Dažu pēdējo desmitgažu laikā zinātnieki ir sasnieguši ievērojamu progresu veselības uzlabošanā un dzīves ilguma pagarināšanā

Lūdzu sazinietiesoscar.xiao@wecistanche.comlai iegūtu vairāk informācijas

IEVADS

Lēcu epitēlija šūnas (LEC) veido šūnu monoslāni, kas pārklāj lēcas priekšējo kapsulu un sniedzas līdz lēcas priekšgalam [1, 2]. Normāla LEC uzbūve un darbība ir būtiska, lai saglabātu visa objektīva caurspīdīgumu un vielmaiņas homeostāzi[3]. Arvien vairāk pierādījumu liecina, ka LEC novecošanās var izraisīt lēcas proteīnu, tostarp enzīmu un kristalīnu, modifikāciju, denaturāciju un agregāciju, tādējādi galu galā izraisot lēcas apduļķošanos vai pat kataraktu [3-5]. Ar vecumu saistītā katarakta (ARC) joprojām ir galvenais redzes traucējumu un akluma cēlonis, kas nopietni ietekmē vecāku cilvēku dzīves kvalitāti [6]. Pašlaik nav efektīvu stratēģiju ARC progresēšanas novēršanai. Tāpēc ir nepieciešams izstrādāt farmakoloģisko iejaukšanos, kas var uzlabot lēcas caurspīdīgumu un aizkavēt ARC progresēšanu.

Pēdējo desmitgažu laikā zinātnieki ir sasnieguši ievērojamu progresu veselības uzlabošanā un dzīves ilguma pagarināšanā, izmantojot vairākas ģenētiskas, uztura un farmakoloģiskas iejaukšanās [7]. Metformīns (MET) ir viens no plaši pētītajiem pretnovecošanās līdzekļiem. Būtiski pētījumi liecina, ka MET var atvieglot novecošanos un pagarināt veselīgu dzīves ilgumu dažādās dzīvnieku modeļu sistēmās. MET var ne tikai pagarināt Caenorhabditis elegans dzīves ilgumu, bet arī uzlabot tā veselību un vitalitāti [8]. MET var samazināt ar vecumu saistītu un ar oksidatīvo stresu saistīto DNS bojājumu uzkrāšanos Drosophila viduszarnu cilmes šūnās, lai pagarinātu to dzīves ilgumu [9]. Iepriekšējie pētījumi arī liecina, ka hroniska mazu devu MET lietošana uzlabo peļu veselību un mūža ilgumu [10]. Turklāt jauni pierādījumi liecina, ka, ja pacienti ar cukura diabētu tiek ārstēti ar MET, viņiem ir izdzīvošanas priekšrocības, pat salīdzinot ar kontroles grupām, kurām nav diabēta [11].

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

Papildus MET dzīves ilgumu veicinošajai aktivitātei dažādos modeļu organismos, MET ir vērsta uz vairākiem šūnu signālu pārnešanas ceļiem, lai uzlabotu ar vecumu saistītas slimības. Ir pierādīts, ka MET modulē autofagiju galvenokārt ar adenozīna monofosfāta (AMP) aktivētās proteīnkināzes (AMPK) aktivācijas palīdzību un novērš neirodeģenerāciju un neiroiekaisumus, kam ir neiroprotektīva loma Parkinsona slimībā [12]. Tāpat MET uzlabo ar vecumu saistītās izmaiņas aknu sinusoidālajā endotēlija šūnā, izmantojot AMPK un endotēlija slāpekļa oksīda ceļus [13].cistanche dosage redditTurklāt hroniska AMPK aktivācija ar MET novērš kardiomiopātiju, regulējot autofagiju OVE26 pelēm ar cukura diabētu [14]. Turklāt MET atvieglo ar vecumu saistītu sirds un asinsvadu sistēmas pasliktināšanos, uzlabojot autofagiju un kaloriju ierobežojumus [15]. Turklāt MET ārstēšana var kavēt ar vecumu saistītu aterosklerozi ApoE-7-pelēm un trušiem, ko izraisa augsta tauku satura diēta, ievērojami novēršot aterosklerozes aplikuma pārkaļķošanos, samazinot augstas jutības C reaktīvā proteīna līmeni un apspiežot kodolfaktora kappa B(NF-kB) ceļš asinsvados [16-18].

