Vistas kaulu kolagēna peptīdu perorāla uzņemšana pret ādas novecošanos pelēm, regulējot kolagēna degradāciju un sintēzi, kavējot iekaisumu un aktivizējot lizosomas 1. daļa

Lūdzu sazinietiesoscar.xiao@wecistanche.comlai iegūtu vairāk informācijas

Abstract:Diētas ietekme uz ādas novecošanos ir kļuvusi par interesantu pētījumu tēmu. Iepriekšējie pētījumi galvenokārt ir vērsti uz no jūras organismiem iegūto kolagēna peptīdu labvēlīgo ietekmi uz novecojošo ādu, ja tos lieto iekšķīgi, savukārt no mājputnu gaļas iegūto kolagēna peptīdu labvēlīgā ietekme uz ādas novecošanos tika ziņots reti. Šajā pētījumā kolagēna peptīdi tika sagatavoti no vistas kaula ar fermentatīvās hidrolīzes palīdzību, un tika pētīta perorāli ievadīto kolagēna peptīdu ietekme un darbības mehānisms, lai mazinātu ādas novecošanos, ko izraisa UV kombinācijā ar D-galaktozi. Rezultāti parādīja, ka vistas kaula kolagēnam bija tipiskas kolagēna īpašības, un vistas kaula kolagēna peptīdi (CP) galvenokārt bija mazi molekulāri peptīdi ar molekulmasu<3000 da.="">cistanche dzīves pagarināšanaIn vivo eksperimenti parādīja, ka KP ir būtiski atslogojoša iedarbība uz ādas novecošanos, par ko liecina izmaiņas novecojošās ādas sastāvā un struktūrā, ādas antioksidantu līmeņa paaugstināšanās un iekaisuma nomākšana; atvieglojošais efekts pozitīvi korelēja ar KP devu. Turpmākā izpēte parādīja, ka CP vispirms samazina ādas oksidācijas līmeni, kavē galvenā transkripcijas faktora AP-1 (c-Jun un c-Fos) ekspresiju, pēc tam aktivizē TGF-/Smad signālu ceļu, lai veicinātu kolagēna sintēzi. , kavē MMP-1/3 ekspresiju, lai kavētu kolagēna noārdīšanos, un kavē ādas iekaisumu, lai atvieglotu ādas novecošanos pelēm. Turklāt ādas transkripts atklāja, ka lizosomas, kas aktivizētas pēc perorālas CP ievadīšanas, var būt svarīgs CP ceļš pret ādas novecošanos, un tas ir turpmāku pētījumu vērts. Šie rezultāti liecināja, ka CP varētu izmantot kā funkcionālu pretnovecošanās uztura sastāvdaļu.

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

Atslēgvārdi:kolagēna peptīdi; pretnovecošanas; ādas transkripts; kolagēna sintēze; lizosomas

1. Ievads

Veselības laikmets, precīza veselīga uztura ievērošana, uztura nozīmes noteikšana ādas novecošanā un izlemšana, ko ēst, lai saglabātu jauneklīgu un veselīgu ādu, ir sarežģītas problēmas. Āda ir lielākais ķermeņa orgāns, kas sastāv no epidermas, dermas un zemādas slāņa. Tas darbojas kā šķērslis, lai aizsargātu ķermeni no ārējiem faktoriem, kā arī ir nozīme veselībā un skaistumā[1]. Ādas novecošanās ir sarežģīts process, kas iedalās hronoloģiskajā novecošanā un fotonovecošanā un ko ietekmē gan iekšējie, gan ārējie faktori. Galvenās īpašības ietver makromolekulāro bojājumu uzkrāšanos šūnā, cilmes šūnu funkcijas samazināšanos (veicinot audu atjaunošanos) un pakāpenisku ādas fiziskās integritātes zudumu [2]. Galvenie molekulārie mehānismi, kas izraisa ādas novecošanos, galvenokārt ietver oksidatīvo stresu, telomēru saīsināšanu, DNS bojājumus, ģenētiskas mutācijas, mikro-RNS regulēšanu, progresīvu glikācijas galaprodukta uzkrāšanos un iekaisuma novecošanos [3]. Fotonovecošanās ir ādas epidermas hiperplāzija, izžūšana un ekstracelulārās matricas degradācija, ko izraisa ultravioletais starojums.cistanche nzGalvenais fotonovecošanās cēlonis ir reaktīvās skābekļa sugas (ROS), ko rada ultravioletais starojums, kas veicina matricas metaloproteināžu (MMP) un I tipa prokolagēna ekspresiju, izmantojot signālu ceļus, piemēram, mitogēnu aktivētās proteīna kināzes (MAPK) signālus. ceļš, tādējādi izraisot ekstracelulārās matricas (ECM) degradāciju ādā un fibroblastu apoptozi [4]. Pēdējos gados ādas veselības saglabāšana un novecošanās aizkavēšana ir kļuvusi populāra, un tādu dabisko sastāvdaļu kā bioaktīvo peptīdu un polifenolu atrašana ar antioksidanta un pretnovecošanās funkcijām ir kļuvusi par pētniecības karsto punktu [5].

Tomēr kolagēnam ir liela molekulmasa, un to ir grūti tieši absorbēt un izmantot, savukārt mazmolekulāriem kolagēna peptīdiem pēc kolagēna hidrolīzes ir spēcīgāka bioloģiskā aktivitāte un augsts absorbcijas ātrums [6]. Tikmēr plašais kolagēna pielietojums pārtikā, medicīnā, audu inženierijā, kosmētikā un citās jomās ir padarījis kolagēna peptīdus ar zemāku molekulmasu, augstāku absorbcijas efektivitāti un spēcīgāku bioloģisko aktivitāti par jaunu iecienītāko funkcionālo pārtiku un medicīnisko izpēti[{{1] }}]. Kolagēna peptīdi ir mazi, satur 2-20 aminoskābju atlikumus, kas iegūti pēc kolagēna hidrolīzes. Tos izmanto kā uztura bagātinātāju ādas novecošanās ārstēšanai, pateicoties to potenciālajai pretiekaisuma un antioksidanta funkcijām un imūnsistēmas regulēšanai, kā arī antioksidācijas un proliferācijas ietekmei uz ādas fibroblastiem [10].

