumu un leikocītu piesaisti AKI.

Oligosaharīdi ir saharīdu polimēri, kas satur 3–10 monosaharīdus, kas ir nesagremojami un veido galveno sastāvdaļu no kopējā pieejamo prebiotiku kā uztura piedevas [13]. Lielāko daļu cilvēka organismā uzņemto frukto-oligosaharīdu (FOS) pilnībā fermentē resnās zarnas flora, un neliela daļa tiek izdalīta urīnā [14]. Galakto-oligosaharīdi (GOS) var uzsūkties asinīs un pēc tam izdalīties ar urīnu [15]. Tāda pati situācija attiecas uz fukoidānu brūnajās jūras aļģēs [16]. Absorbētie oligosaharīdi var ietekmēt bioķīmiskās reakcijas un šūnu atpazīšanu [17]. Mūsu iepriekšējais pētījums atklāj, ka oligo-fukoidāns (FC) traucē mijiedarbību starp nieru kanāliņu šūnu virsmas proteīnu CD44 un tā ekstracelulārajiem ligandiem, tādējādi novēršot nieru intersticiālu fibrozi [18]. Mijiedarbība starp CD44 un tā ekstracelulārajiem ligandiem veicina JNK signalizācijas ceļu [19]. Tāpēc oligosaharīdu ikdienas uzņemšana var samazināt nieru iekaisumu pacientiem ar AKI. Tomēr šo polimēru ietekme uz AKI joprojām nav zināma. Šajā pētījumā tika pētīta FC, FOS un GOS ietekme uz ar hipoksiju ārstētām nieru kanāliņu šūnām un AKI pelēm ar išēmijas-reperfūzijas traumu (IRI). Rezultāti parādīja, ka trīs oligosaharīdi nomāca CD{16}}mediētās nieru imūnās atbildes reakcijas un samazināja smagumu pēc AKI. Tāpēc šo polimēru izmantošana kā uztura bagātinātājs rada jaunu AKI ārstēšanas stratēģiju

2. Materiāli un metodes

2.1. Materiāli

FOS (vidējā polimerizācijas pakāpe < 10), GOS (vidējā polimerizācijas pakāpe < 8) un FC (vidējā polimerizācijas pakāpe < 5) tika iegūti no Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ASV, Kat. Nr. F8052), attiecīgi Carbosynth (Berkshire, Apvienotā Karaliste, Kat. Nr. OG32134) un Hi-Q Marine Biotech International (Taipeja, Taivāna). Oligosaharīdi tika izšķīdināti divreiz destilētā ūdenī un filtrēti, izmantojot 0,22 µm sterilus filtrus (Merck Millipore, Darmstadt, Vācija). Hialuronāns (HA) un visas pārējās reaģenta kategorijas ķīmiskās vielas tika iegūtas no Sigma. Antivielas pret JNK (sc-7345), fosfo-JNK (sc-6254), MCP-1 (sc-52701), IL-1 (sc{{17) }}), un TNF- (sc-52746) tika iegādāti no Santa Cruz Biotechnology (Dallasa, Teksasa, ASV). Antivielas pret p38 (9212) un fosfo-p38 (9211) tika iegūtas no Cell Signaling Technology (Danvers, MA, ASV). Antivielas pret Ly6G (ab25377) un F4/80 (ab100790) tika iegādātas no Abcam (Kembridža, Apvienotā Karaliste). Antivielas pret HIF-1 (NB100-105) tika iegādātas no uzņēmuma Novus Biologicals (Centennial, CO, ASV).

2.2. Šūnu kultūra

Žurku proksimālās nieru kanāliņu šūnas (NRK-52E) un peles makrofāgu līnija RAW264.7 tika iegādātas no Pārtikas rūpniecības pētniecības un attīstības institūta (Hsinču, Taivāna); kultivēts DMEM, kas papildināts ar antibiotiku/pretsēnīšu šķīdumu un 10% teļa augļa serumu; un tur 37 ◦C un 95% mitrumā CO2 inkubatorā. Pēc 70% saplūšanas sasniegšanas šūnas tika kultivētas barotnē, kas nesatur serumu, un inkubēja nakti pirms eksperimenta. Hipoksijas eksperimentam NRK-52E šūnas un Anaero Pack (Mitsubishi Gas Chemical America, Ņujorka, NY, ASV) tika ievietotas taisnstūrveida burkās (Mitsubishi Gas Chemical America), un visa iekārta tika ievietota 37. ◦C inkubators 4 h. Pēc tam šūnas kultivēja nakti normālos apstākļos.

