1. daļa:Acteoside neitralizē interleikīna-1β izraisītus kataboliskos procesus, modulējot mitogēna aktivizētas proteīnkināzes un NFκB šūnu signalizācijas ceļu

Acteoside neitralizē interleikīna-1β-inducētos kataboliskos procesus, izmantojot mitogēna aktivēto proteīnu kināžu modulāciju un NFκB šūnu signalizācijas ceļu

HyangI Lim ,1 Do Kyung Kim ,1 Tae-Hyeon Kim ,1 Kyeong-Rok Kang ,1 Jeong-Yeon Seo ,1,2 Seung Sik Cho ,3 Younghee Yun ,4,5 Ye-yong Choi ,4,5 Jungtae Leem ,4,5 Hyoun-Woo Kim ,6 Geon-Ung Jo ,6

Chan-Jin Oh ,6 Deuk-Sil Oh ,6 Hong-Sung Chun ,2 un Jae-Sung Kim 1

Kontaktpersonu:joanna.jia@wecistanche.com

1 Zobārstniecības zinātnes institūts, Chosun Universitāte, Gwangju 61452, Korejas Republika

2 Biomedicīnas zinātnes departamenti, Chosun Universitāte, Gwangju 61452, Korejas Republika

3 Biomedicīnas, veselības un dzīvības konverģences zinātņu departaments, BK21 Four, Farmācijas koledža, Mokpo Nacionālā universitāte,

Jeonnam 58554, Korejas Republika

4Chung-Yeon Medicīnas institūts, Gwangju 61949, Korejas Republika

5Pētniecības un attīstības institūts, CY Pharma Co., Seula 06224, Korejas Republika

6Jeollanamdo Meža resursu institūts, Naju, Jeollanamdo, 58213, Korejas Republika

Sarakste jāadresē Jae-Sung Kim; js_kim@chosun.ac.kr

Saņemts 2020. gada 2. jūlijā; pārskatīts 2021. gada 15. februārī; Pieņemts 2021. gada 6. martā; Publicēts 2021. gada 25. martā

Akadēmiskais redaktors: Joël R. Drevet

Autortiesības © 2021 HyangI Lim et al. Šis ir atvērtās piekļuves raksts, kas tiek izplatīts saskaņā ar CreativeCommonsAttributionLicense,

kas pieļauj neierobežotu izmantošanu, izplatīšanu,un reproducēšana jebkurā nesējā, ja oriģināldarbs ir pareizi citēts.

cistanche var ārstēt nieru slimību uzlabot nieru darbību

Osteoartrīts (OA) ir visbiežāk sastopamā deģeneratīvā locītavu slimība ar hroniskām locītavu sāpēm, ko izraisa progresējoša locītavu skrimšļa deģenerācija sinoviālajās locītavās.Acteoside, kas ir kofeoilfeniletanoīds glikozīds, ir dažādas bioloģiskas aktivitātes, piemēram, pretmikrobu, pretiekaisuma, pretvēža, antioksidatīvs, citoprotektīvs un neiroprotektīvs efekts. Turklāt perorālaacteosidelielā devā neizraisa genotoksicitāti. Tāpēc šā pētījuma mērķis ir pārbaudīt antikatabolisko iedarbību, ko rada:acteosidepret osteoartrītu un tā antikatabolisko signalizācijas ceļu.Acteosidenemazināja peļu fibroblastu L929 šūnu, ko lieto kā normālas šūnas un primārus žurku hondrocītus, dzīvotspēju.Acteosideneitralizēja IL-1β izraisīto proteoglikāna zudumu hondrocītos un locītavu skrimšļos, nomācot skrimšļa noārdīšanās enzīmu, piemēram, matricas metalloproteināzes(MMP-) 13, MMP-1 un MMP-3, ekspresiju un aktivāciju. Turklātacteosidenomāc iekaisuma mediatoru, piemēram, inducējamā slāpekļa oksīda sintāze, ciklooksigenāzes-2, slāpekļa oksīda un prostaglandīna E2 ekspresiju primārajos žurku hondrocītos, kas ārstēti ar IL-1β. Pēc tam proinflammējošo citokīnu ekspresija tika samazināta paracteosideprimārajos žurku hondrocītos, kas ārstēti ar IL-1β. Turklāt acteozīds nomāca ne tikai mitogēnu aktivēto proteīnkināžu fosforilāciju primārajos žurku hondrocītos, kas ārstēti ar IL-1β, bet arī NFκB translokāciju no citozola uz kodolu, nomācot tā fosforilāciju. Perorāla 5 un 10mg/kg acteoside lietošana vājināja progresējošu locītavu skrimšļa deģenerāciju osteoartrītiskās peles modelī, ko radīja mediālā meniska destabilizācija. Mūsu atklājumi liecina, ka acteoside ir daudzsološs potenciāls antikatabolisks līdzeklis vai papildinājums, lai vājinātu vai novērstu progresējošu locītavu skrimšļa deģenerāciju.

