1. daļa. Kvercetīna 3-O- -D-glikuronīda pretiekaisuma, antioksidanta, mitrinošā un pretmelanoģenēzes iedarbība cilvēka keratinocītos un melanomas šūnās, aktivizējot NF-κB un AP-1 ceļus
Mar 21, 2022
Lai iegūtu vairāk informācijas, sazinietiestina.xiang@wecistanche.com
Abstrakts: KvercetīnsIr ziņots, ka 3-O- -D-glikuronīds (Q-3-G), kvercetīna glikuronīda konjugāts, saturpretiekaisumaīpašības lipopolisaharīdu stimulētajos makrofāgos, kā arī pretvēža un antioksidanta īpašības. Atšķirībā no kvercetīna, kuram ir plaši aprakstīts, ka tam piemīt plašs farmakoloģisko aktivitāšu klāsts, tostarp ādas aizsargājoša iedarbība, Q-3-G farmakoloģiskie ieguvumi un mehānismi ādā vēl nav noskaidroti. Šajā pētījumā galvenā uzmanība tika pievērsta Q-3-pret UVB vai H2O2- izraisītu oksidatīvo stresu ādas aizsargājošo īpašību, tostarp pretiekaisuma un antioksidantu īpašību raksturošanai, hidratācijas efektiem unantimelanoģenēzeaktivitātes, izmantojot cilvēka keratinocītus (HaCaT) un melanomas (B16F10) šūnas. Q-3-G pazemināja pro-iekaisuma gēna un citokīnu, piemēram, ciklooksigenāzes-2 (COX-2) un audzēja nekrozes faktora (TNF) ekspresiju HO vai UVB- apstarotās HaCaT šūnas. Mēs arī parādījām, ka O-3-Gekshibātiem ir antioksidanta iedarbība, izmantojot brīvo radikāļu attīrīšanas testus, plūsmas citometriju un pastiprinātu ar kodolfaktoru, eritroīdu 2- saistītā 2. faktora (Nrf2) ekspresiju. Q-3-G samazināja melanīna veidošanos melanocītus stimulējošā hormona (-MSH) inducētās B16F10 šūnās. Q-3-G hidratācijas efekti un mehānismi tika pārbaudīti, novērtējot ar mitrinošo faktoru saistītos gēnus, piemēram, transglutamināzi-1(TGM-1), filaggrīnu (FLG) un hialuronskābes sintāzi. (HAS)-1. Turklāt Q-3-G palielināja c-Jun, Jun N-termināla kināzes (JNK), mitogēnu aktivētās proteīnkināzes (MAPK) kināzes 4 (MKK4) un TAK1 fosforilāciju, kas ir iesaistītas MAPK/AP. -1 ceļš un IkB , IkB kināzes (IKK)- , Akt un Src fosforilēšana, kas ir iesaistīti NF-kB ceļā. Kopumā mēs esam pierādījuši, ka Q-3-G, izmantojot NF-kB un AP-1 ceļus, cilvēka keratinocītos un melanomas šūnās iedarbojas ar pretiekaisuma, antioksidantu, mitrinošu un pretmelanoģenēzi.
Atslēgvārdi: kvercetīns 3-O- -D-glikuronīds; UV aizsardzība; mitrināšana; antimelanoģenēze; AP-1; NF-kB
1. Ievads
Āda, lielākais ķermeņa orgāns, piedāvā barjeru, kam ir liela nozīme ķermeņa aizsardzībā no ārējās vides un kaitīgiem faktoriem, piemēram, ultravioletā starojuma, infekcioziem mikrobiem un kaitīgām ķīmiskām vielām. Šī barjera arī regulē organisma elektrolītu līdzsvaru un temperatūru un novērš mitruma zudumu [1,2]. Cilvēka āda sastāv no trim slāņiem: epidermas, dermas ar piedēkļiem un zemādas audiem [3]. Epidermas slānim ir svarīga loma ķermeņa temperatūras uzturēšanā.
