1. daļa: Akteozīda kā šūnu aizsarglīdzekļa iedarbība klonēta suņa veidošanā

Ji Hye Lee1☯, Ju Lan Chun1☯, Keun Jung Kim1, Eun Young Kim1, Dong-hee Kim1, Bo Myeong Lee1, Kil Woo Han1, Kang-Sun Park1, Kyung-Bon Lee2, Min Kyu Kim1*

1 Dzīvnieku un piena zinātnes nodaļa, Lauksaimniecības un dzīvības zinātņu koledža, Chungnam National University, Daejeon, Korejas Republika,

2 Izglītības koledžas Bioloģijas izglītības nodaļa,Čonnas Nacionālā universitāte, Gvandžu, Korejas Republika

Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai skatītu 2. daļu

Abstrakts

Somatisko šūnu kodola pārnešana (SCNT) ir labi pazīstama laboratorijas metode. SCNT princips ietver somatiskā kodola pārprogrammēšanu, injicējot somatisko šūnu saņēmējā oocītā, kura kodols ir noņemts. Tāpēc kodola donoru šūnas tiek uzskatītas par izšķirošu faktoru SCNT. Kodola donoru šūnu šūnu cikla sinhronizāciju G0/G1 stadijā var izraisīt kontakta kavēšana vai seruma badošanās. Šajā pētījumāakteozīds, fenilpropanoīda glikozīda savienojums, tika pētīts, lai noteiktu, vai tas ir piemērots šūnu cikla sinhronizācijas ierosināšanai, citoaizsardzībai un SCNT efektivitātes uzlabošanai suņu augļa fibroblastos. Primārie suņu augļa fibroblasti tika ārstēti arakteozīds(10, 30, 50 μM) dažādiem laika periodiem (24, 48 un 72 stundām). Šūnu cikla sinhronizācija G0/G1 stadijā būtiski neatšķīrās ar indukcijas metodi:akteozīdsārstēšana, kontakta kavēšana vai seruma badošanās. Tomēr no šīm trim ārstēšanas metodēm seruma badošanās izraisīja ievērojami paaugstinātu reaktīvo skābekļa sugu (ROS) līmeni (99,5 ± 0,3 procenti ) un apoptozi. To atklāja arī rezultātiakteozīdssamazināja ROS un apoptozes procesus, tostarp nekrozi suņu augļa fibroblastos, un uzlaboja šūnu izdzīvošanu. Suņu augļa fibroblasti, kas ārstēti arakteozīdstika veiksmīgi arestēti G{0}}/G1 posmā. Turklāt rekonstruētie embriji, izmantojot kodola donoru šūnas, kas apstrādātas ar akteozīdu, radīja veselīgu klonētu suni, bet ne embrijus, kas iegūti, izmantojot kodola donoru šūnas, kas pakļautas kontakta kavēšanai. Noslēgumā,akteozīdskodola donoru šūnu inducēta šūnu cikla sinhronizācija būtu alternatīva metode, lai uzlabotu suņu SCNT efektivitāti tās citoprotektīvās iedarbības dēļ.

Cistanche akteozīds var uzlabot imunitāti

Ievads

SCNT tehnika ir izmantota, lai ražotu ģenētiski labākus vai manipulētus dzīvniekus lauksaimniecības nolūkos un kā biomedicīnas resursus. Pieaugot nepieciešamībai pēc slimību dzīvnieku modeļiem, dzīvnieku glābšanai, kuriem draud izmiršana, cilmes šūnām reģeneratīvai medicīnai, orgānu transplantācijai utt., pēdējā laikā pieaug interese par dzīvnieku klonēšanu, izmantojot SCNT [1–5]. Lai gan klonētu dzīvnieku ražošana ir bijusi veiksmīga, SCNT efektivitāte joprojām ir ļoti zema [6]. Zemas SCNT embriju attīstības kompetences cēloņi ietver daudzus faktorus, kas ir saistīti ar recipienta olšūnu kvalitāti, kodola donoru šūnu kvalitāti un surogātmātes stāvokli [7–10].

Ir zināms, ka reaktīvās skābekļa sugas (ROS) un apoptoze ir iesaistītas sieviešu reproduktīvajos procesos, tostarp oocītu attīstībā in vivo un in vitro [11–14]. ROS pārtrauc embriju attīstību, izraisot citoplazmas kondensāciju, DNS bojājumus un apoptozi embrijos. Atbalstošie pētījumi liecina, ka ROS samazināšana uzlabo SCNT embriju attīstības kompetenci in vitro kultivēšanas laikā [15–17]. Apoptoze ir fizioloģisks process, kas notiek spontāni normālas pirmsimplantācijas embrija attīstības laikā, lai uzturētu šūnu homeostāzi, noņemot DNS bojātās / nepareizi funkcionējošās šūnas. ROS izraisa DNS fragmentāciju un palielina apoptotiskos blastomērus, kas traucē embriju attīstību. ROS un apoptozes notikums tiek novērots biežāk pēc SCNT nekā pēc in vitro apaugļošanas [18, 19]. Daudzos pētījumos ziņots, ka SCNT embriju attīstības kompetence tiek izglābta, samazinot ROS un apoptozes līmeni, izmantojot tādus antioksidantus kā selēns [20], insulīns-transferīns-selēns [17, 21], melatonīns [22] un glutations [23].