Pls noklikšķiniet šeit uz 2. daļu

1. Ievads

Osteoartrīts (OA) ir visbiežāk sastopamā deģeneratīvā locītavu slimība ar hroniskām locītavu sāpēm, ko izraisa progresējoša locītavu skrimšļa deģenerācija sinoviālajās locītavās [1].

Paredzamā mūža ilguma palielināšanās dēļ tiek lēsts, ka OA izplatība ar mobilitātes zudumu un hroniskām locītavu sāpēm, ko izraisa progresējoša locītavu skrimšļa deģenerācija sinoviālajās locītavās, ir attiecīgi 18% un 9,6% sievietēm pēc menopauzes un vīriešiem [2]. Lai gan OA izplatība pasaulē katru gadu palielinās, OA patofizioloģiskā etioloģija joprojām nav zināma. To var izraisīt ļoti sarežģīti un daudzfaktoru riska faktori, piemēram, novecošanās, dzimums, ģenētiskais mantojums, traumatisks locītavu ievainojums un smaga mehāniskā locītavu slodze. Turklāt neiro- patoloģiskās attiecības starp progresējošu locītavu skrimšļa deģenerāciju un hronisku locītavu sāpju attīstību nav zināmas [3]. Tādējādi klīniskās vadības mērķis pacientiem ar OA ir ķermeņa mobilitātes un mehāniskās locītavu funkcijas uzturēšana, atbrīvojoties no hroniskām locītavu sāpēm, izmantojot farmakoloģiskas un nefarmakoloģiskas pieejas un locītavu aizvietošanas operāciju. Pieaug pieprasījums pēc efektīvas iejaukšanās vai papildināšanas attīstības ar ilgtermiņa bioloģisko drošību, lai novērstu vai vājinātu OA, lai saglabātu dzīves kvalitāti, saglabājot mehānisko locītavu funkciju vecāka gadagājuma cilvēkiem.

Kā parādīts 1. attēlā,acteoside(CAS Nr. 61276-17-3; C29H36O15) ir kofeoilfeniletanoīds glikozīds, kas izolēts no vairākiem augu augiem, piemēram, Verbascum hlorīdiem [4], Buddleja globosa [5] un Plantago australis [6]. Acteoide ir dažādas bioloģiskas aktivitātes, piemēram, pretmikrobu līdzeklis [5], pretiekaisuma līdzeklis [7], pretvēža līdzeklis [8], antioksidatīvs [9], citoprotektīvs [9] un neiroprotektīvs efekts [10]. Turklāt perorālaacteosidelielā devā neizraisa genotoksicitāti[11].