Keratinocīti, bagātīgs komponents ādas epidermā, cieši mijiedarbojas ar citiem, izmantojot desmosomas un ciešus savienojumus, kas nodrošina efektīvu fizikāli ķīmisko barjeru[4]. Lai gan āda darbojas kā aizsargbarjera, ultravioletais (UV) starojums būtiski ietekmē lielāko daļu šūnu, tostarp keratinocītus, ādas ārējo slāni. UV starojums var izraisīt ādas novecošanos, ādas bojājumus, grumbu veidošanos un hiperpigmentāciju, kas tiek uzskatīta par vienu no cenzūrīgākajiem riska faktoriem [5].UV gaisma sastāv no trim viļņu garuma diapazoniem: UVA(320-400 nm), UVB. (280-320 nm) un UVC (200-280 nm). Papildus ūdeņraža peroksīdam (H2O2), kas, kā zināms, veicina oksidatīvo stresu, UVB var izraisīt reaktīvo skābekļa sugu (ROS) veidošanos, aktivizējot ROS ģenerējošus enzīmus [6]. Ir aprakstīts, ka nekontrolēta ROS uzkrāšanās šūnās, tostarp keratinocītos, izraisa lipīdu, proteīnu, nukleīnskābju un citu intracelulāru molekulu oksidatīvas modifikācijas, kas pēc tam izraisa dažāda veida ādas bojājumus un ar novecošanos saistītus procesus, piemēram, šūnu nāvi, oksidatīvo stresu, un iekaisums [7,8]. Turklāt ir zināms, ka oksidatīvā stresa reakcija ietekmē dažādu šūnu komponentu bojājumus [9]. Bojātas ādas šūnas var izraisīt arī iekaisuma reakcijas, kā rezultātā āda tiek hroniski bojāta [10]. Viens no UVB vai H2O2-mediētu ādas bojājumu veidiem bioloģisku procesu rezultātā ir tādu iekaisuma gēnu kā ciklooksigenāzes-2 (COX-2) un pro-iekaisuma citokīnu ekspresija [11]. Tāpēc, lai novērstu un bloķētu slimības, kas saistītas ar UVB vai H2O2 izraisītiem ādas bojājumiem, ir svarīgi izstrādāt drošākus, izturīgākus un efektīvākus ādas aizsardzības efektus.
Ādas mitrināšanai ir arī svarīga loma tās normālas funkcijas uzturēšanā. Jo īpaši stratum corneum (SC) ir aizsargājoša iedarbība pret ūdens zudumu [12]. Ragveida slāņa ūdens saturs piedalās ādas lobīšanos un pareizu nobriešanu, savukārt nepietiekams ūdens daudzums SC veicina korneocītu uzkrāšanos un disfunkciju [12,13]. Keratinocītu diferenciācijas beigu stadijā tās plazmas membrāna un šūnu organelli pazūd, un pēc tam kalcija pieplūdums inducē transglutamināzi (TGM) šķērssaitei ar citiem proteīniem. TGM-1 trūkums vai zudums izraisa bojātu šūnu apvalka šķērssavienojumu. Lamellas ihtioze ir tādas slimības piemērs, ko izraisa TGM-1 zudums. Turklāt filagrīnam (FLG), izveidotajai keratīna matricai, ir nozīme SC veidošanā, jo tas darbojas kā sastatnes, lai saistītu kornificētas apvalka olbaltumvielas un lipīdus[14], katalizējot g-glutamillizīna šķērssaistīšanas reakcijas, ATGM un membrānu. - saistītie enzīmi, kas nodrošina SC integritāti [15]. Turklāt hialuronskābe (HA) ir dabīgā mitruma faktora (NMF) veids, kas ir saistīts ar mitruma aizturi ādā, un tai ir atšķirīgs profils raksturīgā ādas novecošanā, tā ir zāļu ievadīšanas līdzeklis un svarīga ekstracelulārās matricas sastāvdaļa. [16,17]. HA spēlē lomu ādas mitruma palielināšanā, regulējot hialuronskābes sintāzes (HAS) gēnus; turklāt retīnskābe (A vitamīns) var efektīvi regulēt HA epidermā [17]. TGM-1, FLG un HAS-12,3 ir gēni, kas saistīti ar NMF ražošanu [18]. Turklāt transkripcijas faktoru, piemēram, aktivatora proteīna-1(AP-1) un kodolfaktora (NF)-kB