1. DAĻA Cistanche Deserticola polisaharīds inhibē OVX izraisītu kaulu zudumu pelēm un RANKL izraisītu osteooklastoģenēzi

1. Ievads

Osteoporoze — slimība, kurai raksturīga samazināta kaulu masa, patoloģiska kaulaudu mikrostruktūra, palielināts kaulu trauslums un lūzumi (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli un Ginaldi, 2006. gads) — pašlaik skar vairāk nekā 200 miljonus cilvēku visā pasaulē un ir nozīmīga medicīniska un sociālekonomiskais slogs mūsdienu sabiedrībai (Strom et al., 2011). Osteoporozes klīniskā ārstēšana galvenokārt ir vērsta uz hormonu aizstājterapiju, bisfosfonātu vai denosumaba terapiju. Šīs metodes ir efektīvas, taču rada ilgtermiņa blakusparādības, piemēram, potenciālu krūts vēža un netipisku augšstilba kaula lūzumu risku (Black, Bauer, Schwartz, Cummings un Rosen, 2012; Rachner, Khosla un Hof-Bauer, 2011). Tāpēc ir steidzami jāizpēta zāles, kas var ne tikai inhibētosteoporozebet arī mazāk nevēlamu blakusparādību.

Cistanche deserticola(CD), tonizējoša un ārstnieciska pārtika, ko plaši izmanto Ķīnā, kas pazīstama kā "tuksneša žeņšeņs", ir žāvēts sulīgs kāts ar zvīņlapām.C. deserticolaYC Ma (Gu, Yang un Huang, 2016), un tam ir daudzveidīga un efektīvafarmakoloģiskāaktivitātespiemēram, imūnregulācija, antioksidācija un anti-osteoporozeīpašības (Hu et al., 2020; Li et al., 2012; Zhang et al., 2014). Iepriekšējie pētījumi par CD aktīvajām vielām osteoporozes ārstēšanā galvenokārt koncentrējās uzfeniletanoīdsglikozīdi(Li, Jiang un Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao un Ma, 2017). Tomēr kompaktdiskā ir arī citi efektīvi komponenti, piemēram, iridoīdi, lignāni,polisaharīdi(Wang, Zhang un Xie, 2012). Tradicionālās ķīniešu medicīnas (TCM) klīniskais pielietojums galvenokārt ir ūdens attīrīšana.Polisaharīdiir ūdenī šķīstošas ​​sastāvdaļas un, visticamāk, ir galvenās TCM farmakodinamiskās sastāvdaļas. Tiek ziņots, ka no TCM ekstrahētajiem polisaharīdiem ir anti-osteoporozeefektu un dažas nevēlamas blakusparādības, kuras parasti izmanto klīnikās (piemēram, polisaharīdi, kas iegūti no Epimedium brevicornum (Zheng, He, Wu, Cai un Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang un Yan, 2018) un Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Tāpēc mēs izvirzījām hipotēziCistanche deserticolapolisaharīds(CDP), kas iegūts no CD, var būt potenciāli drošas zāles osteoporozes ārstēšanai.