Pamatojoties uz šiem novērojumiem, šajā pētījumā tika mēģināts izpētīt, vai MET var aizkavēt ARC novecošanos un pamatā esošo molekulāro mehānismu. Mūsu atklājumi ir šādi: (i) hroniska zemu devu MET ārstēšana aizkavēja LEC novecošanos dabiski vecām pelēm, tādējādi kavējot lēcu necaurredzamību; (i) AMPK ceļš tika inaktivēts, un novecojošās LEC tika traucēta autofagiskā plūsma; (i) ) hroniska zemu devu MET ārstēšana aizkavēja LEC novecošanos dabiski vecām pelēm, aktivizējot AMPK ceļu un uzlabojot autofagiju. Mūsu atklājumi pamato MET iespējamo pretnovecošanās lomu un sniedz pietiekamus pierādījumus tam, ka MET var izrādīties iespējama ARC terapeitiskā iespēja.

REZULTĀTI

LEC novecošanās bija saistīta ar ARC dabiski vecām pelēm

Ir plaši pētīti vairāki iespējamie ARC mehānismi, tostarp novecošanās ietekme.cistanche ekstrakta priekšrocības,Tomēr saistība starp LEC novecošanos un ARC in vivo joprojām nav skaidra. Mēs izvirzījām hipotēzi, ka LEC novecošanās var izraisīt ARC in vivo. Tāpēc mēs izveidojām ARC peles modeli. Mūsu rezultāti atklāja, ka lēcas caurspīdīgums dabiski vecām pelēm (vecākām pelēm) bija ievērojami samazināts, salīdzinot ar kontroles grupu (jaunām pelēm) (1.a attēls). Kā parādīts 1.b attēlā, kataraktas sastopamība dabiskā vecuma grupā bija 95,23 procenti. H&E krāsošanas tests liecināja, ka kontroles grupas LEC bija apaļas formas un sakārtotas regulāri, un parasto LEC blīvums bija salīdzinoši augsts, turpretim dabiski veco peļu LEC bija plakanas formas un izvietotas nevienmērīgi, un novecojošie LEC bija ievērojami samazināti (1.c att.). Turklāt SA- -Gal krāsošana parādīja, ka novecojošo LEC attiecība bija paaugstināta dabiski vecām pelēm (1.d attēls). Turklāt mēs analizējām ar novecošanos saistīto marķieru proteīnu ekspresiju, izmantojot IHC krāsošanu un Western blot analīzi. IHC krāsošana atklāja, ka p21 un p53 ekspresija ir palielināta dabiski vecu peļu LEC, salīdzinot ar jaunām pelēm (1.e, f att.). Tāpat mēs atklājām, ka p21 un p53 proteīna ekspresija bija augstāka dabiski vecu peļu lēcu kapsulās nekā jaunu peļu lēcu kapsulās (1.g attēls). Šie rezultāti liecināja, ka LEC novecošanās bija saistīta ar ARC dabiski vecām pelēm.

Cistanche var novērst novecošanos

Hroniska mazas MET devas ievadīšana uzlaboja lēcas caurspīdīgumu un atviegloja LEC novecošanos. Pirms metformīna ietekmes uz ARC testēšanas mēs noskaidrojām, vai hroniska mazas devas MET ievadīšana ir droša pelēm. Pēc 10 mēnešu ārstēšanas ar MET 28 peles (18 dabiskā vecuma grupā un 10 MET grupā) nomira no dabīgiem cēloņiem. Mēs noskaidrojām, ka dzīvās peles abās grupās bija veselas, un starp abām grupām nebija būtiskas atšķirības starp ķermeņa svaru un orgānu svaru (1. Tādēļ šie rezultāti liecināja, ka pētījumā izmantotā metformīna deva dzīvniekiem bija droša un to var izmantot turpmākajos eksperimentos.