aktivizēšana ir iesaistīta pro-iekaisuma vielu ražošanā, kas optimizē ādas barjeru un ādas mitrināšanu. caur AP-1 un NF-kB ceļiem[19]. Augšupējie signalizācijas enzīmi AP-1 ceļā ietver mitogēnu aktivētās proteīnkināzes (MAPK), piemēram, c-Jun N-termināla kināzi (JNK), ārpusšūnu signālu regulētu kināzi (ERK) un p38, savukārt Src, Akt, IkB -kināze (IKKo/ ) un KBO (IkBa) pieder pie NF-KB ceļa [20. Āda arī ražo melanīnu epidermas slānī, īpaši melanocītos — galvenajā melanīna avotā —, kas veicina ādas krāsas un melanoģenēzes noteikšanu [21]. UVB starojums un melanocītus stimulējošais hormons (o-MSH) var stimulēt melanīna sekrēciju, tādējādi izraisot melanoģenēzi [22. Melanoģenēzes laikā -MSH aktivizē proteīnkināzi A (PKA), ar proteīnu mikroftalmiju saistīto transkripcijas faktoru (MITF) un cAMP atbildes elementu saistošo (CREB) [23]. Viena no melanīna funkcijām tiek uzskatīta par ādas bojājumu novēršanu UV starojuma ietekmē, arī saules gaismā. Tomēr pārmērīga melanīna ražošana vai melanīna satura trūkums, ko izraisa novecošanās, melanocītus stimulējošais hormons un UV iedarbība, veicina vasaras raibumus, melasmu, senilu lentigīnu un citus hiper/hipopigmentācijas traucējumus, kas var negatīvi ietekmēt izskatu un ādu. veselība [24]. Tādējādi melanoģenēzes kontrole ir arī vēlama, lai saglabātu gan cilvēka ķermeņa veselību, gan kosmētisko izskatu.
Kvercetīnsir dominējošais flavonola tipa flavonoīds, kas atrodas dārzeņos, augļos, dzērienos un ārstniecības augos [25]. Līdz ar to kvercetīns ir plaši pētīts, lai tam būtu farmakoloģiskas priekšrocības, tostarp pretiekaisuma, antiaterosklerozes,antioksidants, pretvēža un ādu aizsargājošas īpašības, un tas ir saistīts ar melanoģenēzi [24,26-29]. Tomēr vairāki darbi, kuros izmantotas jutīgas un uzticamas metodes, ir parādījuši, ka kvercetīns plazmā nav konstatēts [30-33] un smadzenēs gandrīz nav atrodams [34, 35]. Kvercetīns, kas parasti ir glikozīdu forma, labi uzsūcas un galvenokārt hidrolizējas un metabolizējas tievajās zarnās, resnajā zarnā, aknās un nierēs konjugētos metabolītos [30,36-38]. Cirkulējošās asinīs tiek konstatēti tikai konjugētie metabolīti, piemēram, glikuronīds vai sulfāts (attiecīgi metilēts vai nemetilēts), nevis kvercetīna aglikons vai tā glikozīdi. 3/-metil-kvercetīna-3-glikuronīds, kvercetīna-3-glikuronīds un kvercetīna-3-sulfāts ir identificēti kā galvenie plazmas metabolīti pēc 1,5 h pēc ceptu sīpolu lietošanas[30, 32]. Šos kvercetīna metabolītus tievajās zarnās un aknās veido biotransformācijas enzīmi, tostarp UDP-glikuroniltransferāzes II fāzes metabolisma rezultātā [29, 39, 40]. Tika arī ziņots, ka kvercetīna konjugētie metabolīti uzkrājas cilvēka plazmā koncentrācijas diapazonā no 10-' līdz 10- grādiem M pēc periodiskas sīpolu uzņemšanas ēdienreizes laikā 1 nedēļu[41]. Kvercetīna metabolītu pussabrukšanas periods ir diezgan augsts, aptuveni no 11 līdz 28 stundām [29]. Tā kā šie savienojumi ir novēroti kā galvenās konjugētā kvercetīna metabolītu formas, būtiski būtu pētījumi, kuros galvenā uzmanība pievērsta flavonolu bioloģiskajai aktivitātei, izmantojot šos konjugētos metabolītus, kas mudināja mūs izpētīt viena no konjugētā kvercetīna metabolītu bioloģisko