2.3. Western Blot analīze

Īsumā, katrā joslā tika uzklāts 15 µg NRK-52E proteīna lizāta, un rezultāti tika analizēti ar Western blot. Relatīvie proteīnu joslu līmeņi tika kvantificēti no pieciem neatkarīgiem eksperimentiem, izmantojot Quantiscan programmatūru no Biosoft (Kembridža, Apvienotā Karaliste).

2.4. CD44 īsa traucējoša (si)RNS transfekcija

Žurku CD44 siRNS (4390771) tika iegādāta no Thermo Scientific (Waltham, MA, ASV). Pēc augšanas līdz 70% saplūšanas šūnas tika transficētas ar siRNS, izmantojot Lipofectamine 2000 transfekcijas reaģentu (Thermo Scientific), saskaņā ar ražotāja norādījumiem.

2.5. Šūnu proliferācijas tests

Pēc tam, kad hipoksiskās NRK-52E šūnas tika kultivētas 24 stundas, to pašu barotni izmantoja RAW264.7 šūnu kultivēšanai 96-iedobes plāksnē (2000 šūnas/iedobē). Pēc 24 h inkubācijas RAW264.7 šūnu proliferācija tika analizēta, izmantojot SRB testa komplektu (Abcam, Cat. Nr. ab235935) saskaņā ar ražotāja norādījumiem.

2.6. CD44 antigenitātes testi

Rekombinantā žurku CD44 tika iegūta no R&D Systems (Mineapolisa, MN, ASV, kat. Nr. 6577-CD) un tika izmantota, lai radītu saistīšanās reakciju ar HA saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Īsi sakot, 20 ng / ml rekombinantās žurkas CD44 tika sajauktas ar dažādām FC, FOS vai GOS koncentrācijām 10 minūtes, lai izpētītu oligosaharīdu ietekmi uz CD44 antigenitāti. Maisījumus analizēja, izmantojot CD44 ELISA komplektu (Abcam, Cat. Nr. ab213928) saskaņā ar ražotāja norādījumiem.

2.7. Eksperimentālie dzīvnieki un nieru IRI

Astoņas nedēļas vecas 129S1 / SvImJ peles vīriešu kārtas tika iegādātas no Lasco Technology (Taipeja, Taivāna). Visus eksperimentus ar dzīvniekiem apstiprināja Taipejas Medicīnas universitātes Eksperimentālo dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja (apstiprinājuma Nr. LAC-2019-0511), un tos veidoja NIH Laboratorijas dzīvnieku kopšanas un lietošanas rokasgrāmata. IRI indukcijai pelēm (sver 21–23 g) tika veikta abpusēja nieres kātiņa iespīlēšana 30 minūtes, veicot sānu griezumu [20]. Peles pirms operācijas tika anestēzijas ar inhalācijas anestēziju ar izoflurānu. Ar fiktīvu operāciju pelēm tika veikta līdzīga operācija, izņemot nieru kātiņu saspiešanu. Visas peles tika barotas ar oligosaharīdiem caur mutes zondi no 1 dienas pirms līdz 2 dienām pēc IRI operācijas. Eksperimentālās peles tika sadalītas šādās piecās grupās ar n=8 rezultātiem 3. un 7. dienā: (1) viltus grupa; (2) AKI grupa; (3) AKI grupa, kas barota ar FC (10 mg/kg/dienā); (4) AKI grupa, kas barota ar FOS (10 mg/kg/dienā); un (5) AKI grupa, kas barota ar GOS (10 mg/kg/dienā). Peles tika nogalinātas 3 vai 7 dienas pēc operācijas, un asinis tika savāktas un analizētas, izmantojot bioķīmisko analizatoru un ELISA komplektus. Katras peles kreatinīna līmenis serumā tika analizēts, lai novērtētu AKI attīstību. Nieru morfoloģija tika pārbaudīta ar periodisko skābes-Šifa (PAS) krāsošanu un imūnhistoķīmisko krāsošanu (IHC) formalīnā fiksētās 2 µm parafīna sekcijās.

