1. daļa: NF-kB inhibitors un AMPK agonists: tīkla prognozēšana un multi-omikas integrācija, lai iegūtu signālu ceļus akteozīdam pret Alcheimera slimību

Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com

Ying-Qi Li1†, Yi Chen1†, Si-Cji Dzjans1 , Yuan-Yuan Shi2 , Sjao-Li Dzjans1 , Šaņ-Šan Vu1 , Ping Džou1 , Hui-Jing Van1 , Ping Li1* un Fei Li1,2*

¹ Valsts Atslēga Laboratorija no Dabiski Zāles, Ķīna Farmaceitiskā Universitāte, Nanjing, Ķīna, ² koledža no aptieka,Sjiņdzjanas Medicīnas universitāte, Urumči, Ķīna

IEVADS

Līdz ar iedzīvotāju novecošanos un straujo pieaugumu demences gadījumu skaits pasaulē ir uzrādījis augšupejošu tendenci.Alcheimera slimība(AD) ir izplatīta neirodeģeneratīva slimība, ko pavada kognitīvi traucējumi un diskinēzija (Perea et al., 2020), kas ir visizplatītākais demences veids. To raksturo smags neironu zudums, senils plankumi un neirofibrilāri samezglojumi (Shiao et al., 2017). AD patoģenēze(Alcheimera slimība)ir daudzdimensionāls un saistīts ar neiro iekaisumu. Neiro iekaisumu izraisa glia šūnu aktivācija, kas ir cieši saistīta ar AD rašanos un attīstību(Alcheimera slimība)(Hansliks un Ullands, 2020; Linnerbauers un Rothhammer, 2020). Neiro iekaisuma progresēšanas un saasināšanās laikā mikroglija tiek uzskatīta par galveno faktoru.

Mikroglijas ir primārās imūnās šūnas centrālajā nervu sistēmā, kas ir cieši saistītas ar tādu procesu kaskādi kā smadzeņu attīstība, nervu vides uzturēšana, kā arī reakcija uz traumām un labošanu (Perea et al., 2020). Turklāt mikrogliju var stimulēt līdz M1 fenotipam un palielināt pro-iekaisuma citokīnu ekspresiju, ja rodas ar neiroiekaisumiem saistītas slimības, piemēram, AD(Alcheimera slimība)notiek (Tsukahara et al., 2020). Pētījumi arī parāda, ka polarizāciju uz M1 fenotipu bieži pavada vielmaiņas traucējumi (Li L. et al., 2020), kas izraisa enerģijas metabolisma nelīdzsvarotību un mitohondriju disfunkciju (Agrawal un Jha, 2020). Šīs nelabvēlīgās izmaiņas ir saistītas ar neirodeģenerāciju, pat AD(Alcheimera slimība).

Akteozīds(ACT), feniletanoīda glikozīds, galvenokārt tiek iegūts noCistanche tubulosa. Arvien vairāk pierādījumu liecina, ka ACT piemīt daudzas farmakoloģiskas aktivitātes, tostarp neiroprotektīva (Wei et al., 2019), pretiekaisuma (Lai et al., 2019) un antioksidanta (Ji et al., 2019) iedarbība. Jo īpaši ir pierādīts, ka ACT var uzlabot mācīšanās un atmiņas traucējumus, kā arī regulēt enerģijas metabolismu streptozotocīna izraisītām žurkām (Chen J. et al., 2020). Turklāt tas var arī kavēt neironu apoptotisko šūnu nāvi un mitohondriju bojājumus eksperimentālajās autoimūnās encefalomielīta pelēs (Li W. et al., 2020). Tomēr reti tiek ziņots par ACT ietekmi uz mikroglia M1/M2 polarizāciju un tās mehānismu. Līdz šim tādi mehānismi kā mitohondriju funkcijas atjaunošana un šūnu metabolisma regulēšana ir neskaidri, un ir nepieciešami turpmāki zinātniski pētījumi, lai noskaidrotu precīzu mehānismu.