aktivitāti. Viens no visbiežāk sastopamajiem glikuronīda metabolītiem, kas galvenokārt atrodams plazmā un audos, tostarp aknās, nierēs un smadzenēs, ir kvercetīna 3-O- -D-glikuronīds(Q-3-G) (1. attēls). [31,35,40,42,43], kas var radīt līdzīgas, spēcīgākas vai vājākas aktivitātes, salīdzinot ar pamatsavienojumiem dažādos modeļos. Q-3-G caur plazmu tiek transportēts uz mērķa audiem, lai īstenotu savu bioloģisko aktivitāti [39]. Ir pierādīts, ka O-3-G ir arī efektīvs metabolīts žurku plazmā pēc perorālas kvercetīna lietošanas [43]. Citos pētījumos tika konstatēts, ka Q-3-G saturošs metabolīts uzkrājas aortā pēc kvercetīnu saturošas pārtikas ievadīšanas, un tas tika identificēts kā aktīvā viela, kas cilvēka asinīs konstatēta diapazonā no 0.{48} } μM【44】. Turklāt Q-3-G var atrast vīnā [45] un ārstniecības augos, piemēram, Hypericum hirsutum, Nelumbo nucifera, Oenothera biennis un zaļajās pupiņās [46-49].Q-3-G ir aprakstīts kā pretiekaisuma komponents LPS stimulētos apstākļos, un tam ir antioksidanta īpašības asins plazmā [50-52]. Tomēr, salīdzinot ar kvercetīna ilgo lietošanas vēsturi un plašo izpēti, Q{57}}G izpēte vēl ir jāizpēta. Tāpēc Q-3-G tika izvēlēts kā kvercetīna metabolītu pārstāvis kā aktīvs kvercetīna spēlētājs in vivo. Turklāt Q-3-G loma uz ādas aizsargājošo iedarbību arī vēl nav pilnībā noskaidrota. Šajā pētījumā, izmantojot dažādus in vitro novērtējumus, mēs pētījām Q-3-G ādas aizsargājošo iedarbību pret UVBor H2O2-inducēto oksidatīvo stresu un iekaisumu, ādas mitrināšanu HaCaT (cilvēka keratinocītu šūnu līnijā). šūnām un antimelanoģenēzes aktivitātei B16F10 (peļu melanomas šūnu līnijas) šūnās.
2. Rezultāts
2.1. Q-3-G pretiekaisuma un antioksidanta iedarbība pret UVB vai H2O2-stimulētām HaCaT šūnām
Ādas audus var bojāt UV starojums. UV starojums aktivizē vairākus kaitīgus faktorus, tostarp oksidatīvo stresu, apoptotisko šūnu nāvi, iekaisumus un ādas novecošanos. Lai noteiktu Q-3-G UV aizsargājošās aktivitātes, sākotnēji mēs novērtējām, vai Q-3-G ietekmē cilvēka keratinocītu šūnu dzīvotspēju. Izmantojot 3-(4-5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-243 tetrazolija bromīda (MTT) testu, mēs pētījām citotoksisko iedarbību. O-3-G HaCa šūnās. Kā parādīts 2.a attēlā, Q-3-G koncentrācijā 2.5-20 uM nebija būtiskas iejaukšanās šūnu dzīvotspējā, kas norādīja, ka O-3-G neuzrādīja citotoksicitāti līdz pat 20 μM un nekaitēja keratinocītiem, ādas šūnu virsējam slānim. Pēc tam mēs novērtējām Q-3-G ādu aizsargājošo iedarbību HaCaT šūnās, kas pakļautas UVB iedarbībai. Pēc UVB apstarošanas ar 30 mJ/cm² Q-3-G būtiski aizsargāja HaCaTšūnas no UVB izraisītas šūnu nāves atkarībā no koncentrācijas (2.b attēls). Saskaņā ar MTT testu, izmantojot kameru, kas savienota ar mikroskopu, lai fiksētu HaCaT šūnu morfoloģiju, Q-3-G aizsargāja pret šūnu nāvi UVB apstarotās HaCaT šūnu dēļ līdz 10 μM koncentrācijai (2.c attēls). . HaCaT šūnu skaits katrā stāvoklī bija 482 neapstrādātajā grupā, 91 UVB 30 mJ/cm grupā, 276 UVB 30 mJ/cm² plus 5 μM O-3-G grupā un 320 UVB 30 grupā. mJ/cm² plus 10 μM Q-3-G grupa (2.d attēls). Šie rezultāti apstiprināja, ka Q-3-G kavē UVB izraisītu HaCaT bojājumu un glābj ādu aizsargājošo efektu no UVB starojuma.
