1. DAĻA No Broomrapes izolēto fenilpropanoīdu glikozīdu (Orobanche Caryophyllacea, Phelipanche Arenaria un P. Ramosa) antioksidantu un antikoagulantu iedarbība

Bartosz Skalski a, Sylwia Pawelec b, Dariusz Jedrejek b, Agata Rolnik a, Rostyslav Pietukhov a,

Renata Piwowarczyk c, Anna Stochmal b, Beata Olas a,*

Ło'd'z Universitāte, Vispārējās bioķīmijas katedra, Bioloģijas un vides aizsardzības fakultāte, 90-236 Ł'od'z, Polija

b Bioķīmijas un kultūraugu kvalitātes katedra, Augsnes zinātnes un augu kultivēšanas institūts, Valsts pētniecības institūts, 24-100 Puławy, Polija

Bioloģiskās daudzveidības pētniecības un saglabāšanas centrs, Vides bioloģijas katedra, Bioloģijas institūts, Jana Kočanovska universitāte, 25-406 Kielce, Polija

Abstrakts

Orobanchaceae holoparazītu augi, tostarpCistanche, Orobanche un Phelipanche spp ir pazīstami ar savu fenilpropanoīdo glikozīdu (PPG) bagātību. Ir konstatēts, ka daudziem PPG savienojumiem piemīt plašs darbību spektrs, piemēram, pretmikrobu, pretiekaisuma, antioksidanta un atmiņas uzlabošana. Lai labāk izpētītu Eiropas slotas urnu (O. Caryophyllaceae – OC, P. Arenaria – PA, P. ramosa – PR) un desmit atsevišķu izolētu fenilpropanoīdo sastāvdaļu bioaktivitātes potenciālu, mēs pētījām to antiradisko iedarbību, aizsargājošo iedarbību pret oksidāciju plazmā in vitro sistēmā un ietekmi uz koagulācijas parametriem. Pārbaudītie ekstrakti uzrādīja 50–70% no Trolox jaudas atslābuma aktivitāti. OC ekstrakts, bagāts aracteoside, bija par vairāk nekā 20% labāks antiradikālais potenciāls nekā PR ekstraktam, kas bija vienīgais, kas saturēja PPG, kam acilblokā trūka B gredzena katehola motīvu. Turklāt tika konstatēts, ka tikai astoņi pārbaudīti PPG uzrādīja antioksidanta potenciālu cilvēka plazmā, kas ārstēta ar H2O2/Fe; tomēr trim pārbaudītajiem PPG papildus antioksidantu īpašībām bija antikoagulantu potenciāls. Šķiet, ka PPG struktūra, jo īpaši acila un katehola motīvu klātbūtne, galvenokārt ir saistīta ar to antioksidantu īpašībām. Šo savienojumu antikoagulantu potenciāls ir saistīts arī ar to ķīmisko struktūru. Atlasītajiem PPG ir potenciāls ārstēt sirds un asinsvadu slimības, kas saistītas ar oksidatīvo stresu.

Lai iegūtu vairāk informācijas, lūdzu, sazinieties ar:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanchetubulosai ir daudz efektu

1. Ievads

Oksidatīvais stress ir plaši pazīstams ar savu negatīvo ietekmi uz dzīvo organismu veselību, tostarp paātrinātu novecošanos un dažiem vēža veidiem. Oksidatīvā stresa rašanās ir saistīta ar traucētu līdzsvaru starp oksidatīvajiem un antioksidatīvajiem mehānismiem (ieskaitot fermentatīvo (katalāzi, glutationa peroksidāzi) un ne-fermentatīvo (glutationa) aizsardzību) ķermeņa šūnās [1]. Reaktīvo skābekļa sugu (ROS), tostarp oksidējošo radikāļu un slēgto čaumalu sugu, pārprodukcija ir viens no galvenajiem oksidatīvā stresa veidošanās mehānismiem. Tomēr ROS izraisītais bioloģiskais efekts lielā mērā ir atkarīgs no koncentrācijas, iedarbības laika un atrašanās vietas. Normālos apstākļos (zema koncentrācija) skābekļa/slāpekļa radikāļiem var būt sekundāro kurjeru loma, bet augstākā līmenī tie var sākt reaģēt ar bioloģiskām struktūrām, piemēram, šūnu membrānām [2]. Starp visām ROS sugām hidroksilgrupa (HO.) nodara vienu no lielākajiem bio-makromolekulu bojājumiem: olbaltumvielas, lipīdus un DNS. Ir zināms, ka oksidatīvajam stresam ir svarīga loma dažādās slimībās, tostarp sirds un asinsvadu slimībās. Asins sistēmas traucējumi ir korelēti un/vai pirms tiem ir mainījušies dažādi hemostāzes un plazmas biomarķieru parametri [1,3].