Parasti kaulu rezorbcija un kaulu veidošanās saglabā dinamisku līdzsvaru kaulu remodelācijas laikā, sadarbojoties ar vairāku veidu šūnām, tostarp osteoklastiem, osteoblastiem, kaulu apvalka šūnām un osteocītiem (Kular, Tickner, Chim un Xu, 2012). Šī līdzsvara pārrāvums var izraisīt dažādas kaulu vielmaiņas slimības, piemēram,osteoporoze(Zhu et al., 2018) un osteosklerozi (Ihde et al., 2011). Osteoklasti kā gala diferencētas šūnas, kas iegūtas no mononukleāro/makrofāgu līnijas, ir vienīgās šūnas ar kaulu rezorbcijas funkciju (Teitelbaum, 2000). Ir divi galvenie citokīni, kas piedalās osteoklastu diferenciācijā un nobriešanā (Koga et al., 2004): makrofāgu koloniju stimulējošais faktors (M-CSF) un kodolfaktora κB (NF-κB) liganda (RANKL) receptoru aktivators. M-CSF veicina hematopoētisko cilmes šūnu diferenciāciju par osteoklastu priekštečiem un veicina osteoklastu diferenciāciju, pārregulējot RANK receptoru ekspresiju (Takayanagi, 2007). RANKL un RANK saistīšanās ar osteoklastu šūnu virsmu izraisa sekojošo: (1) signalizācijas adaptera molekulu, piemēram, TNF receptoru asociētā faktora 6 (TRAF6) piesaisti; (2) vairāku pakārtotu mērķu, tostarp NF-κB un mitogēnu aktivēto proteīnkināžu (MAPK) aktivizēšana; un (3) aktivēto T-šūnu, citoplazmas 1 (NFATc1) kodolfaktora ekspresijas līmeņa regulēšana (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). Šo signalizācijas ceļu aktivizēšana tieši regulē osteoklastu gēnu, tostarp skābes fosfatāzes 5 (Acp5) [kodē pret tartrātu rezistentu skābo fosfatāzi (TRAcP)], matricas metaloproteināzes 9 (MMP9) un katepsīna K (CTSK) (Boyle, Simonet) ekspresiju. un Lacey, 2003). Tāpēc RANKL izraisītu osteoklastu diferenciācijas signālu ceļu inhibīcija ir potenciāla osteoporozes terapeitiskā metode.

Šajā pētījumā mūsu mērķis bija noteikt CDP ārstēšanas ietekmi uz olnīcu izņemšanu (OVX)osteoporozepeles modelis in vivo un uz RANKL izraisītu osteoklastu aktivitāti in vitro, koncentrējoties uz osteoklastu specifisko gēnu ekspresiju un NFATc1 aktivizēšanu un NF-κB un MAPK signalizācijas ceļiem. Mūsu atklājumi var sniegt jaunu ieskatu CDP kā drošas un efektīvas zāles osteoporozes ārstēšanai potenciālā.

Lai iegūtu vairāk informācijas, lūdzu, sazinieties ar:Joanna.jia@wecistanche.com

Polisaharīdam Cistanche deserticola ir daudz ietekmes uz osteoporozi. Noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

2. Materiāli un metodes

2.1. Ķimikālijas un paraugu ņemšana

CD (nr. 180801) iegādājās no Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, Ķīna), un to identificēja profesors Haibo Huangs no Guandžou Ķīniešu medicīnas universitātes Farmācijas zinātņu skolas, Guandžou, Ķīna. Estradiola valerāta tabletes tika iegādātas no Bayer (Leverkūzene, Ziemeļreina-Vestfālene, Vācija). Alfa modificēta minimālā būtiska vide

(-MEM) un liellopu augļa serums (FBS) tika iegūti no Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV). Penicilīns / streptomicīns un TRAcP krāsošanas komplekts tika iegūti no Solarbio (Pekina, Ķīna). Rekombinantās peles M-CSF un rekombinantās peles RANKL ieguva no R&D Systems (Mineapolisa, MN, ASV). Ar hidroksiapatītu pārklātas plāksnes iegādājās no Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, ASV). Primārās antivielas pret NFATc1 un CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ASV); IκB-, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK un P-JNK (šūnu signalizācijas tehnoloģija, Danvers, MA, ASV); tika iegūts arī -aktīns (CWBIO, Pekina, Ķīna). Pārējie šajā pētījumā izmantotie reaģenti bija analītiskas kvalitātes, un ūdens tika attīrīts ar Milli-Q ūdens attīrīšanas sistēmu (Millipore, Bedford, MA, ASV).