![i-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 μM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 μM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 μM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s or incubated with H2O2 (500 μM) with or without Q-3-G (5–10 μM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 μM) was reacted with 2,2-diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s with or without Q-3-G (5– 10 μM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted.](/Content/uploads/2022842169/2022032111072748381b7599e14e8e8a252699414e284f.png "i-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 μM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 μM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 μM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s or incubated with H2O2 (500 μM) with or without Q-3-G (5–10 μM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 μM) was reacted with 2,2-diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37°C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3) for 10 s with or without Q-3-G (5– 10 μM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted.")
Iekaisuma rašanās un saasināšanās organismā laiku pa laikam aktivizē makrofāgus un atbrīvo dažus citokīnus. Iekaisums ir oksidatīvā stresa pazīme. Mēs pētījām Q-3-G pretiekaisuma iedarbību pret UVB vai HO2-inducētu iekaisumu. Ir labi zināms, ka UVB var veicināt DNS bojājumus un iekaisumu ādas šūnās 【10】. Mēs apstarojām HaCaT šūnas ar UVB 30mJ/cm² un inkubējām HaCaT šūnas ar H2O2 (500 uM). Mēs izmantojām reāllaika PCR testu, lai pārbaudītu iekaisuma enzīma COX-2 un pro-iekaisuma citokīna TNF- mRNS ekspresiju. Kā liecina rezultāti 2.e,f attēlā, 10 μM O-3-G koncentrācija būtiski inhibēja COX-2 un TNF- mRNS ekspresiju. Līdz ar to Q-3-G nomāca HaCaT šūnās izraisītās iekaisuma reakcijas pēc UVB starojuma vai H2O2 iedarbības.
Mēs izmantojām 2,2'-azinobis-(3-etilbenzotiazolīna-6-sulfonskābes) (ABTS) un 2,2-difenil-lpikrilhidrazil(DPPH) radikāļu attīrīšanas testus — plaši izmantotas modeļu sistēmas. izpētīt dabisko savienojumu attīrīšanas aktivitātes in vitro — novērtēt Q-3-G antioksidantu īpašības dažādās koncentrācijās. HaCaT šūnas tika apstrādātas ar Q-3-G no koncentrācijas atkarīgā veidā no 25-40 μM DPPH klātbūtnē, un rezultāts uzrādīja ievērojamu attīrīšanas aktivitāti pie vairāk nekā 2,5 uM (2.g attēls). . ABTS tests arī nozīmīgi parādīja Q-3-G ietekmi uz brīvo radikāļu iztvaikošanu no koncentrācijas atkarīgos veidos ar IC50 vērtību 1,75 μM (2.h attēls). Askorbīnskābe (AA) kā pozitīva kontrole uzrādīja vislielāko antioksidantu iedarbību gan DPPH, gan ABTS testos. Ir ziņots, ka ar kodolfaktoru eritroīdo 2-saistītais faktors 2 (Nrf2), viens no antioksidanta atbildes elementa (ARE) atkarīgajiem gēniem, regulē aizsargājošo oksidoreduktāzes un tās nukleofīlos substrātus, tādējādi veicinot antioksidantu enzīmu darbību, lai novērstu bojājumus un labotu. sistēmas [53]. Pēc tam mēs pārbaudījām Nrf2 ekspresijas līmeni UVB apstarotajās HaCaT šūnās. Nostiprinot iepriekš minētos konstatējumus, O-3-G ievērojami uzlaboja Nrf2 ekspresijas līmeni UVB apstarošanas rezultātā, salīdzinot ar kontroli atkarībā no koncentrācijas, līdz 10 uM (2.i attēls), kas nozīmēja, ka Q-3- G piemīt antioksidanta iedarbība gan ķīmiski, gan bioloģiski ar brīvo radikāļu attīrīšanas īpašību un attiecīgi palielina Nrf2-atkarīgo ARE signālu aizsargājošo efektu. Turklāt mēs veicām arī ROS plūsmas citometriju, izmantojot dihlordihidrofluoresceīna diacetātu (DCFDA) UV stāvoklī. Ir plaši zināms, ka antioksidants nomāc šūnu stresa faktorus, kavējot ROS veidošanos [54]. Rezultāts parādīja, ka apstrāde ar Q-3-G koncentrācijās 5 un 10 μM samazināja UVB izraisītās ROS līmeni (2.j attēls). Kopumā šie dati liecināja, ka Q-3-ir ādai aizsargājošas īpašības, piemēram, pretiekaisuma un antioksidanta iedarbība pret H2O vai UVB izraisītu oksidatīvo stresu un iekaisumu HaCaT šūnās.