Šī ziņojuma mērķis ir izpētīt ACT terapeitisko efektivitāti, kā arī ACT pamatā esošo molekulāro mehānismu pret AD.(Alcheimera slimība). Šeit, pamatojoties uz konsolidētajām datu bāzēm, ir izveidota sistemātiska in silico metode zāļu mērķa identifikācijai. Mēs tālāk pētām iespējamos ACT mehānismus molekulāri bioloģiskā līmenī, integrējot RNS sekvencēšanu (RNA-seq) ar metabolomikas metodi un molekulārās bioloģijas metodēm. In silico, in vivo un in vitro sistemātiskas skrīninga stratēģijas kombinācija nodrošina jaunu protokolu, lai objektīvi atklātu tradicionālās ķīniešu medicīnas daudzmērķu savienojumus.

Cistanche tubulosa var ārstētAlcheimera slimība

MATERIĀLI UN METODES

Tīkla modelēšana

Tika apvienotas četras tiešsaistes platformas, lai prognozētu un atklātu ACT mērķus, proti, GeneCards1, līdzības ansambļa pieeju (SEA2), SwissTargetPrediction3 un PharmMapper4. Visas AD gēnu asociācijas(Alcheimera slimība)tika neatkarīgi savākti no DisGeNET5 un GeneCards. Pēc mērķa un mērķa mijiedarbības analīzes, ko veica String datubāze6, tīkls tika tālāk integrēts ar programmatūru Cytoscape (versija 3.8.2). GO un KEGG bagātināšanas analīze tika veikta DAVID datu bāzē7, lai anotētu un iegūtu tīklu.

Dzīvnieki un modeļu grupēšana

Šajā pētījumā tika izvēlēti savvaļas tipa zebrazi (AB celms, 4 mēnešus veci) (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Tie tika uzturēti 14/10-h gaismas/tumsas ciklā 28oC temperatūrā, ievērojot iepriekšējo metodi (Li YQ et al., 2020). Visi eksperimenti ar zebrām tika veikti Ķīnas Farmācijas universitātes Dzīvnieku ētikas komitejas uzraudzībā.

Zebrafish kāpuri tika sadalīti sešās grupās un apstrādāti no 3 dienām pēc apaugļošanas (dpf) līdz 7 dpf: kontroles grupa, modeļa grupa, modelis plus donepezila hidrohlorīds (DPZ, Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.) un modelis plus ACT (HPLC tīrība 98 procenti, Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd.) grupas. Kontroles grupa tika uzturēta barotnē ar 0,2 procentiem DMSO, un modeļa grupa tika apstrādāta ar 150 uM AlCl3 (pH 5,8). Modelis plus DPZ grupa tika apstrādāta ar AlCl3 un 8 uM DPZ. Modeļa plus ACT grupas tika apstrādātas kopā ar AlCl3 un dažādām ACT koncentrācijām (200, 100 un 50 uM).

Uzvedības analīze

Zebrafish kāpuru kustības tika reģistrētas ar ViewPoint uzvedības analizatoru (Zebralab, 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) 28oC temperatūrā. Īsumā, uzvedības parametri un rezultātu apstrāde atbilda iepriekš izveidotajai metodei (Li YQ et al., 2020). Šeit tika izvēlēts vidējais ātrums (AS), ātruma izmaiņas (AS), diskinēzijas atveseļošanās līmenis (DRR) un reakcijas efektivitāte (RE, procenti), lai novērtētu diskinēzijas atjaunošanos zebrazi.

Acetilholīnesterāzes un holīna acetiltransferāzes aktivitātes noteikšana

Pēc apstrādes no 3 līdz 7 dpf zebras kāpuri tika savākti, lai izmērītu acetilholīnesterāzes (AChE) un holīna acetiltransferāzes (ChAT) aktivitātes. Pamatojoties uz ražotāja protokolu, aktivitāte tika noteikta ar enzīmu saistītā imūnsorbcijas testa (ELISA) komplektiem (MLBIO Biotechnology Co., Ltd., Šanhaja, Ķīna).