2.2. CDP ekstrakcija

CD tika samalts līdz smalkam pulverim un trīs reizes sajaukts ar petrolēteri, lai to iznīcinātu. Cietais atlikums tika savākts filtrējot un pēc tam žāvēts istabas temperatūrā. Thepolisaharīditika ekstrahēti no iepriekš apstrādātajiem paraugiem trīsreiz ar ūdeni 2 stundas, koncentrēti, izgulsnēti, pievienojot bezūdens etanolu līdz galīgajai koncentrācijai 80% (v/v), un uzglabāti 4 ◦C 24 stundas. Nogulsnes tika savāktas, centrifugējot ar ātrumu 3000 apgr./min 20 minūtes, izšķīdinātas destilētā ūdenī un attīrītas (brīvo proteīnu noņemšana), izmantojot Sevag metodi (Zhao et al., 2019). Atveseļojušiespolisaharīditika dializēti, žāvēti un uzglabāti līdz turpmākai lietošanai. Turklāt ķīmiskā sastāva rezultāti parādīja, ka kopējais cukura, uronskābes, sulfātu un olbaltumvielu saturs CDP bija 67.63 0.98 procenti , 21.05 0.49 procenti , 1.{{7 }}.24 procenti un 8.{10}}.36 procenti .

CDP monosaharīdu sastāvs un Furjē transformācijas infrasarkanā analīze ir parādīti 1. un 2. papildu attēlā.

2.3. OVX izraisītas osteoporozes peles modelis

Visus eksperimentus ar dzīvniekiem apstiprināja Guandžou Ķīnas medicīnas universitātes Dzīvnieku ētikas komiteja (apstiprināta SYXK 2019-0202). Trīsdesmit 6-nedēļas vecas C57BL/6 peļu mātītes piegādāja Guandžou Ķīniešu medicīnas universitātes Eksperimentālo dzīvnieku centrs. Pēc 1 nedēļas ilgas aklimatizācijas vienai peļu grupai tika veikta fiktīva operācija (viltinājuma grupa), bet pārējām pelēm tika veikta olnīcu izņemšanas operācija (OVX grupa). Pēc operācijas pelēm ļāva atveseļoties 1-nedēļu. Pēc tam veiksmīgi modelētās peles tika nejauši sadalītas 5 grupās ar 6 pelēm katrā grupā:

(1) fiktīva grupa: apstrādāta ar destilētu ūdeni, (2) OVX grupa: apstrādāta ar destilētu ūdeni, (3) OVX E2 grupa (E2): apstrādāta ar 0.13 mg/kg estradiola valerāta tabletēm, (4) ) OVX CDP zemas devas grupa (CDP-L): apstrādāta ar 300 mg/kg CDP, (5) OVX CDP lielas devas grupa (CDP-H): apstrādāta ar 600 mg/kg CDP. Destilēts ūdens, E2 vai CDP tika ievadīts ar zondi vienu reizi dienā. Visas peles tika nogalinātas pēc 12- nedēļas ilga ārstēšanas perioda (1. A attēls). Dzemdes tika savāktas un nosvērtas, un kreisais stilba kauls tika savākts turpmākajiem izmeklējumiem. Tika savākti veseli asins paraugi un centrifugēti ar ātrumu 5000 apgr./min

15 min 4 ◦C temperatūrā. Seruma supernatanti tika aspirēti un uzglabāti plkst

-80 ◦C līdz turpmākai analīzei.

2.4. Mikrodatortomogrāfijas (mikro-CT) analīze un kaulu histomorfometrija

Kreisais stilba kauls tika fiksēts ar 4% paraformaldehīdu 48 stundas un pēc tam ievietots centrifūgas mēģenēs, kas satur normālu fizioloģisko šķīdumu. Fiksētie paraugi tika skenēti ar Skyscan 1172 mikro-CT instrumentu (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Beļģija), izmantojot šādus iestatījumus: spriegums, 80 kV; avota strāva, 100 μA; Al, 0,5 mm filtrs; pikseļu

izmērs, 9,76 μm; un rotācijas solis, 0.6◦. Vairāki parametri

trabekulārais kauls, ieskaitot kaulu minerālo blīvumu (KMB), kaulu tilpuma frakciju (BV/TV), kaula virsmu uz kopējo tilpumu (BS/TV), trabekulāro skaitu (Tb. N) un trabekulāro atstatumu (Tb. Sp), tika mērīts, izmantojot CT- Analyser® programmatūra (Bruker micro-CT, Skyscan). Trīsdimensiju attēli tika ģenerēti, izmantojot CTVol programmatūru (Bruker micro-CT. Skyscan).