Pēc tam tika ievadīta hroniska zemas devas MET, lai novērtētu, vai MET var kavēt lēcu necaurredzamību un atvieglot ar vecumu saistītu LEC novecošanos dabiski vecām pelēm. Kā gaidīts, objektīva caurspīdīgums MET grupā tika ievērojami uzlabots, salīdzinot ar lēcas caurspīdīgumu dabiski veco cilvēku grupā (2.a attēls). Turklāt morfoloģiskie novērojumi apstiprināja, ka MET grupas lēca uzrādīja necaurredzamības samazināšanos. Kataraktas biežums dabiskā vecuma grupā bija 95,23 procenti, savukārt MET grupā – 19.00 procenti (2.b attēls). H&E krāsošanas tests atklāja, ka LEC blīvums MET grupā bija ievērojami augstāks. nekā dabīgi vecām pelēm (2.c attēls). Turklāt MET grupas LEC bija salīdzinoši apaļas formas, salīdzinot ar dabiski veco grupu LEC (2.c att.). SA- -Gal krāsošana parādīja, ka novecojošo LEC attiecība bija ievērojami samazināta MET grupā, salīdzinot ar dabisko vecuma grupu (2.d attēls). IHC analīze atklāja, ka p21 un p53 ekspresija bija vairāk samazināta MET grupas LEC nekā dabiskajā vecumā (2e, f att.). Tāpat Western blot analīze atklāja, ka p21 un p53 proteīna ekspresija bija ievērojami samazināta MET grupas lēcu kapsulās, salīdzinot ar dabiski veco grupu (2.g att.). Šie rezultāti liecināja, ka hroniska zemu devu MET ievadīšana var uzlabot objektīva caurspīdīgumu un atvieglot LEC novecošanos.

Hroniska mazas MET devas ievadīšana mazināja LEC novecošanos dabiski vecām pelēm, aktivizējot AMPK. Milzīgs datu daudzums apstiprina secinājumu, ka AMPK aktivizēšana ir pietiekama, lai pagarinātu paraugorganismu dzīves ilgumu, palielinot tā pievilcību kā ilgmūžības mērķi [19,20] . Ņemot vērā šo teoriju, mēs novērtējām AMPK ceļa izpausmi peļu LEC. Relatīvais FAS mRNS līmenis tika samazināts dabiski vecumā un paaugstināts MET grupā (3.a attēls). Kā parādīts 3b, c attēlā, fosforilētā AMKa (Thr172) un fosforilētā ACC (Ser79) ekspresija tika samazināta dabiski vecu peļu LEC, salīdzinot ar jaunām pelēm. Tomēr fosforilētā AMKa (Thr172) un fosforilētā ACC (Ser79) ekspresija bija paaugstināta MET grupas LEC, salīdzinot ar dabiski veco grupu. Turklāt Western blot analīze atklāja, ka fosforilētā AMKa (Thr172) un fosforilētā ACC (Ser79) proteīna ekspresija tika ievērojami samazināta dabiski vecu cilvēku lēcu kapsulās, kā arī fosforilētā AMKa (Thr172) un ACC (fosforilēta) proteīna ekspresijas līmenis. Ser79) palielinājās MET grupas lēcu kapsulās (3.d attēls). Šie dati atklāja, ka AMPK ceļš tika inaktivēts dabiski vecu peļu LEC. Turklāt hroniska mazu devu MET ievadīšana mazināja LEC novecošanos dabiski vecām pelēm, aktivizējot AMPK.