Šūnu kultūras un ārstēšana

Šūnu līnija BV-2 tika iegādāta no American Type Culture Collection (ATCC, Manasasa, VA, Amerikas Savienotās Valstis). Tie tika kultivēti DMEM (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Ķīna). Barotne tika papildināta ar 10 procentiem FBS (Gibco, Grand Island, NY, Amerikas Savienotās Valstis),

100 V/ml penicilīna un 100 mg/ml streptomicīna kopā ar 95% gaisa/5% CO2 37oC temperatūrā. BV-2 šūnas tika inkubētas ar ACT (50, 25 un 12,5 uM) vai stimulētas ar lipopolisaharīdu (LPS, 1 ug/ml; Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, Amerikas Savienotās Valstis) 24 stundas. Šūnas tika novērotas zem apgrieztā mikroskopa (Nikon ECLIPSE Ti2, Japāna).

Šūnu dzīvotspējas tests

Šūnu skaitīšanas komplekta-8 (CCK-8) tests (JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, Ķīna) tika izmantots, lai novērtētu šūnu dzīvotspēju. Īsumā, absorbcija tika mērīta pie 450 nm ar mikroplašu lasītāju (Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, Amerikas Savienotās Valstis).

Slāpekļa oksīda ražošanas tests

Slāpekļa oksīds (NO) tika noteikts, mērot nitrītu līmeni BV-2 kultūras supernatantā, izmantojot Griesa reaģentu. Īsumā, barotne (100 ul) tika pārnesta uz jaunu 96-iedobes plāksni, katrā iedobē tika pievienots tāds pats Griesa reaģenta tilpums un reaģēts 15 minūtes tumsā. Absorbciju pie 540 nm noteica ar Microplate Reader.

Iekaisuma citokīnu līmenis supernatantā

TNF-a, IL-1 un IL-10 koncentrācija BV-2 šūnu supernatantā tika noteikta ar ELISA komplektiem saskaņā ar ražotāja norādījumiem.

Šūnu metabolisma noteikšana ar HPLC-Q-TOF-MS analīzi

BV-2 šūnas tika iesētas sešu iedobju traukā atsevišķi (n=6/grupa). Pēc apstrādes barotne tika noņemta, un šūnas trīs reizes nomazgāja ar aukstu PBS. Pēc tam tie nekavējoties tika pakļauti šķidrā slāpekļa iedarbībai, lai nomāktu šūnu metabolismu. Šūnas tika novāktas ar 80% auksta metanola. Lai atvieglotu olbaltumvielu nogulsnēšanos, šūnas 1 minūti enerģiski maisīja un centrifugēja ar ātrumu 13, 000 apgr./min (15 min, 4oC). Šūnu suspensija tika žāvēta slāpekļa plūsmā. Žāvētais atlikums tika atjaunots 150 ul iepriekš atdzesēta 25 procentu acetonitrila. Lai nodrošinātu secības analīzes stabilitāti un precizitāti, katrs šūnu paraugs ar vienādu tilpumu (10 ul) tika apvienots kā kvalitātes kontroles paraugs. Metabolītu noteikšanas laikā šie paraugi tika injicēti ik pēc sešiem paraugiem, lai apstiprinātu to stabilitāti. HPLC-Q-TOF-MS tika ievadīta 1-ul alikvota daļa.

Analīze tika veikta ar Agilent 1290 HPLC sistēmu

savienots ar Agilent 6530 Quadrupol Time-of-Flight (Q-TOF) masas spektrometru (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Amerikas Savienotās Valstis). Atdalīšana tika veikta ar ACQUITY UPLC BEH C18 kolonnu (2,1 min 100 mm, 1,7 um). Kustīgā fāze sastāvēja no 0,1% skudrskābes-ūdens (v/v; A) un acetonitrila (B).