Pēc mikro-CT analīzes kreisais stilba kauls tika atkaļķots 14% EDTA šķīdumā un iestrādāts parafīnā, lai veiktu sekcijas. Pirms hematoksilīna un eozīna (H&E) un TRAcP krāsošanas eksperimentiem, izmantojot mikrotomu, paraugi tika sagriezti 5 µm sekcijās. Krāsotās sekcijas tika pārbaudītas un dokumentētas, izmantojot Olympus CX 31 mikroskopu (Olympus Optical Co., Ltd, Tokija, Japāna).

Cistanchevar palielināt kaulu blīvumu un atvieglot osteoporozi

2.5. Seruma analīze

Kalcija (Ca) un fosfora (P) koncentrācijas tika noteiktas saskaņā ar komplekta instrukcijām, ko izstrādājis Nanjing Jiancheng Bioinženierijas institūts (Nanjing, Ķīna). TRAcP-5b un RANKL līmenis serumā tika analizēts, izmantojot attiecīgi TRAcP-5b ELISA komplektu (CUSABIO, Uhaņa, Ķīna) un RANKL ELISA komplektu (Cloud-CloneCorp., Vuhana, Ķīna).

2.6. In vitro osteoklastoģenēzes tests

BMM tika izolēti no stilba kaula un augšstilba kaula 6-nedēļu vecām C57BL/6 peļu mātītēm. Izolētās šūnas tika kultivētas -MEM barotnē, kas satur 25 ng/ml M-CSF, 10 procentus FBS un 1 procentu penicilīna/streptomicīna. Sasniedzot saplūšanu, BMM (1 104 šūnas/iedobē) tika iesētas 96-iedobju plāksnēs un apstrādātas ar CDP 50 ng/ml RANKL klātbūtnē. Barotne un CDP tika nomainīti ik pēc 2 dienām. Pēc 7 dienām šūnas tika fiksētas ar 4% paraformaldehīdu un iekrāsotas TRAcP klātbūtnei. Osteoklastu skaits, kas definēts kā TRAcP pozitīvas šūnas ar trim vai vairāk kodoliem, tika skaitīts un dokumentēts, izmantojot gaismas mikroskopu.

2.7. Šūnu proliferācijas tests

BMM (1 × 104 šūnas/iedobē) iesēja 96-iedobes plāksnē un inkubēja nakti. Pēc tam šūnas 48 stundas apstrādāja ar dažādu CDP koncentrāciju (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 un 40 µg/ml). Šūnu saplūšana tika atklāta un analizēta, izmantojot IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, ASV), ilgtermiņa, reāllaika dinamisku dzīvu šūnu attēlveidošanas sistēmu.

2.8. Hidroksiapatīta rezorbcijas tests

BMM ({0}} šūnas/iedobē) tika iesētas ar hidroksiapatītu pārklātā plāksnē, apstrādātas ar CDP norādītajās koncentrācijās (0, 5 un 10 µg/ml) un kultivētas pilnā -MEM. kas satur 25 ng/mL M-CSF un 50 ng/mL RANKL. Pēc 7 dienām šūnas tika mazgātas ar 10 procentu balinātāja šķīdumu, lai noņemtu šūnu sastāvdaļas. Hidroksiapatīta rezorbcijas zonu attēli tika uzņemti, izmantojot IncuCyte ZOOM®, un analizēti, izmantojot ImageJ programmatūru (NIH, Bethesda, MD, ASV) (Abramoff, Magelhaes un Ram, 2003).