![A level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s or incubated with H2O2 (500 µM) with or without Q-3-G (5–10 µM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 µM) was reacted with 2,2- diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s with or without Q-3-G (5–10 µM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) and Q-3-G (0-10 µM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2 , DPPH, or ABTS)](/Content/uploads/2022842169/202203211108455bff4d0223ef483dbe3172e2d3349d71.png "A level of Nrf2 was determined by quantitative realtime PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3) and Q-3-G (0-10 μM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2, DPPH, or ABTS). 2.2. Antimelanogenesis Effect in B16F10 and Moisturizing Effect in HaCaT Cells of Q-3-G To examine the effects of Q-3-G on melanogenesis, the melanoma cells were treated with α-MSH for 48 h to secrete melanin in B16F10 cells. By employing MTT assays, we first confirmed that Q-3-G had no cytotoxicity in B16F10 cells at concentrations up to 20 μM for 48 h (Figure 3a). This result showed, for the next assessments that the effects of Q- 3-G in B16F10 were not due to cell death. Next, we evaluated B16F10 with Q-3-G and α- MSH for 48 h to determine the effects of Q-3-G on melanogenesis. As shown in Figure 3b, Q-3-G significantly inhibited melanin secretion. The positive control arbutin also significantly decreased melanin secretion. The skin moisture-related molecule is hyaluronic acid (HA). As previously mentioned, HA, distributed throughout the epidermis and dermis, is an NMF that enhances skin hydration [55]. We used a reverse transcription PCR (RT-PCR) assay to examine the transcription level of HAS-1 after 12 h with a concentration of Q-3-G of up to 30 μM. HAS promotes the accumulation of intermediate-sized HA within keratinocytes [12]. As shown in Figure 3c, the expression of HAS-1 was increased by treatment with Q-3-G up to 10 μM. In addition to the moisturizing factor, we also examined the expression of FLG and TGM- 1. We used retinol as a positive control group. The transcription levels of FLG and TGM-1 increased notably after treatment with Q-3-G at concentrations up to 10 μM (Figure 3d). Figure 2. Anti-inflammatory and antioxidant effects of Q-3-G. (a) Treatment of HaCaT cells with various concentrations of Q-3-G (0–20 µM) for 24 h, using a conventional MTT assay to determine cell viability. (b) HaCaT cells irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s in the absence or presence of Q-3-G (0–20 µM), followed by incubation for 24 h. A conventional MTT assay was used to determine cell viability. (c,d) HaCaT cells were treated with Q-3-G (5, 10 µM) and UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) for 24 h. The representative cell morphology of Q-3-G against UVB was observed via microscopy, and the number of cells was then plotted. (e,f) Anti-inflammatory effect of Q-3-G in HaCaT cells. The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s or incubated