Plūsmas ātrums tika iestatīts uz {{0}},4 ml/min ar šādiem optimāliem gradienta eluēšanas nosacījumiem: 0 līdz 2 min, 5 procenti B; 2 līdz 20 min, 5 līdz 95 procenti B (pozitīvo jonu režīms); 0 līdz 2 min, 5 procenti B; 2 līdz 20 min, 5 līdz 95 procenti B (negatīvo jonu režīms). Masas spektrometra darbības parametri tika iestatīti šādi: gāzes temperatūra, 320oC; žāvēšanas gāze, 10 L/min; smidzinātājs, 35 psi; VCap, 4, 000 V; fragmentors, 120 V.

dati tika veikti ar MetaboAnalyst8. Apvienojumā ar literatūru HMDB9 tika identificēti atšķirīgie metabolīti (VIP > 1, t-tests p < 0,05).="" visbeidzot,="" ceļa="" analīze="" tika="" veikta="" ar="">

Mitohondriju membrānas potenciāla mērīšana

Mitohondriju membrānas potenciāls (MMP) tika noteikts, izmantojot fluorescējošu zondi JC-1 (Beyotime, Ķīna) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Īsumā, šūnas no dažādām grupām tika izskalotas ar PBS un inkubētas ar JC-1 krāsošanas šķīdumu 20 minūtes 37oC temperatūrā. Pēc krāsošanas šūnas divas reizes mazgāja, izmantojot krāsošanas buferi. Pēc tam fluorescējošie signāli tika noteikti ar plūsmas citometriju (BD Accuri C6).

Mitohondriju adenozīna 5f-trifosfāta mērīšana

Adenozīna 5/-trifosfāta (ATP) koncentrācija mitohondrijās tika noteikta ar ATP testa komplektu (Beyotime, Ķīna). Īsumā, BV-2 šūnu barotne no dažādām grupām tika izmesta, un šūnas tika homogenizētas ar līzes buferi uz ledus. Supernatants, kas iegūts pēc centrifugēšanas (12,000 g,

5 min) tika izmantots, lai noteiktu ATP koncentrāciju. Luminiscence tika noteikta ar EnVision Multimode Microplate Reader (PerkinElmer).

Pārvaldība(Alcheimera slimība)

Intracelulārā reaktīvā skābekļa sugu līmeņa mērīšana

ROS līmeņa mērīšanai tika izmantots reaktīvo skābekļa sugu (ROS) testa komplekts (Beyotime, Ķīna). Šūnas no dažādām grupām tika inkubētas ar DCFH-DA (10 uM) 20 minūtes 37oC temperatūrā. Pēc zondes ielādes šūnas trīs reizes mazgāja ar DMEM. Pēc tam fluorescējošie signāli tika noteikti ar plūsmas citometriju (BD Accuri C6).

Transmisijas elektronu mikroskopija

BV-2 šūnas tika iesētas sešu iedobju traukā. Barotne tika noņemta un katrā iedobē ātri tika pievienots 1 ml 2,5% glutaraldehīda. Pēc tam šūnas tika savāktas un fiksētas ar jaunu 2,5% glutaraldehīdu 4 oC uz nakti. Pēc fiksācijas, dehidratācijas un iegulšanas šūnas tika novērotas ar HT7800 transmisijas elektronu mikroskopu (Hitachi, Tokija, Japāna).

RNA-Seq un bioinformātisko datu analīze

Kopējā RNS no BV{{{{10}}}} šūnām tika ekstrahēta, izmantojot Trizol reaģentu (Vazyme Biotech, Ķīna). Visi analītiskie paraugi tika nosūtīti uz Majorbio (Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd.) RNS sekvences pārbaudei. Dati tika analizēti Majorbio Cloud Platform1 tiešsaistes platformā0. RSEM11 tika izmantots, lai kvantitatīvi noteiktu gēnu pārpilnību. Būtībā diferenciālā izteiksme Neapstrādātie dati tika apstrādāti ar MassHunter Workstation programmatūras versiju B.{22}}7.{5}} (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Amerikas Savienotās Valstis). Neapstrādātos datus iepriekš apstrādāja XCMS platforma. Normalizētās analīzes galveno komponentu analīze (PCA) un daļējā mazāko kvadrātu diskriminējošā analīze (PLS-DA) tika veikta, izmantojot DESeq2/DEGseq/EdgeR ar Q vērtību 0,05; DEG ar|log2FC| > 1 un Q vērtība 0,05 (DESeq2 vai EdgeR)/Q vērtība 0,001 (DEGseq) tika uzskatīti par ievērojami atšķirīgiem izteiktiem gēniem. Turklāt tika veikta funkcionālās bagātināšanas analīze, ieskaitot GO un KEGG, lai noteiktu, kuri DEG ir ievērojami bagātināti ar GO terminiem un ceļiem ar Bonferroni koriģēto p vērtību 0, 05, salīdzinot ar visa transkripta fonu. Sākotnējie secību dati ir iesniegti NCBI secību lasīšanas arhīva datubāzē.