2.8. Imūnhistoķīmiskā krāsošana

Nieru audi tika fiksēti ar 4% buferētu paraformaldehīdu, iestrādāti parafīnā un sagriezti 2 µm sekcijās, lai iekrāsotu ar UltraVision Quanto Detection System HRP DAB komplektiem (Thermo Scientific, Fremont, CA, ASV) un hibridizētu ar galveno antivielu saskaņā ar ražotāja norādījumiem. .

2.9. PAS krāsošana

Nieru sekcijas tika iekrāsotas ar PAS traipu komplektu (Abcam, Cat. Nr. ab150680) saskaņā ar ražotāja norādījumiem.

2.10. ELISA tests

NRK{0}}E šūnu kultivētā barotne un eksperimentālo peļu seruma paraugi tika savākti un analizēti, izmantojot MCP-1 ELISA komplektu (Abcam, Kat. Nr. ab208979) un IL-1 ELISA komplekts (Abcam, Kat. Nr. ab197742). Seruma paraugus analizēja arī, izmantojot TNF-ELISA komplektu (R&D Systems, kat. Nr. MTA00B) un ar neitrofilu želatināzi saistītā lipokalīna (NGAL) ELISA komplektu (R&D Systems, kat. Nr. MLCN20). ražotāja norādījumus.

2.11. Statistikas testi

Būtiskas atšķirības starp abām grupām tika noteiktas, izmantojot Stjudenta t-testu. Atšķirības tika uzskatītas par nozīmīgām p vērtībām<0.05

3. Rezultāti

3.1. Oligosaharīdi kavē CD44 un citokīnu pieaugumu hipoksiskās NRK-52E šūnās

CD44 ekspresija NRK-52E šūnās, kas apstrādātas ar FC, FOS un GOS, vispirms tika uzraudzīta, lai novērtētu oligosaharīdu ietekmi uz nieru kanāliņu šūnām. Hipoksijas izraisīto CD44 ekspresiju inhibēja visi trīs oligosaharīdi diapazonā 0.05–0,5 mg/ml (1.A attēls). Tāpēc turpmākajos šūnu eksperimentos tika izmantota oligosaharīda deva 0, 1 mg / ml. Sagatavotajā sistēmā hipoksijas ārstēšana ievērojami izraisīja hipoksijas marķiera HIF-1 ekspresiju NRK-52E šūnās, norādot, ka šūnas bija hipoksijas stāvoklī (1.B attēls). Hipoksija palielināja fosforilētā JNK, MCP-1, IL-1 un TNF līmeni, bet ne šūnās, kas apstrādātas ar oligosaharīdiem (1.B, C attēls). JNK ekspresija palielinājās hipoksiskajās šūnās, bet ne ar FC vai FOS apstrādātajās šūnās. GOS neietekmēja JNK ekspresiju hipoksiskajās šūnās, bet nomāca fosforilētā JNK regulēšanu. Tāpēc oligosaharīdi var inhibēt hipoksijas izraisītu JNK signālu transdukciju un citokīnu ekspresiju nieru kanāliņu šūnās. Lai gan FC un GOS pārregulēja p38 hipoksiskajās šūnās, šī proteīna ekspresija nepalielinājās hipoksiskajās šūnās. Šis atklājums norāda, ka p38 nav galvenā loma hipoksijas izraisītās reakcijās NRK-52E šūnās.