No otras puses, daudzas dabiskas vielas, piemēram, polifenoli un polinepiesātinātās taukskābes, ir identificētas kā spēcīgi antioksidanti, kas spēj novērst reaktīvo skābekļa sugu veidošanos un/vai samazināties. Savienojumi ar šādām īpašībām ir atrodami daudzos pārtikas produktos un augu izcelsmes farmaceitiskajos preparātos. Tāpēc diēta, kas bagātināta ar svaigiem dārzeņiem un augļiem, un antioksidatīvā terapija, kuras pamatā ir dabiski antioksidanti, ir plaši ieteicama, jo tā var samazināt oksidatīvā stresa līmeni un novērst dažādus patofizioloģiskos procesus [4,5]. Augu polifenoli ir daudzveidīga sekundāro metabolītu grupa, starp kuriem fenolskābes ieņem svarīgu vietu, jo tās ir plaši izplatītas un tām piemīt dažādas bioloģiskās sekas, piemēram, antimikrobiālie līdzekļi, antioksidanti un pretiekaisuma līdzekļi. Fenilpropanoīdie glikozīdi (PPG) ir hidroksicinnamīnskābes esteru de- radinieki, un tie ir galvenā/vienīgā sekundāro metabolītu klase, kas sastopama holoparazītu Orobanchaceae augos, t.sk.Cistanche, Orobanche un Phelipanche spp. Vairākas šīs ģimenes sugas ir nopietni kultūraugu kaitēkļi, no kuriem lauksaimnieki vēlas atbrīvoties laukos (Phelipanche ramosa piemērs), dažas no tām tiek izmantotas farmakoloģijā, bet lielākā daļa no tām ir maz svarīgas cilvēkiem. HerbaCistanchetiek plaši izmantots Āzijas tradicionālajā medicīnā nieru deficīta ārstēšanā un kā imunitāti un atmiņu uzlabojošs, pretnovecošanās un pretfatigu līdzeklis [6]. Dažādu pētniecības grupu fitoķīmiskās analīzes ir parādījušas, ka fenilpropanoīdie glikozīdi, piemēram, acetonīds, ehinacīds un pjedestāla puse, ir viena no galvenajām Herba Cistanche aktīvajām sastāvdaļām [7]. Nesenais pētījums par vairākām slotas sugām, ko Polijā atrada Jedrejek et al. [8], ir parādījis, ka šim augu materiālam ir līdzīgs kvalitatīvais sastāvs (PPG dominēšana), turklāt tas ir vienāds vai pat pārsniedzCistanchespp. attiecībā uz aktīvo vielu saturu [8].

Cistanche deserticola ir daudz efektu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

Šī pētījuma mērķis bija novērtēt trīs slotas urnu ekstraktu (Orobanche Caryophyllaceae – OC, Pheli- panache Arenaria – PA un P. ramosa – PR) antiradisko un antioksidantu potenciālu, kā arī ietekmi uz hemostāzes parametriem, kas bagāti ar dažādiem fenil-

prostanoīdi, kā arī to atsevišķas PPG sastāvdaļas. Antiradikālā spēja tika mērīta, izmantojot 2,2′-azinobis-3-etilbenztiazolīn-6-sulfonskābes/trotoksa ekvivalenta (ABTS/TE) un 2,2-difenil-1-pikrilhibrazila (DPPH) testus. Oksidatīvo spriegumu plazmas testēšanas sistēmā izraisīja, izmantojot hidroksilgrupu (H2O2/Fe), pēc tam lipīdu peroksidāciju (tiobarbitūrskābes reaktīvo sugu (TBARS) testu) un noteica olbaltumvielu karbonilgrupu un tiola grupu līmeni. Starp noteiktajiem hemostāzes parametriem bija: aktivētā parciālā tromboplastīna laiks (APTT), protrombīna laiks (PT) un trombīna laiks (TT).