Hroniska mazas MET devas ievadīšana atjaunoja autofagisko plūsmu, lai atvieglotu LEC novecošanos dabiski vecām pelēm Iepriekšējie pētījumi liecina, ka autofagijai var būt svarīga loma cīņā pret novecošanās nelabvēlīgajām sekām [21,22]. Lai turpinātu analizēt molekulārās un šūnu izmaiņas objektīvā pēc MET apstrādes, mēs noteicām LC3 un p62 ekspresiju, jo tie ir plaši pieņemti kā autofagijas līmeņa biomarķieri. Kā parādīts 4.a attēlā, relatīvais p62 mRNS ekspresijas līmenis bija ievērojami paaugstināts dabiskā vecuma grupā, salīdzinot ar kontroles grupu; tomēr p62 relatīvais mRNS ekspresijas līmenis bija ievērojami pazemināts MET grupā, salīdzinot ar dabisko vecumu grupā.Cistanče ČingishhansTurklāt IHC krāsošana atklāja, ka ar mikrotubuliem saistītā proteīna 1 vieglās ķēdes 3 (LC3-II/l) un p62 līmenis tika paaugstināts dabiski vecu peļu LEC. Turklāt mūsu rezultāti parādīja, ka LC3-II/l un p62 līmenis bija ievērojami pazemināts MET grupas LEC (4.b, c attēls). LC3-ll un p62 proteīna līmenis bija ievērojami paaugstināts dabiskā vecuma grupas lēcu kapsulās (4.d attēls). Kopumā mēs spekulējām, ka dabiski vecu peļu LEC ir traucēta autofagiskā plūsma, un to var atjaunot, hroniski ievadot zemas devas MET, lai atvieglotu LEC novecošanos dabiski vecām pelēm.

DISKUSIJA

Neārstēta katarakta ir galvenais akluma cēlonis visā pasaulē, ko raksturo kristāliskās lēcas apduļķošanās [23]. Epidemioloģiskie pētījumi ir parādījuši, ka vecums ir dominējošais kataraktas riska faktors, kas pazīstams kā ARC, un vienīgā ārstēšana ir ķirurģiska noņemšana [24]. Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka LEC novecošanās ir galvenais ARC cēlonis [25]. Līdz šim nav bijuši efektīvi terapeitiski līdzekļi, kas kavētu lēcas duļķainību un mazinātu LEC novecošanos bez nevēlamām blakusparādībām. Šī pētījuma mērķis bija novērtēt LEC novecošanās molekulāri bioloģisko pamatu un normālu LEC aizsardzības mehānismu pret novecošanos. Mūsu rezultāti atklāja, ka AMPK inaktivācija un autofagijas traucējumi bija saistīti ar LEC un ARC novecošanos. Turklāt mēs noskaidrojām, ka MET var aizsargāt LEC pret novecošanos un kavēt objektīva duļķainību, aktivizējot AMPK un uzlabojot autofagiju.

Novecošanās ir fundamentāls bioloģisks process, ko pavada vispārēja audu funkcijas samazināšanās. Palielinoties dzīves ilgumam, ar vecumu saistītas disfunkcijas, piemēram, ARC, kļūst par nopietnu veselību

jautājumi [26]. Ir ziņots, ka LEC novecošanās ir saistīta ar ARC rašanos un attīstību [5]. Mūsu rezultāti atklāja, ka dabiski veco peļu LEC bija plakanas formas un izkārtotas nevienmērīgi, un LEC blīvums ievērojami samazinājās (1.c, d attēls). Turklāt ar novecošanos saistīto gēnu (p21 un p53) ekspresija tika regulēta dabiski veco peļu LEC (1.e, f, g att.). Mūsu rezultāti liecināja, ka LEC novecošanās bija saistīta ar ARC rašanos un attīstību. Tāpēc, lai nodrošinātu jaunu ārstēšanas stratēģiju pamatojumu, var būt nepieciešama precīza izpratne par molekulārajiem mehānismiem, kas ir LEC novecošanās pamatā.