Kvantitatīvā reāllaika polimerāzes ķēdes reakcija

Kopējā BV-2 šūnu RNS tika iegūta, izmantojot RNA-easyTM Isolation Reagent (Vazyme Biotech, Ķīna), un reversās transkripcijas reakcija tika veikta ar FastKing-RT SuperMix (TIANGEN Biotech, Ķīna). Reakcijas tika veiktas saskaņā ar ražotāja protokolu. cDNS tika pakļauts kvantitatīviem reālā laika polimerāzes ķēdes reakcijas (qRT-PCR) testiem ar īpašiem primeriem un TransStart TOP Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech, Ķīna). Praimeri ir uzskaitīti 1. papildu tabulā, un kā iekšējā kontrole tika izmantots -aktīns. Kvantitatīvās analīzes veikšanai tika izmantota 2-AA CT metode.

Western Blot analīze

BV-2 šūnas tika lizētas ar RIPA līzes buferi (KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Ķīna), kas satur 1 procentu proteāzes inhibitoru kokteili (Thermo Fisher), lai iegūtu kopējo proteīnu. Olbaltumvielas tika atdalītas ar 10% SDS-PAGE un pārnestas uz NC membrānām. Pēc bloķēšanas ar 5% vājpiena/BSA, membrānas tika inkubētas ar AMKa (Proteintech), p-AMPKa (Affinity Biosciences), PGC-1a (Proteintech), NF-kB (Proteintech), p-NF- kB (ABklonālās) vai GAPDH (ABklonālās) antivielas 5% TBST 4oC temperatūrā nakti. Membrānas inkubēja ar sekundāro mārrutku peroksidāzes konjugētu antivielu (ABclonal) istabas temperatūrā 1 stundu. Vizualizācijai un kvantitatīvai noteikšanai tika izmantots augstas kvalitātes ECL Western blotēšanas substrāts (Tanon, Ķīna), Gel attēlveidošanas sistēma (Tanon, Ķīna) un ImageJ programmatūra.

Molekulārā dokstacija

Molekulārās dokstacijas analīze tika veikta, izmantojot Autodock programmatūru (versija 4.2). Afinitāti starp ACT un proteīniem novēroja AutodockTools programmatūra. AMPKa (PDB ID: 5g5j) un NF-kB (PDB ID: 4q3j) trīsdimensiju (3D) olbaltumvielu struktūras tika iegūtas no proteīnu datu bankas12.

Statistiskā analīze

Visi dati tiek izteikti kā vidējā standarta novirze un analizēti ar GraphPad Prism Software (8. versija.{1}}.1). Atšķirības starp grupām tika analizētas ar vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA), kam sekoja Tukey vairāku salīdzināšanas tests. p < 0,05="" tika="" uzskatīts="" par="" statistiski="">