2. Materiāli un metodes

2.1. Ķīmiskās vielas

2,2-difenil-1-pikrilhidrazilradikāli (DPPH), 2,2′-azinobis-3-eth- ilbenztiazolīn-6-sulfoskābe (ABTS), kālija persulfāts, 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilhromān-2-karboksilskābe (Trokokss), dimetilsulfoksīds (DMSO), tiobarbitūrskābe (TBA), skudrskābe (LC-MS pakāpe) un H2O2 tika iegādāti no Sigma-Aldrich (Sentluisa, MO., ASV). Metanols (HPLC gradienta pakāpe) un acetonitrils (LC-MS pakāpe) tika iegādāti no Merck (Darmštate, Vācija). Desmit fenil-

šajā darbā pārbaudītos propāniskos savienojumus, tostarp 2′-O-acetilakteozīdu (97%), 2′-O-acetilpoliumosmozīdu (98%), 3-O-metilpoliumosmozīdu(96%), acetonīdu (99%), arēnu iekšpusē (97%), renatozīdu (98%), tenipozīdu (99%), poliumozīdu (99%), tubulozīdu A (96%) un wiedemannioside D (96%), mēs iepriekš izolējām no zemāk dotā augu materiāla [8]. Savienojumu tīrību novērtēja, izmantojot UHPLC-PDA-MS analīzi. Īpaši tīrs ūdens tika sagatavots uz vietas, izmantojot Milli-Q ūdens attīrīšanas sistēmu (Millipore Co.). Citi reaģenti bija analītiskas kvalitātes, un tos nodrošināja vietējie komerciālie piegādātāji.

2.2. Augu materiāls

Trīs broomrape sugu, tostarp Orobanche Caryophyllaceae Sm., Phelipanche Arenaria Pomel un P. Ramos (L.) Pomel, ziedošos augus identificēja prof. Renata Piwowarczyk (Jan Kochanowski Uni- versity, Kielce, Polija) un savāca no dabiska avota Polijā.

Kuponu paraugi (O. Caryophyllaceae – Chomento'wek (50.3349◦N, 20.4000◦E), kserotermiskie zālāji, parazitē Galium boreale, 2014. gada maijs; P. Arenaria – Zwierzyniec (50.3652◦N, 22.5801◦E), psammoma- lous zālājs un papuve, parazitē Artemisia campestris, 2014. gada jūnijs;

P. ramosa – Szewce (50.3553◦N, 22.3038◦E), lauks, parazitē Solanum Lycopersicum, 2014. gada septembris) tiek deponēts Jana Kočanovska universitātes Herbārijā Kielce (KTC). Augu materiāls pirms ekstrakcijas tika liofilizēts un smalki sasmalcināts.

2.3. Slotspīļu ekstraktu sagatavošana

Augu pulverveida materiāls (O. Caryophyllaceae (OC) – 2 g, P. Arenaria (PA) – 3 g un P. ramosa (PR) – 3 g) tika ekstrahēts ar 80% MeOH pie 40 ◦C un 1500 psi (šķīdinātāja spiediens), izmantojot ASE 200 paātrinātu

šķīdinātāja ekstraktors (Dionex, Sunnyvale, CA, ASV). Ekstrakti tika iztvaicēti un liofilizēti (Gamma 2–16 LSC saldēšanas žāvētājs, Kristus, Vācija). OC, PA un PR ekstrakcijas efektivitāte bija attiecīgi 55%, 37% un 43% pēc augu materiāla svara. Sakarā ar augsto ogļhidrātu saturu (dati nav parādīti), neapstrādātie ekstrakti tika tālāk attīrīti cietās fāzes ekstrakcijas (SPE) ceļā uz Oasis HLB mikrokolonnu (500 mg; Voterss, Milforda, MA, ASV). Cukuri tika izņemti ar 1% MeOH, pēc tam interesējošie savienojumi tika eluēti ar 80% MeOH. Pēc šķīdinātāja noņemšanas OC, PA un PR ekstrakti tika liofilizēti (Gamma 2–16 LSC saldēšanas žāvētājs), un SPE attīrīšanas iznākums bija 53% (OC), 67% (PA) un 51% (PR).

2.4. Slotlapu ekstraktu fitoķīmiskās īpašības

Broomrape ekstraktu kvalitatīvās un kvantitatīvās analīzes tika veiktas, izmantojot ACQUITY UPLC sistēmu (Ūdeņi), kas savienota ar fotodiodes masīva detektoru (PDA) un tandēma četrkāršā masas spektrometru (TQD-MS/MS). Liofilizēti ŽĀVĒTI OC, PA un PR ekstrakti tika izšķīdināti 50% metanolā koncentrācijā 0,50 mg/ml un pēc tam

hromatogrāfēts BEH C18 kolonnā (100 × 2,1 mm, 1,7 μm, Ūdeņi). Hromatogrāfijas apstākļi bija šādi: krāsns temperatūra – 25 ◦C,