MET ir pasaulē visplašāk izrakstītais perorālais hipoglikemizējošs līdzeklis 2. tipa diabēta ārstēšanai. Jaunie pierādījumi liecina, ka MET labvēlīgi ietekmē veselību, kas nav saistīta ar glikēmijas uzlabošanos [27]. Ir apstiprināts, ka MET mehānismi ir svarīgi, lai mērķētu uz fundamentāliem bioloģiskās novecošanas ceļiem, piemēram, AMPK aktivizēšanu, autofagijas palielināšanu, iekaisuma kavēšanu un antioksidantu iedarbību [28]. Cilvēkiem MET klīniskajā praksē izmanto vairāk nekā 60 gadus; tai ir augsts drošības profils, un tas ir unikāls, lai iejauktos vairākos būtiskos veidos, kas ir atbildīgi par novecošanu un ar vecumu saistītām slimībām. Tomēr nekad nav ziņots par MET ietekmi uz ARC un šīs ietekmes regulēšanas mehānismu. Līdz ar to mūsu pētījumā hroniska mazas MET devas ievadīšana dabiski vecām pelēm uzlaboja lēcas caurspīdīgumu (2.a att.) un mazināja LEC novecošanos in vivo (2. att.).

Ir plaši atzīts, ka MET aktivizē AMPK ceļu, kas ir potenciāls MET mehānisms, lai radītu pretnovecošanās efektu [29]. AMPK, šūnu enerģijas sensoram, ir izšķiroša loma šūnu enerģijas bilances regulēšanā [30]. Vairāki pētījumi ir parādījuši, ka AMPK kalpo kā vairāku ceļu un procesu integrators un starpnieks, kas enerģētiku saista ar ilgmūžību. Mūsu pētījumā mēs noskaidrojām, ka AMPK inaktivācija bija novecojošu LEC pazīme dabiski vecām pelēm (3. att.). Pēc tam tika pierādīts, ka MET stimulē AMPK ceļu, lai novērstu LEC novecošanos (3. att.). Kā zināms AMPK aktivators, MET loma novecošanās novēršanā parasti tiek attiecināta uz tā ietekmi uz pakārtoto signalizācijas ceļu modulēšanu, piemēram, autofagijas atjaunošanu, Sirt1 un Foxo1 aktivizēšanu un mTOR nomākšanu [31, 32]. Mūsu pētījums sniedza jaunu pierādījumu līniju, uzsverot MET aktivizētās AMPK funkcijas nozīmi ARC rašanās novēršanā.

Kā minēts iepriekš, AMPK sazinās ar daudziem ceļiem un olbaltumvielām, lai radītu anti-novecošanās efektu, tostarp autofagijas palielināšanu. Autofagija, kas kļūst par ilgmūžības nodrošināšanas pamatprocesu, ir izraisījusi plašu interesi kā potenciāls terapeitiskais mērķis ar vecumu saistītām slimībām. Autofagija ir šķidrs, daudzpakāpju sarežģīts bioloģisks process. Pilnu autofagijas procesu sauc par autofagisko plūsmu, ko plaši izmanto, lai atspoguļotu autofagijas līmeni. Kā autofagijas indikators LC3-Il ir cieši saistīts ar autofagosomu membrānu, ko noārda lizosomu enzīmi.cistanche dzīves pagarināšanaTāpat p62, autofagijai specifisks substrāts, parasti tiek degradēts autofagolizosomā, un tā ekspresija netieši atspoguļo autofagijas līmeni. Šajā pētījumā mūsu atklājumi liecināja, ka novecojošos LEC autofagijas līmenis izteikti pazeminājās (4. att.), savukārt MET mainīja ar vecumu saistītos autofagijas traucējumus (4. att.). MET pretnovecošanās molekulārais mehānisms ir saistīts ar AMPK primāro funkciju šūnās, jo tas parasti uzlabo autofagiju, aktivizējot AMPK [33]. Turklāt ir pierādīts, ka MET tieši palielina autofagiju, tādējādi veicinot novecošanās novēršanu [34]. Tomēr ir nepieciešami sīkāki pētījumi, lai noskaidrotu pamatā esošos mehānismus, pierādot, ka MET palielina autofagiju, izmantojot neatkarīgu vai atkarīgu AMPK ceļu.