Cistanche uztura bagātinātājs Alcheimera slimības ārstēšanai

REZULTĀTI

ACT-AD mērķu mijiedarbības tīkla un ceļa prognozēšana

Konsolidējot vairākas datu bāzes, tika iegūti 253 ACT mērķi, savukārt kopā tika apkopoti 1697 ar AD saistīti mērķi. Pēc mērķa tīkla kartēšanas ACT-AD mērķa mijiedarbības tīklā tika absorbēti kopumā 70 mērķi (1.A attēls). KEGG bagātināšanas analīze liecināja, ka ACT varētu būt plaša spektra un daudzveidīga mērķa iedarbība (1.B attēls). Tas arī ierosināja, ka ACT ir vairāki AD ceļi, mērķa punkti un elementi(Alcheimera slimība)ārstēšana. Klasificējiet šos ceļus, lai iegūtu precīzu mehānismu interpretāciju. ACT var galvenokārt korelēt ar signālu pārraidi, endokrīno sistēmu, imūnsistēmu un šūnu augšanu un nāvi, lai spēlētu konfrontācijas lomu pret AD(Alcheimera slimība)(1.C attēls). Ir vērts atzīmēt, ka lielākā daļa šo ceļu ir saistīti ar iekaisuma reakciju. Tiek spekulēts, ka ACT pretiekaisuma iedarbība varētu būt neatņemama tās konfrontējošā loma pret AD.(Alcheimera slimība).

ACT mazināja diskinēziju un uzlaboja holīnerģiskās sistēmas darbību AD(Alcheimera slimība)Zebrafish kāpuri

Lai pārbaudītu tīkla modeli, AlCl{0}}inducēja AD(Alcheimera slimība)zebras kāpuru modelis tika izmantots, lai demonstrētu ACT efektu. Tika novērota zebras kāpuru kustība gaismas/tumsas ciklos, un tika reģistrētas to peldēšanas takas (1. D attēls). Rezultāti parādīja, ka ACT efektīvi palielināja zebras AS un AS, un sinerģiskais efekts palielinājās, palielinoties devām (1. E attēls). DRR un RE atklāja intuitīvāku ACT un DPZ salīdzinājumu (1.F attēls). Attiecīgi ACT mazināja diskinēziju, uzrādot līdzīgu iedarbību kā DPZ.

Ir vispāratzīts, ka holīnerģiskajai sistēmai ir svarīga loma mācīšanās un atmiņas procesos. Tādējādi AChE un ChAT aktivitātes tika izmantotas, lai atklātu ACT efektu. AlCl3 iedarbība zebrafā tika radīta ar smadzeņu holīnerģiskām izmaiņām (1.G attēls). Bija zīmīgi, ka ACT ārstēšana nomāca AChE aktivitāti. Turklāt pēc ārstēšanas ar ACT ChAT aktivitāte samazinājās. Tāpēc ACT uzrādīja būtisku ietekmi uz AlCl3-inducēto AD(Alcheimera slimība)zebras kāpuri.

ACT nomākta M1 polarizācija un veicināta M2 polarizācija LPS izraisītās BV-2 šūnās

Lai vēl vairāk apstiprinātu tīklu, ACT pretiekaisuma iedarbība tika pētīta in vitro, izmantojot BV-2 mikroglia šūnas. Pēc 24 stundu ilgas LPS apstrādes BV-2 šūnu dzīvotspēja ievērojami samazinājās. Par laimi, ACT palielināja LPS inducēto BV-2 šūnu dzīvotspēju (2.A attēls). Turklāt tika novērota BV-2 šūnu morfoloģija. Pēc 24 stundu ilgas LPS stimulācijas tas parādīja, ka BV-2 šūnām tika veikts M1 polarizācijas stāvoklis. Morfoloģiskās izmaiņas tika novērstas, vienlaikus ārstējot ar ACT (2.B attēls).

Turklāt rezultāti liecināja, ka atšķirībā no BV-2 šūnām, ko stimulē LPS, BV-2 šūnas, kas apstrādātas kopā ar ACT, būtiski nomāca TNF-a, IL-1 un NO (2. attēls). ekspresijas šūnu supernatantā. Tie ir klasiski pro-iekaisuma citokīni kā M1 mikroglia polarizācijas indikatori. Līdzīgi kā ELISA rezultāti, qPCR rezultāti atklāja, ka TNF-a, slāpekļa oksīda sintāze (iNOS),

IL-1 un CD86 mRNS ekspresijas tika ievērojami kavētas ar ACT ārstēšanu, salīdzinot ar LPS grupu (2. D attēls).