Cistanche var novērst novecošanos

Pēc iekšķīgas lietošanas kolagēna peptīdi uzsūcas mazu peptīdu veidā un ātri tiek transportēti uz asinīm un galu galā uz nierēm, ādu, locītavām un citiem audiem, kas tiek uzglabāti un izmantoti. Pēc 14 dienām radioaktivitātes līmenis saglabājās augsts to peļu ādā, kuras tika barotas ar C14-marķētiem kolagēna peptīdiem. Kolagēna peptīdus organisms var gandrīz pilnībā absorbēt un izmantot, savukārt kolagēna uzsūkšanās un izmantošanas līmenis ir tikai 50-60 procenti [6,11-13]. Pēdējos gados plaši ziņots, ka kolagēna hidrolizātiem no zivju ādas, zivju zvīņām, govs kauliem, govs ādas un cūku ādas ir labvēlīga ietekme uz ādas novecošanās mazināšanu, un pētnieki ir saņēmuši ievērojamu uzmanību. Piemēram, kolagēna peptīdi, kas izolēti no sudrabkarpas ādas, veicina prokolagēna sintēzi un kavē AP-1, MMP-1 un MMP-3 proteīnu ekspresiju, aktivizējot TGF-/Smad ceļu, lai novērstu kolagēna noārdīšanās un fotonovecojušās ādas šūnu atjaunošana [14]. Liellopu kolagēna peptīdu perorāla lietošana var uzlabot ādas relaksāciju, palielināt kolagēna saturu un antioksidantu enzīmu aktivitāti, atjaunot kolagēna šķiedru un normalizēt kolagēna attiecību ādā novecojošām pelēm [15]. Tomēr kolagēna peptīdiem no dažādiem avotiem ir atšķirīga iedarbība. Augsti aktīvo peptīdu daudzums un struktūra asinīs pēc kolagēna peptīdu perorālas lietošanas ir atkarīga no kolagēna avota[10]. No vistu ādas ekstrahētā kolagēna peptīda aizsargājošā iedarbība pret UVA izraisītiem fibroblastu bojājumiem bija labāka nekā kolagēna peptīdam, kas ekstrahēts no cūku, govs vai tilapijas ādas, un tā iedarbība bija līdzvērtīga kolagēna atvasinātajam tripeptīdam (Gly-Pro). -Hyp)[16]. Reliģiskie uzskati un bažas par slimībām (piemēram, govju trakuma slimība) ir likušas cilvēkiem pakāpeniski mainīt kolagēna un tā produktu attīstības virzienu no sauszemes zīdītājiem uz mājputniem un jūras organismiem [17]. Kā galvenais mājputnu pārstrādes blakusprodukts vistas kauls ir daudzsološs kolagēna produktu avots. Tas ne tikai samazina resursu izšķērdēšanu un vides piesārņojumu, bet arī ļauj efektīvi izmantot blakusproduktus. Tāpēc šajā pētījumā mēs izmantojām vistas kaula kolagēna peptīdus kā izejvielas ar kailām pelēm, kas tika apstrādātas ar D-galaktozi un UV, lai izraisītu ādas novecošanos, kā modeli, lai novērtētu kolagēna peptīda perorālās lietošanas ietekmi uz ādas novecošanās mazināšanu. pelēm un noteikt attiecīgo mehānismu.

2. Materiāli un metodes

2.1. Materiāli, ķimikālijas un dzīvnieki

Junaņas Lauksaimniecības universitātes (Kunminga, Ķīna) vistu fermas nodrošināja izlietotās vistas, kuras tika atdalītas, žāvētas un sasmalcinātas, lai iegūtu vistas kaulu miltus. Su-peroksīda dismutāzes (SOD), katalāzes (CAT) un glutationa peroksidāzes (GSH-PX) komplekti tika iegādāti no Soleibao Biotechnology Co., Ltd. (Pekina, Ķīna). Hidroksiprolīns (HYP), interleikīns-1 (IL-1), matricas metaloproteināze-1/3 (MMP-1/3), I tipa prokolagēns un hialuronskābe ( HA) ar enzīmiem saistītie imūntesta (ELISA) komplekti tika iegādāti no Nanjing Jiancheng Bioinženierijas institūta (Nanjing, Ķīna). Veselas BALB/C kailu peļu mātītes (18±2 g, sešas nedēļas vecas) tika iegādātas no Nanjing Junke Bioengineering Corporation, Ltd. (Nanjing, Ķīna) ar atļaujas numuru: SCXK(SU)2016-0010. Pepsīns un papaīns tika iegādāti no Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd. (Šanhaja, Ķīna), un citas ķīmiskās vielas bija analītiskas kvalitātes. Visas peles tika apstrādātas, ievērojot Yunnan provinces laboratorijas dzīvnieku aprūpes noteikumus, un tos apstiprinājusi Yunnan Lauksaimniecības universitātes dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja (apstiprinājuma ID: YAUACUC01).