Ir pierādīts, ka Āzijas izcelsmes populācijās ARC izplatība nav saistīta ar dzimumu [35, 36]. Tāpēc mēs neuzskatījām seksu par faktoru, kas var ietekmēt ARC. Mūsu pētījums ir jāinterpretē, ņemot vērā iepriekš minētos ierobežojumus.

SECINĀJUMS

Rezumējot, mēs pierādījām, ka AMPK ceļa inaktivācija un ar vecumu saistīti autofagijas traucējumi var veicināt LEC novecošanos un ARC rašanos. Turklāt mūsu eksperimentu dati atklāja, ka MET efektīvi aizkavēja LEC novecošanos un ARC veidošanos, aktivizējot AMPK ceļu un pastiprinot autofagiju. Mūsu atklājumi ir pamatlīnija turpmākai molekulāro mehānismu izpētei, kas ir noderīgi MET lomā ARC novecošanas procesā, un tie būs informatīvi intensīvākiem pētījumiem par jaunu stratēģiju izstrādi pret ARC rašanos un attīstību.

MATERIĀLI UN METODES Reaģenti

MET tika iegādāts no Bristol-Myers Squibb Company (Ķīna). Antivielas pret p21 (ab188224), p53 (ab131442), fosforilētu AMKa(p-AMPK)(Thr172)(ab133448), AMPKa1(ab32047), -2actin (ab32047), -2 SQSTM1/p62 (3340-1) tika iegūti no Abcam (MA, ASV). Antivielas pret LC3 (12741) un fosfoacetil-CoA karboksilāzi (p-ACC) (Ser79) (3661) tika iegādātas no Cell Signaling Technology ( MA, ASV).

Dzīvnieki un ārstēšana

C57BL6J peļu tēviņi, kas bija 3 un 8 mēnešus veci, tika iegādāti no Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd. (Pekina, Ķīna). Peles tika izmitinātas kontrolētos temperatūras (temperatūra, 20-25 grādi un relatīvais mitrums, 55±15 procenti) apstākļos ar 12 stundu gaismas/tumsas ciklu, ar brīvu piekļuvi pārtikai un ūdenim. Visas procedūras un protokolus, kas tika veikti ar dzīvniekiem, apstiprināja Harbinas Medicīnas universitātes ētikas komiteja.

Peles tika sadalītas šādās trīs grupās:(i) kontroles grupa, kurā jaunas peles (3 mēnešus vecas, ķermeņa masa =29.72±1,66 g, n =40) saņēma standarta attīrītu peļu diētu un ūdeni. ad libitum; Kad peles bija 1 0 mēnešus vecas, 120 peles tika nejauši sadalītas divās grupās: dabiskā vecuma grupā un MET grupā. (i) dabiskā vecuma grupa (vecākas peles, 20 mēnešus vecas, ķermeņa masa =32.98±1,93 g, n=60) saņēma standarta attīrītu peļu diētu un ūdeni ad libitum;(ii)MET grupa ( 20 mēnešus vecas, ķermeņa svars =31.21±2,81 g,n=60) tika uzturēts ar standarta attīrītu peles diētu un ūdeni, līdz peles sasniedza 10 mēnešu vecumu; pēc tam tika uzsākta ārstēšana. Peles MET grupā 10 mēnešus tika brīvi barotas ar diētu, kas papildināta ar 0,1% MET (Bristol Myers Squibb, Ķīna) un ūdeni.