Iepriekšējie pētījumi ziņoja, ka G{{0}}/G1 stadijā aizturēto donoru šūnu izmantošana uzlaboja SCNT efektivitāti [7, 9, 24–28]. Hromatīns donoru šūnās G0/G1 stadijā tika uzskatīts par visefektīvāko SCNT embriju attīstības kompetencē. Lai sinhronizētu donoru šūnu ciklu, bieži tiek izmantota kontaktu kavēšana, seruma badošanās un ķīmiska apstrāde [7, 25, 29, 30]. Tomēr seruma badošanās samazināja šūnu izdzīvošanu un palielina DNS fragmentāciju, kas izraisa apoptozi [31]. Ķīmiskā inhibīcija ir vēl viena stratēģija šūnu cikla apturēšanai G0/G1 stadijā, izmantojot tādus inhibitorus kā roskovitīns [29, 32], dimetilsulfoksīds (DMSO) [33] un cikloheksimīds (CHX) [34]. Sinhronizācijai izmantotās metodes efektivitāti ietekmē donoru šūnu veidi un sugas. Lai nodrošinātu optimālu donoru šūnu sinhronizāciju, rūpīgi jāizvērtē dažādi izmantoto metožu aspekti.

Akteozīds(pazīstams arī kā verbaskosīds) [{{0}}(3, 4-dihidroksifeniletil)-1-OaL-ramnopiranozil-(1/3)-bD-({{13} }O-kofeoil)-glikopiranozīds] ir izolēts no Syringa vulgaris violetajiem ziediem. Ir zināms, ka augiem, kas satur akteozīdu, piemīt pretmikrobu un pretsēnīšu iedarbība [35–37], un tie novērš iekaisumu. Patiešām, akteozīdam piemīt dažādas bioloģiskas aktivitātes in vitro un in vivo, piemēram, antioksidatīva aktivitāte, antiapoptotiska aktivitāte, citotoksicitāte pret dažādām audzēja šūnām un šūnu cikla sinhronizācija G0/G1 stadijā kā no ciklīna atkarīga. kināzes (CDK) inhibitors [38]. Piemēram, Lī et al.[38] ziņoja, ka ārstēšana ar akteozīdu var kavēt cilvēka promielocītu HL-60 leikēmijas šūnu proliferāciju, izraisot šūnu cikla apstāšanos G0/G1 stadijā. Tomēr ar akteozīdu apstrādāto donoru šūnu ietekme uz suņu SCNT efektivitāti vēl nav pētīta.

Šajā pētījumā ietekme uzakteozīdspar šūnu cikla sinhronizāciju, ROS unapoptozetika pētīti suņu augļa fibroblasti. Šūnu cikla sinhronizācijas, ROS un apoptozes analīze tika veikta, izmantojot fluorescences aktivētu šūnu šķirošanu (FACS). Lai pierādītu ar akteozīdu apstrādāto donoru šūnu efektivitāti, SCNT embriji tika kultivēti un pārnesti uz suni recipientu un veiksmīgi radīja veselīgu klonētu suni.

cistanchevar ārstētnieresslimība uzlabojasnierufunkciju

Materiāli un metodes

Ētikas paziņojums

Šajā pētījumā kā olšūnu donori un embriju pārnešanas surogāti tika izmantotas 44 jauktu suņu mātītes (vecumā no 1 līdz 6 gadiem), bet augļa fibroblastu šūnu līniju izveidošanai tika izmantota bīgla mātīte (vecumā no 2 gadiem). Visus eksperimentus ar dzīvniekiem apstiprināja Čunnamas Nacionālās universitātes Institucionālā dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja (IACUC) (apstiprinājuma numurs: CNU-00487), un tie tika veikti saskaņā ar IACUC publicēto "Laboratorijas dzīvnieku kopšanas un lietošanas rokasgrāmatu". Čunnamas Nacionālajā universitātē. Suņi tika audzēti iekštelpās atsevišķos būros ar temperatūras un ventilācijas kontroles sistēmu. Suņi tika baroti ar komerciālu uzturu reizi dienā un tika nodrošināti ar ūdeni ad libitum. Visos eksperimentos ar dzīvniekiem suņi sākotnēji tika anestēzēti ar 6 mg/kg ketamīna un ksilazīna un uzturēti anestēzijā ar 2% izoflurāna. Operācijas beigās tika ievadītas antibiotikas (prokaīna penicilīns G, benzatīna penicilīns G un dihidrostreptomicīna sulfāts), lai novērstu jebkādu infekciju. Pēc operācijas suņi tika pārvietoti uz saviem individuālajiem būriem ar saldūdeni, uzraudzīti un nodrošināta īpaša atbildīgā veterinārārsta aprūpe, lai varētu veikt nepieciešamo ārstēšanu, ja dzīvniekiem tā bija nepieciešama.