2.2. Kolagēna preparāts un aminoskābju sastāvs

Vistas kaula kolagēna ekstrakcija un aminoskābju sastāvs sekoja metodei, ko aprakstīja leit. al. [18] ar nelielām izmaiņām. Vistas kaulu pulveris tika maisīts un iemērc 0.05 M NaOH, 10 procenti n-heksāna un 0,25 MEDTA šķīdumā (pH 7,5) plkst. attiecība 1/10 (m/o). Katrā posmā paraugu apstrādāja 36 stundas, un mērcēšanas šķīdums tika mainīts ik pēc 6 stundām, lai uzbriedinātu kaulu pulveri un no kaulu pulvera noņemtu proteīnus, kas nesatur kolagēnu, taukus un minerālvielas. Pēc katras darbības paraugu mazgā ar tīru ūdeni līdz neitralitātei. Iepriekš apstrādātos vistas kaulu miltus sajauca ar 0,5 M ledus etiķskābi, kas satur 0,1 procentu (masa/tilp.) pepsīna, cietā un šķidruma attiecībā 1:10 (w/v) un nepārtraukti maisīja un ekstrahēja 4 grādu temperatūrā. 48 h. Pēc tam to filtrēja un filtrātu centrifugēja ar ātrumu 15,000 × g 15 minūtes 4 grādu temperatūrā.cistanche dzimumlocekļa izmērsSupernatants tika noregulēts uz 7.{1}},8 ar NaOH šķīdumu un tika pievienots NaCl līdz galīgajai koncentrācijai 1,5 M. Pēc tam, kad maisījums 12 stundas tika turēts netraucēts 4 °C temperatūrā, lai izsāļotu, kolagēna nogulsnes tika centrifugētas. 15,000×g 15 minūtes 4 grādu temperatūrā, pēc tam izšķīdināja ar 0,5 M etiķskābi, dializēja tīrā ūdenī, liofilizē, un gatavais produkts bija vistas kaulu kolagēns.

Vistas kaulu kolagēna aminoskābju sastāvs tika noteikts ar Sykam S433D aminoskābju automātisko analizatoru (Minhene, Vācija). Noteikts testējamā kolagēna parauga daudzums tika ņemts noslēgtā mēģenē, pievienots 10mL6 M HCl un 24 stundas hidrolizēts 110 grādu temperatūrā. Hidrolizāts tika koncentrēts ar slāpekļa pūšanu un atkārtoti izšķīdināts 20 ml citronskābes buferšķīdumā. Pēc mikrofiltrēšanas ar 0, 22 μm mikroporainu membrānu aminoskābju spektra analīzei tika ņemts 20 μL hidrolizāts. Aminoskābju saturs paraugā tika izteikts procentos.

2.3. Kolagēna peptīdu (CP) sagatavošana un molekulmasas sadalījums

Saskaņā ar mūsu iepriekšējā optimizācijas procesa rezultātiem CP tika sagatavoti, izmantojot papaīnu ar enzīma un substrāta attiecību 1:4 0 (masas attiecība). Pēc pH noregulēšanas līdz 7 un fermentatīvās hidrolīzes 63 grādos 5 stundas fermentu inaktivēja verdoša ūdens vannā 15 minūtes. Fermenta hidrolizāts tika atsāļots un liofilizēts, atkārtoti izšķīdināts 0,1% skudrskābes šķīdumā un centrifugēts, lai iegūtu supernatantu. AQ Exactive HF Orbitrap augstas izšķirtspējas masas spektrometrs-OE-HF (Thermo Fisher, Waltham, MA, ASV), kas aprīkots ar elektrosmidzināšanas jonizāciju (ESI), tika izmantots, lai analizētu kolagēna hidrolizātu pilnā 350-1800 skenēšanas režīmā. m/z, un rezultāti tika izgūti un analizēti, izmantojot Proteome Discoverer

2.1 programmatūra

2.4.Izmēģinājums ar dzīvniekiem

BALB/bezkrēsla peļu mātītes (n {{0}}) tika turētas telpā kontrolētos temperatūras (24±1 grāds), mitruma (60±5 procenti) un 12 grādi. h dienas-nakts cikls vienu nedēļu. Viņiem tika nodrošināta ad libitum piekļuve pārtikai un ūdenim. Pēc vienas nedēļas adaptācijas peles tika nejauši sadalītas šādās piecās grupās (n =11 katrā grupā): (i). Normāla grupa (N): UV neapstarots; perorāla 0,4 ml fizioloģiskā šķīduma ievadīšana dienā. (ii). Modeļu grupa (M): UV iedarbība plus D-galaktoze (0,2 ml); perorāli ievadot 0,4 ml fizioloģiskā šķīduma dienā. (i). Zemas devas kolagēna peptīdu grupa (LCP): UV iedarbība plus D-galaktoze (0,2 ml); iekšķīgi

0,4 ml KP (deva: 200 mg kg-1 ķermeņa svara) ievadīšana dienā. (iv). Vidējas devas kolagēna peptīdu grupa (MCP): UV iedarbība plus D-galaktoze; mutiski

0,4 ml KP (deva: 500 mg:kg-1 ķermeņa svara) ievadīšana dienā.

(v). Augstas devas kolagēna peptīdu grupa (HCP): UV iedarbība plus D-galaktoze; perorāla 0,4 ml KP (deva: 1000 mg·kg-1 ķermeņa svara) ievadīšana dienā.

Ārstēšana ar D-galaktozi tika veikta, zemādas injekcijas veidā ievadot 0,2 ml 10 procentu D-galaktozes šķīduma peles kakla aizmugurē (deva: 1.0g/ kg-1ķermeņa svara) dienā. UV apstarošana tika veikta ar 40 W UVA-340 LAMPU (O-panelis, Klīvlenda, ASV, maksimālais viļņa garums: 340 nm), attālums starp lampu un peļu aizmuguri bija 30 cm (230 m J/ cm-), un apstarošana ilga 30 minūtes katru dienu septiņas nedēļas (49 dienas). Starojuma intensitāte tika mērīta ar UVA365-radiometru (Xinbao Keyi Electronic Technology Co., Ltd., Siaņa, Ķīna). Vienu stundu pēc D-galaktozes un UV apstrādes pelēm katru dienu iekšķīgi ievadīja 0, 4 ml CP. Pēc pēdējās apstarošanas peles tika anestēzētas, nosvērtas un audu paraugi tika ņemti turpmākai analīzei.

2.5.Ādas mitrums, iekšējo orgānu indekss un ķermeņa masas pieaugums

Ādas mitrums tika noteikts ar ISO 1442, un viscerālais indekss tika aprēķināts, izmantojot šādu vienādojumu: viscerālais indekss (g/kg)=viscerālais svars/ķermeņa svars.