lēcu un lēcu kapsulu izolācija

Peles tika eitanāzētas, izmantojot dzemdes kakla dislokāciju. Visa acs nekavējoties tika izgriezta no visiem eksperimentālajiem dzīvniekiem un ievietota sterilā fizioloģiskā šķīdumā. Redzes nervs tika novietots uz augšu un fiksēts ar pinceti. Pēc tam uz redzes nerva, kas iekļūst acī, tika veikts iegriezums, un sklēra tika atvilkta, lai atklātu lēcu.cistanche nzPēc tam mēs izmantojām pinceti, lai uzmanīgi noņemtu ciliārā ķermeņa fragmentus, kas piestiprināti objektīva ekvatoriālajai plaknei. Nekavējoties tika uzņemti svaigā objektīva fotoattēli, un objektīvs ātri tika fiksēts ar 4% paraformaldehīdu istabas temperatūrā. Visas lēcas kapsulas tika ātri noņemtas no atlikušās lēcas, sasaldētas šķidrā slāpeklī un uzglabātas 80 ° C temperatūrā turpmākajiem eksperimentiem.

Hematoksilīns un eozīns (H&E)

Svaiga lēca tika nekavējoties fiksēta ar 4% paraformaldehīdu istabas temperatūrā un iestrādāta parafīnā. Histoloģiskai izmeklēšanai audi tika sagriezti 4- μm šķēlēs. Pēc deparafinēšanas un rehidratācijas sagatavotās parafīna sekcijas tika iekrāsotas ar hematoksilīna (H) šķīdumu 8 minūtes, kam sekoja 5 iegremdēšana 1% skābā etanolā (1% HCI 70% etanolā).

un skalošana ar destilētu ūdeni. Pēc tam sekcijas 3 minūtes iekrāsoja ar eozīna (E) šķīdumu, kam sekoja dehidratācija ar šķirotu spirtu un notīrīšana ar ksilolu. Morfoloģiskās izmaiņas tika novērotas mikroskopā (Nikon, Eclipse, Japāna).

Ar novecošanos saistītās -galaktozidāzes (SA- -Gal) tests Ar novecošanos saistītās -galaktozidāzes (SA- -Gal) aktivitāte tika noteikta, izmantojot SA- -Gal krāsošanas komplektu (Sigma, CS{). {12}}030). Saskaņā ar ražotāja norādījumiem audu sekcijas pēc vairākām apstrādēm tika mazgātas ar fosfātu buferšķīdumu (PBS) 5 minūtes (trīs reizes) un pēc tam inkubētas SA- -gal krāsošanas šķīdumā (pH 6,0) 37 grādi bez CO2 24 stundas. Attēli tika uzņemti gaismas mikroskopā (Nikon, Eclipse, Japāna). SA- -gal-pozitīvo šūnu procentuālais daudzums tika aprēķināts kā vidējais pozitīvo šūnu skaits/vidējais kopējais šūnu skaits.

Kvantitatīvā reālā laika polimerāzes ķēdes reakcija (gRT-PCR) Kopējā RNS no peļu lēcu kapsulām tika ekstrahēta, izmantojot TRlzol reaģentu. Reversā transkripcija tika veikta ar ExScript RT reaģentu komplektu (Invitrogen). Kvantitatīvā reversās transkripcijas-polimerāzes ķēdes reakcijas (qRT-PCR) analīze tika veikta, izmantojot SYBR Green Supermix.