Tādējādi mēs izvirzījām hipotēzi, ka acteozīdam ar pretiekaisuma bioloģisko drošību ir antikataboliska iedarbība, kas saistīta ar locītavu skrimšļa aizsardzību pret progresējošu locītavu skrimšļa deģenerāciju, nomācot kataboliskos faktorus, piemēram, proinflammējošos citokīnus, iekaisuma mediatorus un skrimšļus noārdošos fermentus sinoviālajās locītavās. Tāpēc šī pētījuma mērķis bija izpētītacteoside-inducēta antikataboliska iedarbība un tās šūnu signalizācijas ceļš gan in vitro, izmantojot primāros hondrocītus, kas izolēti no žurku ceļa locītavas locītavu skrimšļa, gan in vivo, izmantojot OA dzīvnieku modeli, ko rada mediālā meniska ķirurģiska destabilizācija peļu ceļa locītavā.

acteosidepiemēram,cistancheVarUzlabotImunitāte

2. Metodes

2.1. Šūnu kultūra.

Primārie žurku hondrocīti tika izolēti no žurku (5 dienu vecuma) locītavu skrimšļa; Sprague–Daw- ley) ceļa locītavas saskaņā ar protokolu (CIA- CUC2019-A0027), ko apstiprinājusi Chosun Universitātes Institucionālā dzīvnieku aprūpes un izmantošanas komiteja, Gwangju, Korejas Republika. Izolēti primārie žurku hondrocīti tika uzturēti Dulbecco modificētajā ērgļa vidējā/barības vielu maisījumā F-12 (DMEM/F12) (Thermo Scientific, Rock- ford, IL, USA), kas papildināti ar 10% augļa liellopu serumu (FBS) (Life Technologies, Grand Island, NY, ASV), antibiotikām (50U/ml penicilīna un 50μg/ml streptomicīna) un 50μg/ml askorbīnskābes. Parastā peļu fibroblasta L-929 šūnu līnija tika iegādāta no American Type Culture Collection (ATCC). Saskaņā ar ATCC sniegtajiem norādījumiem L-929 šūnas tika kultivētas Ērgļa minimālajā būtiskajā barotnē, kas satur 10% FBS, un tika audzētas mitrinātā inkubatorā 37 ° C temperatūrā ar 5% CO2.

2.2. Šūnu dzīvotspējas pārbaude.

Dimetiltiazolildifeniltrizolija sāls (MTT) pārbaude tika veikta, lai novērtētu peļu fibroblastu šūnu līnijas L929 šūnu, ko izmanto kā normālu šūnu, un primāro žurku hondrocītu, kas ārstēti ar acteozīdu, vispēju. Īsumā L929 šūnas un primārie žurku hondrocīti tika kultivēti ar šūnu blīvumu 8×105 šūnas/ml kultūras plāksnēs 24 stundas un pēc tam apstrādāti ar 2,5, 5, 10, 25, 50 un 100μMacteosidepar 24h. Pēc ārstēšanas ar MTT šķīdumu gan L929 šūnas, gan hondrocīti tika tālāk kultivēti 4h. Pēc inkubācijas veidotie MTT kristāli tika pilnībā suspendēti dimetilsulfoksīdā un izmērīti, lai absorbētu pie 570 nm, izmantojot spektrometru (Epoch mikroplates spektrofotometrs, BioTek®, Winooski, VT, ASV), lai novērtētu šūnu dzīvotspēju.

2.3. Šūnu dzīvs/miris tests.

Šūnu izdzīvošana tika veikta, izmantojot Cell Live/Dead testa komplektu (Molekulārās zondes, Carlsbad, CA, ASV), kas sastāv no zaļā kalceīna-AM dzīvu šūnu marķēšanai (ar zaļu fluorescenci) un etīdija homodimera-1 atmirušo šūnu marķēšanai (ar sarkanu fluorescenci). Īsumā, gan L929 šūnas, gan primārie žurku hondrocīti tika kultivēti ar šūnu blīvumu 8×105 šūnas/ml uz kameras slaidiem (Nunc® Lab-Tek® Chamber Slide™ sistēma; Sigma- Aldrihs; Merck KGaA) 24h un pēc tam apstrādāt ar 50 un 100μM acteoside 24h. Pēc audzēšanas tika veikts šūnu izdzīvošanas tests saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Pēc tam iekrāsotās šūnas tika attēlotas, izmantojot fluorescences mikroskopu (Eclipse TE200; Nikon Instruments, Melville, Ņujorka).