2.6. Oksidācijas stress, HA un HYP saturs ādā

Ādas paraugus homogenizēja ar deviņas reizes lielāku parastā fizioloģiskā šķīduma daudzumu (w/w) ledus vannā ar audu homogenizatoru (TGrinder OSE-Y30, Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Pekina, Ķīna), un pēc tam centrifugēja pie 2000. ×g un 4 grādi 10min. Superoksīda dismutāzes (SOD), katalāzes (CAT), glutationa peroksidāzes (GSH-PX) aktivitātes un hialuronskābes (HA) un hidroksiprolīna (HYP) saturs savāktajā supernatantā tika noteiktas saskaņā ar instrukcijā aprakstīto metodi. atbilst attiecīgajiem komplektiem.

2.7. Ādas histoloģiskais

Peļu ādas paraugi tika fiksēti 4 procentu paraformaldehīda šķīdumā 24 stundas, dehidrēti, iestrādāti parafīnā un sagriezti. Ādas sekcijas tika iekrāsotas ar hematoksilīnu un eozīnu (HE) un novērotas ar ECLIPSE CI-E priekšējās fluorescences mikroskopu (Nikon, Japāna). Ādas epidermas un dermas biezums tika novērtēts, izmantojot programmatūru Halcon 13.{5}}.1.1 (MVTec, Minhene, Vācija).

2.8.Ādas transkripta sekvencēšana

2.8.1. RNS ekstrakcija, bibliotēkas veidošana un transkripta sekvencēšana

Kopējā RNS tika iegūta no peļu ādas, izmantojot RNeasy Mini Kit (Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., Pekina, Ķīna) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. RNS tīrība un koncentrācija tika pārbaudīta, izmantojot kaiaoK5500 spektrofotometru (Kaiao, Pekina, Ķīna); RNS integritāte tika novērtēta, izmantojot RNA Nano 6000 Assay Kit un Bioanalyzer 2100 sistēmu (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ASV). Katra parauga transkripcijas sekvencēšanas analīzi veica Biolinker Technology Company Limited (Kunming, Ķīna).cistanche pulverisĪsumā, indeksu kodēto paraugu grupēšana tika veikta cBot klasteru ģenerēšanas sistēmā, izmantojot HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS (Illumina) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Pēc klasteru ģenerēšanas bibliotēkas tika sekvencētas Illumina platformā, un tika ģenerēti 150 bp pāra gala nolasījumi.

2.8.2. Bioinformātika RNS sekvencēšanas datu analīze

Gēnu ontoloģijas (GO) un Kioto enciklopēdijas gēnu un genomu (KEGG) diferenciāli ekspresētu gēnu (DEG) bagātināšanas analīze tika veikta, izmantojot R valodas klasteru analizatora pakotni. Ja p vērtība bija mazāka par 0.05, GO un KEGG bagātinātie vienumi un ceļi tika uzskatīti par nozīmīgiem.

2.8.3. Reversās transkriptāzes-polimerāzes ķēdes reakcija (qRT-PCR)

QRT-PCR tika veikta, kā aprakstīts iepriekš [19].

2.9. Wester1 Blot

Saskaņā ar Park et al. [20], tika veikta Western blot (WB) analīze, lai kvantitatīvi noteiktu ar ādas novecošanos saistīto proteīnu ekspresiju pelēm. Ādas lizāta olbaltumvielu koncentrācija katrā apstrādes grupā tika kvantitatīvi noteikta, izmantojot BCA komplektu, atdalot ar SDS-PAGE (10% akrilamīda gēlu), pārnesot uz PVDF membrānu, bloķējot ar 5% vājpienu un inkubējot ar atbilstošu primārā daudzuma. antivielas (TGF-b1, c-Fos, c-Jun, Samd2/3 un -aktīns) 4 grādu temperatūrā nakti. Pēc mazgāšanas ar TBST paraugus sajauca ar sekundārajām antivielām un inkubēja istabas temperatūrā 1 stundu. Lai noteiktu specifiskus proteīnus, tika izmantots ChemiDoc XRS plus hemiluminiscences gēla attēlveidotājs (BioRAD, Hercules, CA, ASV). Image] programmatūra tika izmantota, lai kvantitatīvi noteiktu mērķa proteīna ekspresiju katrā ārstēšanas grupā, un rezultāti tika attēloti ar blīvuma vērtībām, kas normalizētas līdz aktīna proteīnam.

2.10.ELISA

MMP-1, MMP-3, I tipa prokolagēna un IL-1 ekspresijas līmeņi ādas līzes šķidrumā tika noteikti ar enzīmu saistītu imūntestu. Pārbaude tika veikta saskaņā ar komplektā iekļautajām instrukcijām.

2.11. Statistiskās analīzes

Visi rezultāti tika analizēti, izmantojot SPSS 21 (IBM Inc., Armonk, NY, ASV) programmatūru, izmantojot vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA) un Dankana vairāku diapazonu testu ar nozīmīguma līmeni, kas iestatīts uz p.<0.05. originpro="" 2017="" (originlab,="" northampton,="" ma,="" usa)was="" used="" to="" plot="" the="" data.="" all="" data="" were="" expressed="" as="" the="" mean="" ±standard="" deviation="">

3. Rezultāti un diskusijas

3.1. Kolagēna aminoskābju sastāvs

Vistas kaulu kolagēna aminoskābju sastāvs ir parādīts 1. tabulā. Gly bija galvenā aminoskābe paraugos, kas veido gandrīz vienu trešdaļu (27.86 procenti ) no kopējām aminoskābēm, un Hyp bija paraugos. īpaša aminoskābe kolagēnā, kas veido 9,83 procentus. Kolagēna molekulu galvenās īpašības bija atkārtotas Gly-XY sekvences un unikālā trīskāršās spirāles struktūra, kas sastāv no trim c ķēdēm. Gly veidoja aptuveni vienu trešdaļu no kopējām aminoskābēm, X un Y bieži bija prolīns un hidroksiprolīns, vai arī tas varēja būt jebkurš atlikums [21]. Parauga aminoskābju sastāvs bija līdzīgs iepriekšējos pētījumos aprakstītajam vistas kaula kolagēna sastāvam, un tam bija raksturīgas kolagēna īpašības [22].