komplekts (Takara, Tokija, Japāna), ar -aktīnu kā endogēnu kontroli. Transkripcijas tika pētītas vairākiem mērķa gēniem, tostarp FAS (uz priekšu, 5'-TTGCTGGCACTACAGAATGC-3' un reverse, 5'-AACAGCC TCAGAGCGACAAT-3'), p62 (uz priekšu, 5'-GGCGCACTACCGCGATGAGGA-3' 10}} un reverss,5'-TGTTCCCGCCGGCACTCCTT-3') un -aktīns (uz priekšu, 5'-TCGTGGGCCGCCCTAGGCAC-3'un reverss,5'-TGGCCTTAGGGTTC AGGGGGG-3' relatīvais). bija katra gēna ekspresijas līmeņi

metodi. normalizēts līdz -aktīnam un aprēķināts, izmantojot 2-△△ct r imūnhistoķīmisko (IHC) krāsošanu. Imūnhistoķīmiskajai (IHC) analīzei tika izmantotas kopā 5 reprezentatīvās sekcijas no katras no 10 atlasītajām lēcām katrā grupā. lai novērtētu p21, p53, p-AMPK, p-ACC, LC3 un p62 ekspresiju. Pēc tam, kad sagatavotie paraugi tika inkubēti 60 grādu temperatūrā 2 stundas, tie tika izlaisti cauri ksilola un spirta sērijām deparafinēšanai. Pēc tam paraugus 30 minūtes vārīja 0,1 M citronskābē (pH 6,1) un atdzesēja līdz istabas temperatūrai. Pēc trīs reizes mazgāšanas ar PBS, paraugus iemērc ar 0, 3 procentiem H O, lai inhibētu endogēno peroksidāzes aktivitāti. Pēc tam pievienoja primārās antivielas un nakti atdzesēja 4 °C temperatūrā. Atbilstošās sekundārās antivielas tika inkubētas 1 stundu 37 °C temperatūrā. Pēc mazgāšanas ar PBS paraugus inkubēja diaminobenzidīnā (DAB), līdz izveidojās vēlamā traipu intensitāte. Imūnkrāsoto šūnu attēli tika uzņemti, izmantojot Nikon Eclipse mikroskopu (Nikon, Eclipse, Japāna).

Western blot analīze

Kopējais proteīns no peļu lēcu kapsulām tika ekstrahēts, izmantojot radioimunoprecipitācijas testa (RIPA) buferi ar proteāzes inhibitoru kokteili (Pierce, ASV), un proteīna koncentrācijas kvantitatīvai noteikšanai tika izmantots bicinhonīnskābes (BCA) komplekts (Thermo Fisher Scientific, ASV). . Kopējais proteīns (40 µg) tika analizēts, izmantojot nātrija dodecilsulfāta-poliakrilamīda gēla elektroforēzi (SDS-PAGE) un elektroforētiski pārnests uz polivinilidēna difluorīda filtra (PVDF) membrānām (Millipore, Vācija). Membrānas inkubēja nakti ar primāro antivielu 4 ° C temperatūrā. Nākamajā dienā membrānas inkubēja ar atbilstošām sekundārajām antivielām 1 stundu 37 ° C temperatūrā. Imunoreaktīvās joslas tika vizualizētas, izmantojot hemiluminiscējošā substrāta metodi ar Super Signal West Pico. komplekts (Pierce Biotechnology, ASV). Tika veikti trīs neatkarīgi eksperimenti.

Statistiskā analīze

Dati tika izteikti kā vidējā ± standartnovirze (SD). Statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot GraphPad Prism 7.{1}} programmatūru un Microsoft Excel. Olbaltumvielu daudzums tika noteikts, izmantojot Image J programmatūru. Lai aprēķinātu eksperimentālo datu statistisko nozīmīgumu, tika izmantots Stjudenta t-tests un dispersijas analīze (ANOVA). Atšķirības ar P vērtību<0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" all="" experiments="" were="" repeated="" independently="" at="" least="" three="">

DATU PIEEJAMĪBA

Šajā publicētajā rakstā ir iekļautas pašreizējā pētījuma laikā izmantotās un analizētās datu kopas.

Šis raksts ir iegūts no www.nature.com/cddiscovery