2.4. Dimetilmetilēnzilā (DMMB) pārbaude.

DMMB pārbaude tika veikta, lai novērtētu proteoglikāna satura izmaiņas primārajos žurku hondrocītos, kas 21 dienu ārstēti ar aktieozīdu IL-1β klātbūtnē vai bez tā. Lai saglabātu primāro žurku hondrocītu īpašības 21 dienu, primārie žurku hondrocīti (2×106 šūnas) tika suspendēti 1 ml 1,2% algināta un pēc tam iekapsulēti, pilinot šūnu/algināta suspensiju 105 mm CaCl2 šķīdumā. Primārie žurku hondrocīti, kas iekapsulēti alginātā, tika kultivēti 24h DMEM/F12 (kas satur 10% FBS, 50U/ml penicilīna, 50μg/ml streptomicīna un 50 μg/ml askorbīnskābes) un pēc tam 24h pielāgoti DMEM/F12, kas satur 1% mini-insulīna–transferīna–selēna (mini-ITS) un 50 μg/ml askorbīnskābes. Pēc tam hondrocīti tika ārstēti ar 50 vai 100μMacteoside1ng/ml IL-1β klātbūtnē vai prombūtnē 21 dienu. 21. dienā tika savākti primārie žurku hondrocīti proteoglikāna satura novērtēšanai, izmantojot DMMB testu, kā aprakstīts iepriekš [12]. Turklāt, lai kvantitatīvi noteiktu proteoglikāna saturu uz vienu šūnu un novērtētu primāro žurku hondrocītu proliferāciju, šūnu skaits tika mērīts ar DNS testu, izmantojot PicoGreen (molekulārās zondes, Karlsbādu, CA), saskaņā ar ražotāja norādījumiem. 10ng/ml IL-1β klātbūtne vai neesamība 7 dienas. Kultūras perioda beigās paraugi tika savākti un fiksēti 4% paraformaldehīda 72h histoloģiskai analīzei.

2.6. Histoloģiskā analīze.

Tika veikta histoloģiskā analīze, izmantojot safranīnu-O, un ātra zaļa krāsošana, lai pārbaudītu proteoglikāna zudumu locītavu skrimšļos, kas 7 dienas apstrādāti ar 100μM aktieozīdu 10ng/ml IL-1β klātbūtnē vai bez tā. Īsumā, fiksētie locītavu skrimšļa paraugi tika atkaļķoti etilēndiamīntetraetiķskābes veidā un pēc tam iestrādāti parafīnā. Pēc tam sagatavotie parafīna bloki, kas satur locītavu skrimšļus, tika sērijveidā sagriezti šķēlēs līdz 5 μm biezumam un novietoti uz priekšmetstikliņiem. Pēc tam tika veikta safranīna-O un ātra zaļa krāsošana, lai novērtētu proteo- glikāna zudumu locītavu skrimšļa zemes vielā. Turklāt tika veikta hematoksilīna un eozīna krāsošana, lai novērotu locītavu skrimšļa vispārējo morfoloģiju.