3.2. CP molekulmasas sadalījums

Molecular weight distribution reflects the degree of collagen hydrolysis. The molecular weight of the CPs was mainly below 3000 Da(Figure 1), accounting for about 87.61%of all collagen hydrolysates, indicating that almost all of the CPs were small peptides. Many studies claim that collagen peptides with a lower molecular weight have better biological activity [23]. For example, Song et al. [24]. reported that lower molecular weight (200-1000 Da,65%)silver carp skin collagen peptides repaired UV-induced aging skin in mice more effectively than similar peptides with a higher molecular weight(>1000 Da,72 procenti). Tomēr Vācijas uzņēmums Gelita vairākos klīniskos pētījumos parādīja, ka kolagēna peptīdu iedarbību galvenokārt nosaka to atbilstības pakāpe ar kolagēna peptīdu īpašībām pēc cilvēka kolagēna noārdīšanās, nevis kolagēna peptīdu molekulmasa. Viņi atklāja, ka produktam VERISOL⑧ ar vidējo molekulmasu 2000 Da ir visstimulējošākā iedarbība uz ādas fibroblastiem, savukārt produktam FortigelTM ar vidējo molekulmasu 3000 Da ir īpaša ietekme uz skrimšļa atjaunošanos [25-27].

3.3. Mutes dobuma KP ietekme uz ādas novecošanās mazināšanu

3.3.1. Ķermeņa svars un orgānu indekss

Ķermeņa svara indekss un orgānu indekss ir svarīgi un atspoguļo peļu veselības stāvokli. Peļu svars katrā grupā testa periodā pieauga normāli (2. tabula). M grupas vidējais svara pieaugums bija zemāks nekā N grupā, un CP ārstēšanas grupās bija augstāks nekā M grupā, kas liecina, ka CP nebija blakusparādību uz pelēm. Iepriekšējos ziņojumos ar kolagēna peptīdu ārstētām pelēm deva lielākoties bija starp 100-1000 mg/kg.bw·d, un tilapijas kolagēna peptīdu drošā deva sasniedza 4,07 g/kg.bw·d [{{6} }].cistanche salsas ekstrakts Similarly, the growth of skin-aged mice after gavage with tilapia scale collagen peptides (dose: 500 and 1000 mg/kg.bw·d)was also similar to our results [29]. The spleen plays an important role in humoral and cellular immunity, thus, the spleen index is often used to evaluate immune system function. The liver index was used to evaluate the toxicity of the tested sample. In these tests, the liver and spleen indices in the M group were lower than those in the N group, and both recovered after treatment with CPs, but there was no significant difference across the treatment groups(p>0.05). Rezultāti bija līdzīgi iepriekšējo pētījumu rezultātiem [30], norādot, ka CP ir droši un var nedaudz uzlabot peļu imunitāti.

3.3.2. Ādas sastāvs

UV un D-galaktozes apstrāde (M grupa) ievērojami samazināja mitruma, HA un Hyp saturu ādā, salīdzinot ar grupu, attiecīgi par 13,36 procentiem, 24,08 procentiem un 15,83 procentiem (p<0.05)(table 2).the="" contents="" of="" moisture,="" ha,="" and="" hyp="" in="" the="" skin="" were="" significantly="" higher="" in="" mice="" after="" the="" oral="" administration="" of="" cps="" compared="" to="" the="" contents="" of="" those="" in="" the="" mice="" of="" the="" m="" group=""><0.05). among="" the="" dose="" groups,="" the="" contents="" of="" the="" three="" skin="" components="" were="" significantly="" different="" between="" the="" lcp="" and="" hcp="" groups="" and="" were="" dependent="" on="" the="" dose="" of="" intake="" of="" cps.="" the="" hcp="" group="" had="" even="" higher="" contents="" than="" the="" n="" group,="" and="" ha="" and="" hyp="" were="" significantly="" different="" between="" the="" two="" groups="" (p=""><>

Ādas mitruma satura izmaiņas izraisa grumbas un ādas nokarāšanos, un tās ietekmē matricas komponenti, piemēram, ādas kolagēns un HA[31]. Hidroksiprolīns ir stabila, bagāta un īpaša kolagēna aminoskābe, un tās saturs var netieši atspoguļot kolagēna saturu ādā, kā arī ādas novecošanos. Turklāt HA, kas ir ļoti izteikta ādas ECM, spēlē svarīgu lomu ādas ūdens bilances, osmotiskā spiediena, mitruma saglabāšanas un elastības kontrolēšanā kā ūdens uzkrāšanas sistēmai un ādas strukturālajai sastāvdaļai [32]. Šajā pētījumā mitruma, HYP un HA saturs ādā ievērojami palielinājās pēc CP uzņemšanas, kas varētu būt saistīts ar kolagēna un HA sintēzes veicināšanu ar CP. Turklāt HYP un HA palielināšanās palielināja mitruma saturu.