Turklāt mēs izmērījām M2 mikroglia polarizācijas līmeni ar ELISA (attēls 2C) un qPCR (attēls 2E), un rezultāti liecināja, ka ACT ievērojami palielināja ar M2 mikrogliju saistītos marķieru ekspresijas līmeņus (IL-10, CD206, TGF- un Arg-1). Vārdu sakot, šie rezultāti parādīja, ka ACT nomāca M1 mikroglia polarizāciju un veicināja M2 fenotipu.

ACT regulēta M1/M2 polarizācija, inhibējot NF-kB ceļu

Transkriptomisko analīzi veica RNA-seq, lai izpētītu ACT mehānismu BV-2 šūnās no kopējā līmeņa. PCA parādīja, ka kontroles, LPS un ACT grupas var labi atšķirt (3.A attēls). Tas atklāja 899 atšķirīgi izteiktus gēnus (DEG) starp kontroles grupu un LPS grupu un 49 DEG starp LPS grupu un ACT.

grupa (3.B attēls). Konsekventi GO (3.C attēls) un KEGG bagātināšanas analīze (3D attēls) atklāja, ka ACT ietekme bija saistīta ar NF-kB ceļu. Gēnu kopums, kas saistīts ar NF-kB ceļu, tika vēl vairāk apstiprināts, un to homeostāzi noteikti ietekmēja LPS. Kā gaidīts, ACT būtiski ietekmēja to izteiksmes (3. E attēls).

NF-kB ceļš ir klasisks ceļš, lai regulētu iekaisuma progresēšanu, galu galā izraisot pro-iekaisuma faktoru izdalīšanos. Lai iegūtu mehānisku atbalstu, NF-kB ceļa galvenais proteīns tika novērtēts ar Western blot. LPS stimulācija izraisīja NF-KB aktivizēšanu, kas saistīta ar M1 polarizācijas veicināšanu. Saskaņā ar RNS-seq analīzi ACT inhibēja LPS stimulētu NF-kB fosforilāciju (3.F attēls). Tāpēc ACT var atvieglot LPS izraisīto M1 polarizāciju, izmantojot NF-kB ceļu BV-2 šūnās.

ACT traucēta arginīna biosintēze, kā arī pantotenāta un CoA biosintēze

ACT tīkla prognoze atklāja, ka tā bija saistīta ar arginīna (Arg) un prolīna metabolismu (1.B attēls). RNA-seq parādīja, ka ACT ietekmētie ceļi ietvēra arī Arg biosintēzi, kā arī pantotenāta un CoA biosintēzi (3D attēls). Ir ierosināts, ka BV-2 šūnu vielmaiņas traucējumi, ko izraisa LPS stimulācija, ir saistīti ar M1 polarizāciju (Orihuela et al., 2016). Tādējādi

Lai identificētu ACT ietekmi uz šūnu metabolismu, tika izmantots nemērķtiecīgs šūnu metaboloms ar HPLC-Q-TOF-MS. PCA un PLS-DA (3G attēls) parādīja, ka kontroles, LPS un ACT grupas var labi atšķirt, pamatojoties uz intracelulāriem metabolītiem. Dažādu metabolītu līmeņi LPS inducētajās BV-2 šūnās pēc ACT apstrādes tika mainīti (3H attēls). Salīdzinot ar kontroles grupu, LPS grupā bija 11 metabolīti, kas būtiski mainījās (2. papildu tabula), savukārt 14 metabolīti tika skaidri mainīti pēc ACT ārstēšanas (3. papildu tabula), iesaistot 11 vielmaiņas ceļus (3.I attēls). ACT iedarbība galvenokārt sastāvēja no aminoskābju metabolisma, nukleotīdu metabolisma, enerģijas metabolisma un kofaktoru un vitamīnu metabolisma regulēšanas. Interesanti, ka ar metabolomu iegūtie vielmaiņas ceļi atbilda tīkla prognozēšanai un RNS-seq, ieskaitot Arg biosintēzi, kā arī pantotenāta un CoA biosintēzi. Iepriekš minētais parādīja, ka ACT var regulēt Arg biosintēzi, kā arī pantotenāta un CoA biosintēzi LPS stimulētajās BV- 2 šūnās.

Cistanche ekstrakts pretAlcheimera slimība

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai skatītu 2. daļu