2.7. Rietumu blotēšana.

Rietumu blotēšana tika veikta, lai izpētītu katabolisko faktoru, tostarp MMP-13, MMP-1, MMP-3, inducējamās slāpekļa oksīda sintāzes (iNOS) un ciklooksigenāzes-2 (COX-2) ekspresiju un šūnu signālmolekulu, piemēram, mitogēna aktivēto proteīnu kināžu un kodolfaktora-kappa B (NFκB), izmaiņas. Īsumā žurku primārie hondrocīti tika ārstēti ar 50 vai 100 μM aktieozīdu 10ng/ml IL-1β klātbūtnē vai neesamībā 24 stundu laikā. Pēc tam žurku primārie hondrocīti tika ievākti centrifugējot un lizēti, izmantojot līzes buferšķīdumu (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Turklāt, lai pārbaudītu NFκB kodola translokāciju, žurku primāros hondrocītus 24h laikā 10ng/ml IL-1β klātbūtnē vai bez tās ārstēja ar 50 vai 100 μM aktieozīdu. Pēc tam citozoliskās un kodola frakcijas tika iegūtas, izmantojot NE-PER™ kodola un citoplazmas ekstrakcijas reaģentus (Thermo Sci- entific, Rockford, IL, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Kopējā olbaltumvielu koncentrācija, kas ekstrahēta no primārajiem žurku hondrocītiem, tika noteikta, izmantojot bicinchoninic acid protein testa komplektu (Thermo Scientific, Rockford, IL, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Turklāt kondicionētā vide tika savākta, lai noteiktu skrimšļus degradējošo fermentu līmeni, kas izdalās no hondrocītiem. Vienāds daudzums olbaltumvielu un kondicionētas barotnes tika elektroforētas uz nātrija dodecilsulfāta-poliakrilamīda gēla elektroforēzes (SDS-PAGE) un pēc tam pārnestas uz nitrocelulozes membrānām. Pēc tam rietumu blotēšana tika veikta, izmantojot mērķtiecīgu primāro anti-ķermeņus pret MMP-13, MMP-1, MMP-3, iNOS, COX-2, phospho-ERK1/2, total-ERK1/2, phospho-p38, total-p38, phospho-JNK, total JNK, phospho-NFκB, total NFκB, β- actin un lamin B. Imūnreaktīvas joslas tika vizualizētas, izmantojot uzlabotu chemiluminiscences sistēmu (Thermo Sci- entific, Rockford, IL, USA) saskaņā ar ražotāja norādījumiem un pēc tam attēlotas ar mikroķīmijas ierīci (DNR Bioimaging Systems, Jeruzaleme, Izraēla).

2.8. Kvantitatīvā polimerāzes ķēdes reakcija (qPCR) un kvantitatīvā reālā laika PCR (qRT-PCR).

Primārie žurku hondrocīti tika ārstēti ar 50 vai 100μMacteoside10ng/ml IL-1β klātbūtnē vai bez tās 24h. Pēc tam kopējā RNS tika izolēta no primārajiem žurku hondrocītiem, izmantojot TRIzol reaģentu (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Kopējā RNS koncentrācija tika mērīta, izmantojot NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Rockford, IL, ASV). Lai sintezētu cDNS, 1μg RNS tika apgriezti transkribēts, izmantojot ThermoScript reversās transkripcijas-PCR sistēmu (Invitro- gen, Carlsbad, CA, USA) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. cDNS qPCR tika veikts, izmantojot 2× TOPsimple™ DyeMIX-Taq (Enzynomics, Seula, Korejas Republika) un specifiskus praimerus TaKaRa PCR termiskā cikla ierīcē (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japāna). Pēc tam PCR produkti tika elektroforēti uz agarozes gēla, lai noteiktu mērķa gēnu ekspresijas līmeņus. Gliceraldehīda 3-fosfāta dehidrogenāzi (GAPDH) izmantoja kā endogēnu kontroli. Turklāt qRT-PCR gadījumā cDNS tika pastiprināts, izmantojot Eco™ Real-Time PCR sistēmu (illumine Inc., San Diego, CA, USA). β-Actin tika izmantots kā endogēna kontrole. qPCR un qRT-PCR izmantoto gruntējumu secības ir apkopotas attiecīgi 1. un 2. tabulā.

2.9. Želatīna zimogrāfija.