3.3.3. Ādas histoloģiskās izmaiņas

Histoloģiskās izmaiņas peļu muguras ādā pēc septiņu nedēļu nepārtrauktas ārstēšanas ir parādītas 2. M grupas novecojošajai ādai, salīdzinot ar N grupas ādu, bija raupjas virsmas, sabiezinātas epidermas, retinātas dermas un retu šūnu īpašības. Tomēr novecojošās ādas stāvoklis pelēm uzlabojās pēc perorālas CP ievadīšanas, saglabājot gludu, sakārtotu un pilnīgu struktūru, kas līdzīga N grupas pelēm. Tādējādi ādas derma bija ievērojami plānāka, un epiderma bija ievērojami biezāka M grupā nekā N grupā (p<0.05). the="" change="" in="" skin="" dermis="" and="" epidermal="" thickness="" was="" significantly="" better="" after="" treatment="" with=""><0.05), and="" the="" effect="" was="" more="" obvious="" with="" the="" increase="" in="" the="" dose="" of="" cps="" (figure="" 2).="" the="" effect="" of="" oral="" cps="" on="" the="" histological="" structure="" of="" aging="" skin="" was="" similar="" to="" that="" reported="" previously[4,28,31].="" the="" increase="" in="" the="" thickness="" of="" the="" epidermis="" might="" be="" an="" adaptive="" change="" to="" protect="" the="" skin="" from="" external="" stimuli,="" loss="" of="" skin="" moisture,="" and="" uv="" damage,="" possibly="" due="" to="" the="" increase="" in="" uv-activated="" epidermal="" growth="" factor="" receptor="" (egfr)="" that="" induces="" keratinocyte="" proliferation="" and="" epidermal="" hyperplasia[4].="" however,="" the="" mechanism="" by="" which="" oral="" cps="" alleviate="" the="" increase="" in="" epidermal="" thickness="" remains="" unclear.="" the="" dermis="" imparts="" elasticity="" and="" strength="" to="" the="" skin,="" and="" the="" degradation="" of="" ecm="" and="" the="" reduction="" in="" the="" ability="" to="" repair="" fibroblasts="" are="" the="" main="" causes="" of="" dermal="" thinning="" in="" aging="" skin.="" dermal="" thickness="" increased="" after="" the="" treatment="" with="" cps,="" which="" might="" be="" due="" to="" the="" removal="" of="" ros="" from="" the="" skin="" and="" inhibition="" of="" the="" increase="" of="" mmps="" by="" cps.="" this,="" in="" turn,="" inhibited="" the="" degradation="" of="" skin="" collagen="" and="" elastin="" (figure="" 3),="" the="" entry="" of="" cps="" into="" the="" skin,="" and="" their="" participation="" in="" the="" synthesis="" of="" collagen="" and="" ha="" [6],="" which="" was="" confirmed="" by="" the="" increase="" in="" the="" content="" of="" hyp="" and="" ha="" in="" the="" skin="" (table="">

3.3.4. Ādas antioksidantu un iekaisuma līmenis

Antioksidantu enzīmu aktivitātes noteikšana ir visbiežāk izmantotā metode, lai novērtētu antioksidantu līmeni organismā [28]. Kā parādīts 3. attēlā, CAT, SOD, GSH-Px un MDA satura aktivitātes M grupā bija ievērojami zemākas nekā N grupā (p<0.05). administering="" cps="" effectively="" inhibited="" the="" decrease="" of="" cat,="" sod,="" gsh-px="" activities,="" and="" the="" mda="" content="" in="" the="" skin="" of="" mice,="" compared="" to="" those="" in="" the="" mice="" skin="" of="" the="" m="" group,and="" was="" positively="" correlated="" with="" the="" dose="" of="" cps;="" there="" were="" significant="" differences="" among="" the="" different="" dose="" groups=""><0.05). when="" ros,="" accumulated="" by="" skin="" oxidative="" stress,="" exceed="" the="" antioxidant="" defense="" ability="" of="" the="" body,="" they="" destroy="" the="" ecm,="" which="" is="" the="" key="" cause="" of="" skin="" aging.="" ros="" can="" cause="" the="" oxidation="" of="" lipids="" and="" proteins="" in="" the="" skin,="" resulting="" in="" fibroblast="" degeneration="" and="" changes="" in="" the="" skin.="" ros="" activates="" the="" mapk="" signaling="" pathway="" and="" the="" ap-1="" protein="" to="" upregulate="" the="" expression="" of="" mmps="" and="" promote="" the="" degradation="" of="" matrix="" collagen="" [21].="" although="" the="" antioxidant="" enzymes="" and="" antioxidants="" in="" the="" body="" can="" remove="" ros="" to="" protect="" the="" skin="" from="" damage,="" when="" the="" content="" of="" rosexceeds="" the="" defense="" (antioxidant)="" ability="" of="" the="" body="" or="" the="" body's="" defense="" ability="" declines,="" it="" causes="" oxidative="" stress="" and="" skin="">

Turklāt ROS izraisītā šūnu iekaisuma reakcija arī veicina ādas novecošanos. Pēc apstrādes ar UV un D-galaktozi (M grupa) IL-1 saturs peļu ādā ievērojami palielinājās, salīdzinot ar N grupā (3D attēls), norādot, ka āda uzrādīja nozīmīgu iekaisuma reakciju. (lpp<0.05). the="" cps="" significantly="" reduced="" the="" content="" of="" il-1α="" in="" the="" skin="" in="" a="" dose-dependent="" manner,="" compared="" to="" that="" in="" the="" skin="" of="" mice="" in="" the="" m="" group.="" there="" was="" a="" significant="" difference="" between="" hcps="" and="" lcps=""><0.05), indicating="" that="" cps="" alleviated="" skin="" inflammation.="" the="" o2="" produced="" by="" ultraviolet="" irradiation="" stimulated="" the="" expression="" of="" mmp-1="" in="" dermal="" fibroblasts="" through="" the="" secretion="" of="" il-1α="" and="" il-6,="" thereby="" disrupting="" the="" ecm="" [33].="" therefore,="" this="" study="" suggested="" that="" cps="" significantly="" increased="" the="" activity="" of="" skin="" antioxidant="" enzymes="" and="" inhibited="" inflammatory="" responses,="" which="" might="" be="" important="" in="" delaying="" skin="" aging="" in="">