with H2O2 (500 µM) with or without Q-3-G (5–10 µM) and further incubated for 12 h. The mRNA expression levels of COX-2 (e) and TNF-α (f) were determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (g–j) Antioxidant effect of Q-3-G in HaCaT cells. Q-3-G (0–40 µM) was reacted with 2,2- diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 517 nm was measured spectrophotometrically (g). Q-3-G was reacted with 2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonic acid (ABTS) at different concentrations in the dark at 37 ◦C for 30 min. The absorbance at 730 nm was measured spectrophotometrically (h). Ascorbic acid was used as a control substance. (i) The HaCaT cells were irradiated with UVB (30 mJ/cm3 ) for 10 s with or without Q-3-G (5–10 µM) and after incubating for 12 h, the mRNA level of Nrf2 was determined by quantitative real-time PCR. GAPDH was used as a housekeeping gene. (j) The representative result of intracellular ROS production was measured by flow cytometry using DCFDA staining in HaCaT cells with or without UVB irradiation (30 mJ/cm3 ) and Q-3-G (0-10 µM) were treated for 24 h. Results (a,b,d–i) are expressed as mean ± SD. # p < 0.05 and ## p < 0.01 compared to normal group (no treatment), and * p < 0.05 and ** p < 0.01 compared to inducer alone (UVB, H2O2 , DPPH, or ABTS)")
2.2. Antitimelanoģenēzes efekts B16F10 un mitrinošs efekts Q-3-G HaCaT šūnās
Lai pārbaudītu O-3-G ietekmi uz melanoģenēzi, melanomas šūnas tika apstrādātas ar -MSH 48 stundas, lai izdalītu melanīnu B16F10 šūnās. Izmantojot MTT testus, mēs vispirms apstiprinājām, ka Q-3-G nebija citotoksicitātes B16F10 šūnās koncentrācijās līdz 20 μM 48 stundas (3.a attēls). Šis rezultāts parādīja, ka nākamajos novērtējumos O-3-G ietekme uz B16F10 nebija saistīta ar šūnu nāvi. Pēc tam mēs novērtējām B16F10 ar Q-3-Gand -MSH 48 h, lai noteiktu Q-3-G ietekmi uz melanoģenēzi. Kā parādīts 3.b attēlā, Q-3-G ievērojami kavēja melanīna sekrēciju. Pozitīvās kontroles arbutīns arī ievērojami samazināja melanīna sekrēciju.
Ar ādas mitrumu saistītā molekula ir hialuronskābe (HA). Kā minēts iepriekš, HA, kas izplatās visā epidermā un dermā, ir NMF, kas uzlabo ādas mitrināšanu [55]. Mēs izmantojām reversās transkripcijas PCR (RT-PCR) testu, lai pārbaudītu HAS-1 transkripcijas līmeni pēc 12 stundām ar Q-3-G koncentrāciju līdz 30 uM. HAS veicina vidēja izmēra HA uzkrāšanos keratinocītos [12]. Kā parādīts 3.c attēlā, HAS-1 ekspresija tika palielināta, apstrādājot ar Q-3-G līdz 10 μM. Papildus mitrinošajam faktoram mēs pārbaudījām arī FLG un TGM{{ ekspresiju. 13}}. Mēs izmantojām retinolu kā pozitīvu kontroles grupu. FLG un TGM-1 transkripcijas līmeņi ievērojami palielinājās pēc apstrādes ar Q-3-G koncentrācijās līdz 10 μM (3.d attēls). Šie atklājumi liecina, ka Q-3-G HaCaT šūnās ir ādas mitrināšanas aktivitāte. Turklāt, izmantojot SB203580 (p38 inhibitoru), SP600125 (JNK inhibitoru), UO126 (ERK inhibitoru) un Bay11-7082 (NF-kB inhibitoru), mēs pārbaudījām MAPK un NF-kB signālu ceļu iesaistīšanos mitrināšanā. Q-3-G apstrādāto HaCaT šūnu faktors. Pamatojoties uz O-3-G inducēto gēnu ekspresiju, gan TGM-1, gan FLG līmenis tika samazināts, ārstējot ar SP600125, JNK inhibitoru (3.e attēls), kas liecina, ka JNK ir nepieciešams, lai palielinātu ekspresiju. TGM-1 un FLG attiecībā uz O-3-G ādu mitrinošo efektu. Turklāt FLG ekspresiju samazināja arī Bay11-7082, IKK un IkB inhibitors, kas liecina, ka Q-3-G farmaceitiskais mehānisms arī varētu piederēt NF-kB signalizācijas ceļam.