lineārais gradients 10→25% no kustīgās fāzes B (0,1% skudrskābes acetonitrilā) kustīgajā A fāzē (0,1% skudrskābes H2O) 12 min laikā, plūsmas ātrums – 0,4 ml/min, iesmidzināšanas tilpums – 2 μL, UV diapazons – 190–490 nm (3,6 nm izšķirtspēja). MS analīze tika veikta negatīvā jonu režīmā ar elektrospray jonizāciju (ESI), izmantojot šādus iestatījumus: skenēšanas diapazons 100–1200 m/z; kapilārais spriegums 2,8 kV; konusa spriegums 35 V;

avota temperatūra 150 ◦C; desolvācijas temperatūra 450 ◦C; desolvācija

gāzes plūsma 900 L/h un konusa gāzes plūsma 100 L/h. Datu iegūšana un apstrāde tika veikta, izmantojot programmatūru Waters MassLynx 4.1.

Fenilpropanoīdo glikozīdu (PPG) pīķi tika noteikti, salīdzinot iegūtos LC-MS datus ar iepriekš izolētiem savienojumiem [8]. PPG kvantitatīva noteikšana slotapes ekstraktos balstījās uz UPLC-UV metodi ar detektēšanu pie 330 nm un ārējo standarta kalibrēšanu, izmantojotacteoside(Sigma-Aldrihs, 99%, HPLC) kā

grupas standarts. Tika sagatavota lineāra kalibrēšanas līkne sešās koncentrācijās diapazonā no 1 līdz 200 μg/ml un uzrādīja labu linearitāti (R2

0,999). Kvantitatīvie rezultāti atspoguļo trīs injekciju vidējo SN vērtību un tika izteikti miligramosacteosideekvivalenti (eq) uz gramu ekstrakta (mgacteosideeq/g).

2.5. Antiradikālā aktivitāte in vitro

2.5.1. ABTS radikālais skrāpēšanas tests

ABTS antiradikālais tests tika veikts, izmantojot Kontek et al. [9] aprakstīto metodi, ar nelielām izmaiņām šādi: reaģentu pagatavošanai tika izmantoti 20% MeOH (7 mM ABTS un 4,9 mM kālija uz per-

sulfāts); OC, PA un PR ekstraktu šķīdumi četros koncentrācijas līmeņos diapazonā no 100 līdz 400 μg/ml un trotoksa šķīdumi sešos koncentrācijas līmeņos diapazonā no 10 250 μg/ml tika sagatavoti ar 50% MeOH. Parauga attiecība pret ABTS darba šķīdumu bija 1:25 (v/v). Absorbcija pie 734 nm tika mērīta pēc 30 min inkubācijas

tumsā, izmantojot UV–vis spektrofotometru (Evolution 260 Bio,

Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, ASV).

Absorbcijas inhibīcija (%) tika aprēķināta šādi: [(Absecon-

trol–Abssample)/Abscontrol] ×100.

Tika aprēķināti slotapes ekstraktu trotoksa ekvivalenti (TE)

izmantojot formulu TE = msample/mstandard, kur m ir taisnes slīpums

līniju līknes (absorbcijas inhibīcija pret koncentrāciju). TE vērtība ir

paraugs apraksta tā normalizēto aktivitāti pret Trolox (TEstandard =

1.0). OC, PA un PR ekstraktu un troroksu IC50 vērtības bija

sasniegts eksperimentāli, tad tika aprēķināts no to taisnās līnijas

līknes (absorbcijas inhibīcija pret koncentrāciju) un ir izteiktas

μg/ml.

Tests tika veikts trijos eksemplāros, un rezultāti ir parādīti

kā ± standartnovirzēm (SN).

2.5.2. DPPH radikālais skrāpēšanas tests

DPPH antiradikālais tests tika veikts, izmantojot metodi, kas aprakstīta Jedrejek et al. [8] un Brand-Williams et al. [10], ar nelielām izmaiņām šādi: OC, PA un PR ekstraktu šķīdumi četros koncentrācijas līmeņos diapazonā no 50▽ 250 μg/ml, un trotrotoksa šķīdumi pie sešiem koncentrācijas līmeņiem diapazonā no 10▽ 250 μg/ml, tika sagatavoti ar 50% MeOH. Izlases īpatsvars DPPH bija 1:19 (v/v). Absorbcija pie 517 nm tika mērīta pēc 30 min inkubācijas tumsā, izmantojot UV–vis spektrofotometru (Evolution 260 Bio). Absorbcijas inhibīciju (%) aprēķināja šādi: [(Absecontroll–Abssample)/Abscontrol] ×100. Testa paraugu trolox ekvivalentās (TE) un IC50 vērtības aprēķināja tādā pašā veidā kā ABTS testā (2.5.1. iedaļa). Tests tika veikts trijos eksemplāros, un rezultāti tiek parādīti kā līdzekļi, ± SD.