3.4. Uztura KP darbības mehānisms ādas novecošanās mazināšanai

3.4.1.RNS-Seq datu analīze un validācija

Analysis techniques, such as PCA, HCA, gene GO enrichment, and KEGG pathway enrichment were used to analyze the transcriptome data. Based on the PCA analysis (Figure 4A)and hierarchical clustering analysis (heat map)of 4303 differential genes with average channel strength greater than 100, the relative expression levels of total DEGs between the two treatment groups are shown to provide an overview of the changes in gene expression(Figure 4B).The M group and the HCP group were significantly separated, and the expression patterns of most DEGs in the M and HCP groups were opposite, indicating that there were significant differences between the mouse skin after HCP treatment and the M group(Figure 4A,B).Pairwise comparisons showed that after feeding HCPs, 4303 genes were significantly expressed in the mice's skin, including 1790 upregulated genes and 2513 downregulated genes(Foldchange>2,p<0.05)(figure 4c).among="" the="" six="" genes="" associated="" with="" skin="" aging="" quantified="" by="" qrt-pcr,="" five="" genes(including="" fos,="" jun,="" cxcl1,="" and="" egr1)were="" downregulated,="" and="" one="" gene="" was="" upregulated(figure="" 4d),="" which="" was="" consistent="" with="" the="" overall="" trend="" of="" transcriptomic="" data.="" the="" rna="" expression="" levels="" of="" fos,="" jun,="" and="" cxcll="" were="" significantly="" upregulated="" in="" damaged="" skin="" compared="" to="" that="" in="" intact="" skin="" [34],="" and="" inhibition="" of="" egr1="" expression="" alleviated="" skin="" inflammation="" [35].="" these="" results="" reflected="" the="" reliability="" of="" transcriptome="" sequencing="" data,="" and="" oral="" cps="" effectively="" alleviated="" skin="">

bagātināšanas analīze un KEGG datu bāzes bagātināšanas analīze sniedza atbalstu turpmākai DEG bioloģisko funkciju izpētei. GO analīze parādīja, ka DEG ir ievērojami bagātināti tādos bioloģiskos procesos kā DNS replikācija, hemopoēzes regulēšana, hidrolāzes aktivitātes regulēšana un citokīnu ražošana; šūnu komponentos, kas ietvēra lītisko vakuolu un lizosomu, kolagēnu saturošie un citi saistītie gēni bija ievērojami bagātināti; molekulārās funkcijas ziņā receptoru-ligandu aktivitāte, citokīnu aktivitāte un citi saistītie gēni bija ievērojami bagātināti (5. attēls). Pirmo 20 signālu ceļu KEGG bagātināšanas analīze, ko būtiski mainīja DEG, ir parādīta 5. attēlā. Citokīnu-receptoru mijiedarbība, lizosomu, neiroaktīvo ligandu-receptoru mijiedarbība, šūnu cikls, sistēmiskā sarkanā vilkēde un TGF-ceļš (p<0.05)were closely="" related="" to="" aging,="" especially="" cytokine-receptor="" interactions,="" lysosomes,="" and="" tgf-βsignaling.="" an="" important="" feature="" of="" cellular="" senescence="" is="" the="" accumulation="" of="" damaged="" organelles="" and="" protein="" aggregates.="" lysosomes="" play="" an="" important="" role="" in="" degrading="" damaged="" organelles="" and="" protein="" aggregates="" in="" senescent="" cells="" [36].="" cytokine-receptor="" interaction="" is="" the="" main="" pathway="" of="" enrichment="" in="" the="" skin="" after="" being="" affected="" by="" various="" factors="" such="" as="" inflammation="" [37],="" sulfur="" mustard="" exposure="" [38],="" and="" terahertz="" pulse="" [39].="" cytokines,="" as="" small="" molecular="" proteins="" synthesized="" and="" secreted="" by="" various="" tissue="" cells,="" maintain="" skin="" homeostasis="" by="" controlling="" the="" balance="" between="" keratinocyte="" proliferation,="" differentiation,="" and="" apoptosis="" through="" complex="" interactions="" with="" growth="" factors="" [40].="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" is="" also="" important="" for="" regulating="" skin="" aging="" [14].="" gene="" functional="" enrichment="" analysis="" showed="" that="" tgf-β="" was="" highly="" expressed="" during="" cytokine-receptor="" interaction="" and="" in="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway.="" tgf-β="" is="" a="" major="" pro-fibrotic="" cytokine="" that="" regulates="" cell="" differentiation="" and="" proliferation="" while="" inducing="" extracellular="" matrix="" protein="" synthesis="" [41.="" therefore,="" we="" verified="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" and="" some="">

3.4.2. CP darbības mehānisma pārbaude ādas novecošanās mazināšanā

Lai pārbaudītu TGF-signalizācijas ceļa un citokīnu-receptoru mijiedarbības lomu ādas novecošanās mazināšanā ar mutes dobuma CP, tika veikta WB analīze, lai pārbaudītu TGF- un transkripcijas faktoru Smad2/3 TGF-signalizācijas ceļā, kā arī galveno. transkripcijas faktors AP-1(c-Fos un c-Jun), kas regulē citokīnus. MMP-1, MMP-3, I tipa prokolagēna un I-1 saturs tika noteikts ar ELISA. WB analīzes rezultāti parādīja, ka TGF-, Smad2 un Smad3 ekspresija M grupā bija ievērojami zemāka nekā N grupā (p<0.05). the="" expression="" levels="" of="" tgf-β="" and="" smad3="" were="" significantly="" higher="" in="" mice="" after="" the="" oral="" administration="" of="" cps="" compared="" to="" their="" levels="" in="" group="" m="" mice;="" additionally,="" smad2="" also="" increased="" significantly=""><0.05), except="" for="" in="" the="" lcps="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (figure="" 6).="" on="" the="" contrary,="" the="" expression="" of="" c-fos="" and="" c-jun="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" n="" group.="" the="" expression="" of="" c-fos="" and="" c-jun="" in="" the="" cp="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" in="" the="" m="" group,="" except="" for="" the="" expression="" of="" c-jun="" in="" the="" lcp=""><0.05), and="" the="" change="" was="" dose-dependent.="" these="" results="" indicated="" that="" the="" tgf-β="" signaling="" pathway="" was="" activated="" and="" ap-1="" was="" inhibited="" after="" feeding="">

AP-1 proteīns ir Jun un Fos ģimenes proteīnu dimērisks komplekss un ir svarīgs ādas iekaisuma un citokīnu ekspresijas regulators. Parasti kompleksam, kas sastāv no c-Jun un c-Fos, ir visaugstākā transkripcijas aktivitāte ādā [41, A42]. ROS, kas rodas novecojošās ādas šūnās, vispirms aktivizē AP-1 proteīnu un pēc tam regulē pakārtotos citokīnus (piemēram, IL-1), MMP un TGF-signalizācijas ceļu caur transkripciju un translāciju, tādējādi veicinot ādas novecošanos [43] ,44]. TGF-/Smad signalizācijas reakcija ir klasisks kolagēna sintēzes ceļš, un Smad transkripcijas faktors ir šī signāla transdukcijas ceļa pamatā. TGF- izraisa pakārtoto Smad2 un Smad3 fosforilāciju un aktivāciju, saistoties ar receptoru, tādējādi palielinot COLI sintēzi [14].