3.2. CD44 un JNK ir būtiska loma citokīnu palielināšanā hipoksisko NRK-52E šūnās

CD44, fosforilētā JNK un citokīnu ekspresiju nieru kanāliņu šūnās ietekmēja oligosaharīdi, taču to saistība vēl ir jānoskaidro. Lai izpētītu CD44 lomu JNK signālu transdukcijā un citokīnu ekspresijā hipoksiskās šūnās, NRK-52E šūnas tika transfekētas ar dažādām CD44 siRNS devām. CD44 siRNS pie 50 un 100 PM efektīvi bloķēja hipoksijas izraisītu CD44 ekspresiju un ievērojami kavēja hipoksijas izraisīto fosforilētā JNK, MCP- 1, IL-1 un TNF- līmeņa paaugstināšanos (2.A attēls). CD44 bloķēšanas ietekme uz JNK ekspresiju bija saistīta ar siRNS devām. JNK ekspresiju hipoksiskās šūnās izraisīja CD44 siRNS pie 50 pM, bet inhibēja pie 100 pM. Abas devas nomāca fosforilētā JNK regulēšanu. Selektīvais JNK inhibitors SP600125 būtiski samazināja MCP-1, IL-1 un TNF- ekspresiju hipoksiskās NRK-52E šūnās (2.B attēls). Šie rezultāti liecina, ka CD44 siRNS transfekcijas inhibējošā iedarbība uz hipoksijas izraisītiem citokīniem ir saistīta ar fosforilētā JNK samazināšanos.

1. attēls. Oligosaharīdu inhibējošā ietekme uz CD44 signāla transdukciju hipoksiskās NRK-52E šūnās. Šūnas tika iepriekš apstrādātas ar FC, FOS vai GOS 30 minūtes un pēc tam pakļautas hipoksiskajai kultūrai. Olbaltumvielu ekspresija tika analizēta ar Western blot metodi. (A) No devas atkarīgā oligosaharīdu ietekme uz CD44 ekspresiju. (B) Oligosaharīdu ietekme uz CD{6}}saistītajiem signāliem. Oligosaharīdu koncentrācija tika iestatīta kā 0, 1 mg / ml. Relatīvais olbaltumvielu joslu pieaugums ir parādīts arī joslu diagrammas formā (C). Rezultāti ir izteikti kā vidējais ± SD (n=4).

2. attēls. CD44 un JNK loma hipoksijas izraisītās iekaisuma reakcijās NRK-52E šūnās. Olbaltumvielu ekspresija tika analizēta ar Western blot. (A) CD44 siRNS transfekcijas inhibējošā iedarbība uz fosforilētu JNK un citokīniem. (B) SP600125 inhibējošā iedarbība uz citokīniem. Šūnas tika iepriekš apstrādātas ar 20 µM SP600125 30 minūšu pbeforhipoksijas ārstēšanai. Relatīvais olbaltumvielu joslu pieaugums ir parādīts arī joslu diagrammas formā. Rezultāti ir izteikti kā vidējais ± SD (n=4).

3.3. Hipoksijas izraisīta citokīnu sekrēcija nieru kanāliņu šūnās veicina makrofāgu proliferāciju

Iekaisums ir nieru bojājuma starpnieks AKI gadījumā. Tādējādi tika pārbaudīta oligosača ietekme uz leikocītiem. 3A attēlā parādīts, ka FC, FOS un GOS neietekmēja makrofāgu RAW264.7 šūnu proliferāciju. RAW264.7 šūnu proliferāciju veicināja 24-stundu barotne hipoksiskām NRK-52E šūnām (3.B attēls), bet ne barotne hipoksiskām NRK-52E šūnām, kas apstrādātas ar oligosaharīdi. Pirmajam bija augstāks MCP-1 un IL-1 līmenis nekā otrajam (attēls 3C, D). Visi trīs oligosaharīdi būtiski samazināja MCP-1 un IL-1 hipoksisko NRK-52E šūnu barotnē. Tāpēc FC, FOS un GOS var samazināt citokīnu ekspresiju un sekrēciju hipoksiskās nieru kanāliņu šūnās un līdz ar to mazināt iekaisumu, ko izraisa ievainotas nieru kanāliņu šūnas.