Želatīna ekimogrāfija tika veikta, lai novērtētu NMP aktivāciju primāros žurku hondrocītos. Īsumā, primārie žurku hondrocīti tika ārstēti ar 50 vai 100 μM aktieozīdu 10ng/ml IL-1β 24 stundu klātbūtnē vai bez tā. Pēc tam uz 10% poliakrilamīda gēla, kas kopolimerizēts ar 0,2% (1mg/ml) cūku ādas želatīnu, tika izmantots vienāds daudzums kondicionētas barotnes ar kondicionētu barotni. Pēc elektroforēzes gēls tika inkubēts zymo- gram renaturing buferšķīdumā (50mM Tris–HCl (pH7.6), 10mM CaCl2, 50mM NaCl un 0.05% Brij-35) pie 37°C 72h. Pēc MMP renaturācijas gēls tika iekrāsots ar 0,1% Coomassie Brilliant Blue R250. Želatīnalītiskās joslas tika atklātas kā skaidras joslas uz fona vienmērīgi iekrāsotas gaiši zilas un pēc tam attēlotas, izmantojot digitālo kameru.

2.10. Slāpekļa oksīda (NO) mērīšana.

Primārie žurku hondrocīti tika ārstēti ar 50 vai 100 μM aktieozīdu 10ng/ml IL-1β 24 stundu klātbūtnē vai bez tā. Pēc tam 50 μL kondicionētās barotnes reaģēja ar 50 μL sulfanilamīda un N-1-naftiletilēndiamīna dihidrohlorīda. Pēc tam absorbciju mērīja pie 540 nm viļņa garuma, izmantojot spektrofotometru (Epoch Spectrophotometer, BioTek, Winooski, VT, USA).

2.11. Prostaglandīna E2 (PGE2) pārbaude.

Primārie žurku hondrocīti tika ārstēti ar 50 vai 100μMacteoside10ng/ml IL-1β klātbūtnē vai bez tās 24h. Pēc tam PGE2 koncentrācija tika mērīta, izmantojot PGE2 parametru pārbaudes komplektu (R&D Systems Inc., Mineapolisa, MN, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem.

2.12. Citokīnu masīvs.

Primārie žurku hondrocīti tika ārstēti ar 50 μM aktieozīdu 10ng/ml IL-1β 24 stundu klātbūtnē vai bez tā. Pēc tam kopējais olbaltumvielu daudzums tika ekstrahēts un kvantificēts, kā aprakstīts iepriekš [13]. Pēc tam tika veikts citokīnu masīvs, lai izpētītu izmaiņas citokīnu ražošanā saskaņā ar ražotāja norādījumiem (RayBiotech, Inc., Norcross, GA, ASV).

2.13. Kodola translokācijas tests.

Primārie žurku hondrocīti tika ārstēti ar 50 un 100μg/mlacteoside10ng/ml IL-1β klātbūtnē. Pēc 30min primārie žurku hondrocīti tika fiksēti ar 1% paraformaldehīdu, caurlaidīgi 0,2% Triton X-100 un plaši mazgāti ar fosfātu buferšķīdumu sāls šķīdumu. Nespecifiski signāli tika bloķēti, izmantojot parasto kazas serumu. Pēc vairākām mazgāšanas reizēm hondrocīti tika inkubēti ar trušu anti-NFκB antivielām, kam sekoja inkubācija ar FITC konjugētu kazu anti-trušu IgG (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV) naktī 4 °C temperatūrā. Pēc tam iekrāsotās šūnas tika attēlotas, izmantojot lāzera konfokālu skenēšanas mikroskopa sistēmu (Leica Microsystems, Wetzlar, Vācija) Korejas Fundamentālās zinātnes institūta Gwangju filiālē (Gwangju, Korejas Republika).

2.14. Osteoartrītisko dzīvnieku paaudze.

Lai radītu osteoartrītiskus dzīvniekus, mediālais menisks (DMM) tika ķirurģiski destabilizēts BALB/c peļu ceļa locītavās (vidējais ķermeņa svars 19:3±0:5g) saskaņā ar IACUC vadlīnijām (CIACUC2019-A0029). OA- inducētie dzīvnieki tika ārstēti perorāli ar 5 un 10 mg/kg aktieozīda, kas izšķīdināts 5% etanolā (eksperimentālā grupa; n =5) vai nesējā (5% etanols) (DMM grupa; n =5) katru otro dienu 8 nedēļas. Kultūras perioda beigās ceļa locītavas tika sadalītas un fiksētas, izmantojot 5% paraformaldehīdu 7 dienas, lai veiktu histoloģiskos novērtējumus. Pēc safranīna-O un ātras zaļas krāsošanas attēlotie locītavu skrimšļa audi tika pārbaudīti saskaņā ar cilvēces pakāpi [14, 15].