Turklāt ELISA rezultāti parādīja, ka MMP-1, MMP-3 un IL-l saturs M grupas ādā bija ievērojami augstāks nekā N grupā, un tipa saturs. Man bija ievērojami zemāks prokolagēna līmenis (lpp<0.05). however,="" the="" contents="" of="" mmp-1,="" mmp-3,="" and="" il-1α(figure="" 3d)in="" the="" skin="" after="" oral="" administration="" of="" cps="" were="" significantly="" lower="" than="" those="" in="" the="" m="" group="" (p=""><0.05); type="" i="" pro-collagen="" increased="" significantly,="" and="" all="" the="" changes="" were="" dose-dependent="" with="" cps="" (figure="" 7).="" mmps="" are="" involved="" in="" the="" decomposition="" of="" skin="" collagen,="" il-1α="" shows="" the="" level="" of="" inflammation="" of="" the="" skin,="" and="" type="" i="" pro-collagen="" reflects="" the="" synthesis="" of="" skin="" collagen.="" accumulating="" evidence="" suggests="" that="" the="" role="" of="" the="" jun/ap-1="" protein="" pathway="" has="" also="" been="" proposed="" to="" regulate="" skin="" inflammation="" [40].="" the="" elisa="" results="" showed="" that="" the="" combined="" treatment="" of="" uv="" and="" d-galactose="" caused="" skin="" collagen="" degradation,="" decreased="" collagen="" synthesis,="" and="" caused="" skin="" inflammation,="" leading="" to="" skin="" aging.="" however,="" these="" changes="" were="" reversed="" after="" the="" oral="" administration="" of="">

Papildus iepriekšminētajiem ceļiem šajā pētījumā augšregulētie gēni pēc CP ārstēšanas tika ievērojami bagātināti lizosomu ceļā, norādot, ka CP ārstēšana aktivizēja lizosomu ādā (5. attēls). Iepriekšējie pētījumi liecina, ka aktivētās lizosomas attīra agregātus un paaugstina novecojošo nervu cilmes šūnu aktivāciju novecošanas laikā [45]. Papildus tiem palielinātā lizosomu funkcija var samazināt intracelulārās ROS koncentrāciju, lai novērstu šūnu miegainību. Tāpat jebkura lizosomu funkcijas samazināšanās var uzlabot intracelulāro ROS koncentrāciju, kas galu galā veicina šūnu miegainību [46]. Lai gan mēs to neesam sistemātiski pārbaudījuši šajā dokumentā, šie rezultāti un iepriekšējie ziņojumi liecina, ka lizosomu funkcijas aktivizēšana var būt galvenais veids, kā CP mazināt ādas novecošanos, un mēs turpināsim censties to pārbaudīt.

Tāpēc šis pētījums parādīja, ka uztura CP var mazināt ādas novecošanos, ko izraisa UV un D-galaktoze atkarībā no devas. CP atvieglo ādas novecošanos, pazeminot ādas oksidācijas līmeni, kavējot galveno transkripcijas faktoru AP-1 (c-Jun un c-Fos) ekspresiju, aktivizējot TGF-/Smad signālu ceļu, lai veicinātu kolagēna sintēzi, kavējot MMP-1 un MMP-3 (kas kavē kolagēna noārdīšanos) un kavē ādas iekaisumu, lai mazinātu ādas novecošanos (8. attēls). Turklāt mūsu atklājumi pašreizējā

4. Secinājumi

Kopumā šis pētījums apstiprināja, ka vistas kaulu kolagēna peptīdu papildināšana ar uzturu var ievērojami atvieglot ultravioletā starojuma un D-galaktozes izraisīto ādas novecošanos, izmantojot vairākus ceļus, tostarp veicinot prokolagēna sintēzi, kavējot kolagēna noārdīšanos, uzlabojot ādas antioksidantu līmeni un kavējot. iekaisums; atvieglojums bija atkarīgs no devas ar CP. Detalizēta izpēte parādīja, ka CP vispirms samazina ādas oksidācijas līmeni, kavē galvenā transkripcijas faktora AP-1 (c-Jun un c-Fos) ekspresiju un pēc tam aktivizē TGF-/Smad signalizācijas ceļu, lai veicinātu. kolagēna sintēzi, kavē MMP-1 un MMP-3 ekspresiju, lai kavētu kolagēna noārdīšanos, un kavē ādas iekaisumu, lai atvieglotu ādas novecošanos pelēm. Turklāt lizosomu aktivizēšana var būt arī galvenais CP ceļš, lai mazinātu ādas novecošanos, kas ir turpmākas izpētes un pārbaudes vērts. Šie rezultāti sniedz teorētisku pamatu kolagēna peptīdu ieviešanai, lai mazinātu ādas novecošanos un paplašinātu dzīvnieku izcelsmes blakusproduktu visaptverošas izmantošanas iespējas funkcionālos pārtikas produktos.

Autora ieguldījums: CC izstrādāja, izmērīja un uzrakstīja manuskriptu; ZXand HT izstrādāja un pārskatīja manuskriptu; YLnodrošināti metodiskie norādījumi; CGand YW pārskatīja manuskriptu. Visi autori ir izlasījuši un piekrituši publicētajai manuskripta versijai.

Šis raksts ir izvilkts no Nutrients 2022, 14, 1622. https://doi.org/10.3390/nu14081622 https://www.mdpi.com/journal/nutrients