2.9. RNS izolācija un reālā laika reversās transkripcijas kvantitatīvā PCR (RT-qPCR) analīze

BMM ({{0}} šūnas/iedobē) tika iesētas 6-iedobes plāksnē un stimulētas ar RANKL un M-CSF CDP klātbūtnē dažādās koncentrācijās (0, 5 un 10). µg/ml) 5 dienas. Kopējā RNS tika izolēta no peļu šūnām vai kaulaudiem, izmantojot TRIzol reaģentu (Sigma-Aldrich). Papildu DNS tika sintezēta no 2 µg kopējās RNS, izmantojot reversās transkriptāzes komplektu (TransGen Biotech, Pekina, Ķīna). RT-qPCR reakcijas tika sagatavotas, izmantojot PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) un noteiktas ar ABI 7500 sistēmu (Applied

Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, ASV). PCR cikla parametri tika iestatīti šādi: 95 ◦ C 5 minūtes, kam sekoja 40 cikli 95 ◦ C 15 s un 60 ◦ C 30 s. Konkrētie izmantotie primeri ir parādīti 1. tabulā, un katra mērķa gēna daudzums tika normalizēts uz GAPDH (iekšējā kontrole).

2.10. Western blot analīze

BMM ({{0}} šūnas/iedobē) tika iesētas 6-iedobes plāksnē. Īsiem laika eksperimentiem šūnas 1 stundu iepriekš inkubēja ar dažādām CDP koncentrācijām (0, 5 un 10 µg/mL) un pēc tam 30 minūtes apstrādāja ar 50 ng/ml RANKL. . Ilgu laiku šūnas tika stimulētas ar 50 ng/mL RANKL 3., 5. un 7. dienā CDP klātbūtnē (0, 5 un 10 µg/ml). Kopējie proteīni tika ekstrahēti, izmantojot RIPA līzes buferi (CWBIO). Olbaltumvielas tika atdalītas ar 10% SDS-PAGE un pārnestas uz PVDF membrānām. Membrānas tika bloķētas ar 5% vājpienu istabas temperatūrā 2 stundas, inkubētas ar primāro

antivielas nakti 4 ◦C temperatūrā un pēc tam ar atbilstošo sekundāro

antivielas 1,5 h. Membrānas tika izstrādātas, izmantojot ECL reaģentus (Millipore Corp., Billerica, MA, ASV), un attēli tika uzņemti, izmantojot Tanon 5200 Chemiluminescence Imaging System (Tanon Science and Technology, Šanhaja, Ķīna).

Cistanchevar palielināt kaulu blīvumu

2.11. NFATc1 translokācijas noteikšana, izmantojot imunofluorescences testu

BMM tika iesēti uz {{0}}iedobju segstikliņiem, stimulēti ar RANKL un M-CSF un apstrādāti ar 10 µg/ml CDP 5 dienas. Šūnas tika fiksētas ar 4% paraformaldehīdu 15 minūtes, trīs reizes mazgātas ar PBS un 10 minūtes caurlaidīgas ar 0,1% Triton X{8}}. Šūnas tika sajauktas ar 10% kazas serumu (CWBIO) un inkubētas 2 stundas. Pēc tam šūnas 1 stundu tumsā inkubēja ar primāro antivielu nakti 4 ◦C temperatūrā un pēc tam ar Alexa Fluor 488 kazu anti-peles sekundāro antivielu (Abcam, Kembridža, MA, ASV). Pārklājumi tika mazgāti ar PBS, uzstādīti Prolong Gold Antifade Reagent ar 4′, 6-diamidino-2-phenyl in-dolu (DAPI) (solar) un

pārbaudīts, izmantojot Zeiss LSM 800 ar Airyscan konfokālo mikroskopu (Carl Zeiss, Oberkochen, Vācija).

2.12. Statistiskā analīze

Visi eksperimentālie dati tika analizēti, izmantojot SPSS 25.{1}} statistikas programmatūru (IBM Corporation, Armonk, NY, ASV). Dati par pētījumiem ar dzīvniekiem un šūnām ir izteikti attiecīgi kā vidējie ± SEM un vidējie ± SD. Rezultāti tiek iegūti, izmantojot vienvirziena dispersijas analīzi vai Stjudenta t-testu. Vērtības p < 0,05="" tika="" uzskatītas="" par="" statistiski="">

Cistanchevar samazinātapoptozeun uzlabo kaulublīvums