2.15. Statistiskā analīze.

Eksperimentālie dati tiek parādīti kā vidējais ± standartnovirzi, un tie tika salīdzināti, izmantojot dispersijas analīzi, kam sekoja post hoc vairāki salīdzinājumi (Tukey tests), izmantojot SPSS programmatūras 25. versiju (IBM Corp.) Visi dati, izņemot pētījumu ar dzīvniekiem, tika iegūti no trim neatkarīgiem eksperimentiem.

acteosidepiemēram,cistanche

3. Rezultāti

3.1. Acteoside neietekmē L929 šūnu un žurku primāro hondrocītu dzīvotspēju.

Peļu fibroblastu šūnu līnija L929, ko izmantoja kā normālas šūnas, tika apstrādāta ar 2,5, 5, 10, 25, 50 un 100μM acteozīdu 24h. Pēc tam MTT tests tika veikts, lai novērtētu aktieozīda citotoksicitāti uz L929 šūnām. Kā parādīts 2. attēlā (a), tika noteikts, ka L929 šūnu relatīvā dzīvotspēja ir 94:8±8%, 93:6±7%, 100 ± 5%, 103:9± 5%, 126:1±8% un 122:7±4% pie attiecīgi 2,5, 5, 10, 25, 50 un 100μM acteozīda, salīdzinot ar kontroli (100:02 ± 3%). Turklāt, lai pārbaudītu aktieozīda citotoksicitāti primārajiem žurku hondrocītiem, mtt tests tika veikts, kā parādīts 2. attēla b) punktā. Primāro žurku hondrocītu, kas ārstēti ar 2,5, 5, 10, 25, 50 un 100μM aktieozīdu, dzīvotspēju noteica attiecīgi kā 114 ± 4%, 117:8±6%, 123:9± 5%, 132:6±4%, 153:1± 7% un 142:1±6%, salīdzinot ar kontroli (100:4±5%). Turklāt, lai apstiprinātu aktiedeozīda ietekmi gan uz L929 šūnu, gan primāro žurku hondrocītu dzīvotspēju, tika veikts Cell Live/Dead tests, kā parādīts 2. attēlā (c). Atmirušo šūnu skaits, kas iekrāsotas kā sarkana fluorescence, nepalielinājās gan L929 šūnām, gan primārajiem žurku hondrocītiem, kas 24 stundu garumā tika ārstēti ar 50 un 100 μM aktieozīdu. Šie dati konsekventi parādīja, ka noteiktā devaacteosideneietekmēja L929 šūnu un primāru žurku hondrocītu dzīvotspēju. Tādējādi 50μM aktieozīda un 100μM aktieozīda, kas ir netoksiskas devas gan L929 šūnās, gan primāros žurku hondrocītos, tika izmantoti, lai pārbaudītu tā antikatabolisko iedarbību in vitro pētījumos, izmantojot primārus žurku hondrocītus.