2.6. Testēto augu savienojumu izejas šķīdumi un ekstrakti eksperimentiem ar cilvēka plazmu

Pārbaudīto savienojumu un augu ekstraktu izejas šķīdumi tika sagatavoti 50% DMSO. DMSO galīgā koncentrācija pārbaudītajos paraugos bija zemāka par 0,05%, un tā ietekme tika noteikta visos eksperimentos.

2.7. Cilvēka plazmas izolācija

Cilvēka asinis jeb plazma tika iegūta no sešiem regulāriem donoriem (nesmēķējošiem vīriešiem un sievietēm) asins bankā (Lodza, Polija) un medicīnas centrā (Lodza, Polija). Asinis tika savāktas kā CPD šķīdums (citrāts/fosfāts/dekstroze; 9:1; v/v asinis/CPD) vai CPDA šķīdums (citrāts/fosfāts/dekstroze/adenīns; 8.5:1; v/v; asinis/CPDA). Donori vismaz divas nedēļas pirms ziedošanas nebija lietojuši nekādus medikamentus vai atkarību izraisošas vielas (ieskaitot tabaku, alkoholu un antioksidantu piedevas). Mūsu asins paraugu analīze tika veikta saskaņā ar Helsinku Deklarācijas par cilvēku pētniecību vadlīnijām, un to apstiprināja Lodzas Universitātes Cilvēku eksperimentu pētījumu ētikas komiteja. Plazmu sagatavoja, centrifugējot svaigas cilvēka asinis 4500x g temperatūrā 25 min istabas temperatūrā. Olbaltumvielu koncentrāciju aprēķināja, izmērot pārbaudīto paraugu absorbciju pie 280 nm saskaņā ar Whitaker un Granum procedūru [11].

2.8. Oksidatīvā stresa marķieri cilvēka plazmā

2.8.1. Lipīdu peroksidācijas mērīšana

Plazmas lipīdu peroksidāciju kvantificēja, izmērot tiobarbitūrskābes reaktīvo vielu (TBARS) koncentrāciju. TBARS koncentrācija tika aprēķināta, izmantojot molārās ekstinkcijas koeficientu (ε = 156 000 M 1 cm 1 ). Metode ir aprakstīta pamatīgāk, citādi bija [12,13]. 2.8.2. Karbonilgrupas mērījums Karbonilgrupu līmenis tika aprēķināts, izmantojot molāro ekstinkcijas koeficientu (ε = 22 000 M 1 cm 1 ), un tika izteikts kā nmol karbonilgrupas/mg plazmas olbaltumvielu, saskaņā ar Bartosz [13] un Levine et al. [14]. 2.8.3. Tiola grupas noteikšana Tiola grupas saturs plazmas proteīnos tika mērīts spektrofotometriski, izmantojot SPECTROstar Nano Microplate Reader (BMG LABTECH, Vācija), absorbējot pie 412 nm ar 5,5′ -ditiola-bis-(2- nitrobenzoskābi). Metode ir sīkāk aprakstīta citur [15–17].

2.9. Hemostāzes parametri

2.9.1. Protrombīna laika (PT) mērīšana

PT tika noteikts koagulometriski, izmantojot optisko koagulāciju

Burti norāda Tukey testa rezultātus (p< 0.05),="" values="" with="" the="">

burts pēc kārtas būtiski neatšķiras.

2.9.2. Trombīna laika (TT) mērīšana

TT tika noteikts koagulometriski, izmantojot optisko koagulācijas analizatoru (modelis K-3002, Kselmed, Grudziadz, Polija) saskaņā ar Malinowska et al. aprakstīto metodi [18].

2.9.3. Aktivētā parciālā tromboplastīna laika (APTT) mērīšana

APTT tika noteikts koagulometriski, izmantojot K-3002 optiskās koagulācijas analizatoru (Kselmed, Grudziadz, Polija) saskaņā ar Malinow ska et al. [18].

2.10. Datu analīze Q-Dixon tests tika veikts, lai novērstu neskaidrus datus.

Dati tika pārbaudīti normālai izplatībai ar Šapiro-Vilka testu un dispersijas vienlīdzību ar Levēna testu. Statistiski nozīmīgas atšķirības tika identificētas, izmantojot ANOVA, kam sekoja Tukey vairāku salīdzinājumu tests vai Kruskal-Wallis tests. Salīdzinājumi tika uzskatīti par nozīmīgiem pie p< 0.05.="" the="" values="" are="" presented="" as="" means="" ±="">