2.3. Ar mitrināšanu saistīti Q-3-G signalizācijas ceļi, aktivizējot AP-1 un NF-kB
Pamatojoties uz iepriekšējiem mRNS rezultātiem, mēs izvirzījām hipotēzi, ka AP-1 un NF-kB signālu iesaistīšanās Q-3-G hidratācijas efektā var notikt arī olbaltumvielu līmeņos. Izmantojot Western blot testu, mēs pārbaudījām AP-1 un NF-kB augšupējo molekulu fosforilēšanos. Pirmkārt, AP-1 ceļā c-Jun fosforilācija tika palielināta pēc HaCaT šūnu inkubācijas ar Q-3-G 24 stundas (4.a attēls). P-INK līmenis palielinājās arī pēc apstrādes ar Q-3-G koncentrācijās 2,5, 5 un 10 μM. Kopējā JNK forma nemainījās (4.b attēls). Tālāk mēs pētījām MKK4 un TAK-1, kas ir JNK augšupējie regulatori, fosforilāciju. Kā parādīts 3.c attēlā, pēc HaCaT šūnu apstrādes ar O-3-G tika paaugstināts arī p-MKK4 un p-TAK1 proteīna līmenis.
Papildus NF-kB signalizācijai Q-3-G palielināja p50 un p65, NF-kB apakšvienības, fosforilāciju (4.c attēls). Turklāt mēs novērtējām IKK un IkBa aktivizāciju, kas arī tika palielinātas par Q-3-G līdz 10 uM, salīdzinot ar kontroles grupu (4.d attēls). Galu galā mēs noteicām augšpus esošo molekulu aktivāciju, kas iesaistītas NF-KB signalizācijas ceļā. Src un Akt (Ser473) fosforilēšana tika uzlabota ar O-3-G apstrādi (4.e attēls). Kopumā šie dati liecina, ka Q-3-G ādas aizsardzības iedarbība ir vērsta uz TAK1 un Src aktivāciju, paaugstinot proteīna līmeni, tādējādi paaugstinot attiecīgi AP-1 un NF-kB aktivitāti.
2.4. Q-3-G ietekme uz AP-1 un NF-kB transkripcijas aktivizēšanu
Mēs pētījām Q-3-G šūnu citotoksicitāti cilvēka embrija nieru šūnu līnijas HEK293T šūnās, izmantojot MTT testu (4.f attēls). HEK293T šūnu dzīvotspēja netika būtiski ietekmēta pēc apstrādes ar Q-3-G（2.5-20 μM）, salīdzinot ar neapstrādātām šūnām.
Mēs izmantojām luciferāzes testu, lai noteiktu, vai Q-3-G varētu modulēt NF-kB un AP-1 promotora testus. Mēs apstiprinājām, ka O-3-G palielināja AP-1-mediēto luciferāzes aktivitāti (4.g attēls) un NF-kB mediētās luciferāzes aktivitāti (4.h attēls) atkarībā no koncentrācijas. Šie rezultāti apstiprina, ka AP-1 aktivācija un NF-KB aktivizēšana ir svarīgi Q-3-G farmakoloģiskie mērķi.
Noklikšķiniet uz saites, lai iegūtu papildu informāciju:https://www.xjcistanche.com/news/part-2-anti-inflammatory-antioxidant-moistu-55118278.html