3.2. Acteoside neitralizē IL-1β-inducēto proteoglikāna zudumu primārajos žurku hondrocītos.

Primārie žurku hondrocīti, kas iestrādāti algināta lodītēs, 21 dienu tika ārstēti ar 50 un 100 μM aktieozīdu 1ng/ml IL-1β klātbūtnē vai bez tā. Pēc tam tika veikts DMMB tests, lai novērtētu proteoglikāna satura izmaiņas, kā parādīts 3. attēla a) punktā. Relatīvais proteoglikāna saturs tika noteikts kā 88:3±18:1% un 86:8±16:3% primārajiem žurku hondrocītiem, kas ārstēti attiecīgi ar 50 un 100μM aktieozīdu, salīdzinot ar kontroli (103:8±32:3%). Lai gan relatīvo proteoglikāna saturu samazināja aktieozīds, šie rezultāti nebija nozīmīgi. Tomēr relatīvais proteoglikāna saturs ievērojami samazinājās par 37:1± 14:7% primārajos žurku hondrocītos, kas ārstēti ar 1ng/ml IL-1β, bet 50 un 100μM aktieozīdu ievērojami samazināja proteoglikāna saturu attiecīgi par 57 ± 12:4% un 64 ± 14:5%, 1ng/ml IL-1β klātbūtnē. Pēc tam, lai pārbaudītu, vai acteozīds nomāc IL-1β- inducēto proteoglikāna zudumu, locītavu skrimšļi, kas atdalīti no žurku ceļa locītavām, tika ārstēti ar 100μM acteozīdu 10ng/ml IL-1β klātbūtnē vai bez tā 7 dienas. Pēc tam tika veikti histoloģiskie novērtējumi, izmantojot H&E krāsošanu un safranīna-O krāsošanu un ātru zaļu krāsošanu, kā parādīts 3. attēlā (b). Morfoloģiskās izmaiņas netika novērotas, izmantojot H&E krāsošanu; tomēr safranīns-O un ātra zaļa krāsošana atklāja, ka proteoglikāns iekrāsojās, jo sarkanā krāsa nemainījās locītavu skrimšļos, kas apstrādāti ar 100μM acteoside, salīdzinot ar kontrolējamo. Tomēr smagu proteoglikāna zudumu izraisīja 10ng/mLIL-1β locītavu skrimšļos, un 100μM acteoside ievērojami nomāca proteoglikāna zudumu locītavu skrimšļos, kas ārstēti ar 10ng/ml IL- 1β. Kopā šie dati konsekventi liecina, ka acteoside ir antikataboliska iedarbība, kas kavē locītavu skrimšļa deģenerāciju, neitralizējot IL-1β izraisītu proteoglikāna zudumu.

acteosidepiemēram,cistancheir laba ietekme uzAntioksidantu

3.3. Acteoside ir antikataboliska iedarbība, kas nomāc MMP ekspresiju un aktivāciju primāros žurku hondrocītos, kas ārstēti ar IL-1β.

Lai izpētītu, vai aktiozīdu izraisīta antikataboliska iedarbība ir saistīta ar MMP ekspresijas un aktivācijas nomākšanu, primārie žurku hondrocīti tika ārstēti ar 50 un 100 μM aktieozīdu 10ng/ml IL-1β klātbūtnē vai bez tās 24 stundu laikā. Pēc tam tika izmeklētas izmaiņas mmp. Kā parādīts 4. attēlā (a), lai gan skrimšļus noārdošo enzīmu, piemēram, MMP-13, MMP-1 un MMP-3 ekspresija tika ievērojami palielināta primāro žurku hondrocītu, kas ārstēti ar 10ng/ml IL-1β, kondicionētajā vidē, to samazinājaacteosideno devas atkarīgā veidā. Turklāt gan qPCR (4. att. b)), gan qRT-PCR (4.c attēls)) rezultāti atklāja, ka IL-1β ievērojami palielināja mRNS līmeni mmp, piemēram, MMP-13, MMP-1 un MMP-3 primārajos žurku hondrocītos. Tomēr tie samazināja no devas atkarīgo devu primārajos žurku hondrocītos, kas ārstēti ar 50 un 100 μM aktieozīdu. Turklāt 50 un 100 μM aktieozīds efektīvi nomāca NTP aktivāciju žurku primārajos hondrocītos, kas ārstēti ar 10ng/ml IL-1β (4. att. d)). Kopumā šie dati konsekventi norāda, ka acteoside ir antikataboliska iedarbība, kas nomāc skrimšļus noārdošo fermentu ekspresiju un aktivāciju.