Ķimikālijas

Visas ķīmiskās vielas tika iegādātas no Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, ASV), ja vien nav norādīts citādi. Akteozīds tika iegūts no Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd. Ķīnā.

Suņu augļa fibroblastu izolēšana

Suņu augļa fibroblasti tika iegūti no {{0}}dienu veciem augļiem. Īsumā, bīgla mātīte tika mākslīgi apsēklota ar bīgla tēviņa spermu. Pēc 28 dienām bīgla mātītes grūtniecība tika apstiprināta un ar celiohisterektomiju tika iegūti 5 augļi. Augļi tika mazgāti trīs reizes ar fosfātu buferšķīdumā (PBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, Masačūsetsa, ASV). Augļa galva, iekšējie orgāni un ekstremitātes tika noņemtas ar ķirurģisko asmeni, un pārējās ķermeņa daļas tika sasmalcinātas PBS. Augļu gabalus mazgā divas reizes, centrifugējot ar ātrumu 400 × 5 minūtes, un kultivēja Dulbecco modificētajā ērgļa barotnē (DMEM; Gibco), kas papildināta ar 1 procentu penicilīna-streptomicīna (produkta Nr. P4458) un 20 procentiem liellopu augļa seruma (FBS; Gibco). 39 grādu temperatūrā mitrinātā atmosfērā ar 5 procentiem CO2 un 95 procentiem gaisa. Kad šūnas sasniedza saplūšanu pēc 5–7 dienām, tās 2 minūtes apstrādāja ar 0, 25% tripsīna-EDTA (Gibco) un novāca. No diviem atsevišķiem augļiem tika izveidotas divas suņu augļa fibroblastu šūnu līnijas. Šūnas tika sasaldētas 10% DMSO FBS un uzglabātas šķidrā slāpeklī -196 grādu temperatūrā, līdz tās tika izmantotas.

Šūnu apstrāde

Saldētie suņu fibroblasti tika atkausēti un kultivēti līdz 80 procentu saplūšanai. Šūnas tika novāktas un 4 līdz 7 reizes pasētas turpmākajiem eksperimentiem. Šūnas tika iesētas koncentrācijā 106 / ml 60 mm kultūras trauciņos. Šūnas tika kultivētas (1) DMEM, kas papildināts ar 10 procentiem FBS un 1 procentu penicilīna-streptomicīna piecas dienas (kontakta inhibīcija), (2) DMEM, kas papildināts ar 0,5 procentiem FBS un 1 procentu penicilīna-streptomicīna piecas dienas (seruma bads). vai (3) DMEM, kas papildināts ar 10 procentiem FBS un 1 procentu penicilīna-streptomicīna, kas satur akteozīdu 10 μM, 30 μM vai 50 μM 24 h, 48 h un 72 h (apstrāde ar akteozīdu).

Šūnu cikla analīze ar plūsmas citometriju

Šūnu cikla posmu analīzei šūnas tika novāktas, izmantojot {{0}},25% tripsīna-EDTA, un centrifugējot tās 3 reizes nomazgāja ar PBS. Pēc pēdējās mazgāšanas supernatanti tika izmesti un šūnas atkārtoti suspendētas 0,3 ml PBS. Fiksācijai šūnu suspensijai pa pilienam pievienoja {{10}},7 ml auksta absolūtā etanola, samaisīja ar vieglu virpuļošanu un uzglabāja nakti 4 grādu temperatūrā. Fiksētās šūnas tika centrifugētas un divas reizes mazgātas ar aukstu PBS. Šūnas tika atkārtoti suspendētas 0, 25 ml PBS, kas papildināts ar 5 μL 10 mg / ml RNāzes, un inkubēja 1 stundu 37 grādu temperatūrā. Pēc tam pievienoja 10 μL 1 mg/ml propīdija jodīda (PI). Šūnu cikls tika analizēts, kvantitatīvi nosakot DNS saturu šūnu populācijās G0/G1 (2n), S (starp 2n un 4n) un G2/M (4n) fāzēs, izmantojot FACS Calibur plūsmas citometru (Becton Dickinson, Sanhosē, CA , ASV).

ROS noteikšana ar plūsmas citometriju

ROS dzīvās šūnās tika novērtēts, izmantojot Image-iT™ Live Green Reactive Oxygen Species Detection Kit (Molecular Probes, Eugene, OR, ASV). Īsumā, šūnas tika mazgātas PBS pēc barotnes noņemšanas un tika pievienoti 2 ml 100 μM terc-butilhidroperoksīda (TBHP) darba šķīduma. Pēc inkubācijas 37 grādu temperatūrā 1 stundu TBHP darba šķīdums tika noņemts, un šūnas 3 reizes viegli nomazgāja siltā Dulbecco fosfātu buferšķīdumā (DPBS; Gibco). Pēc tam šūnas tika inkubētas 25 μM 5-(un-6)-karboksi-2,7-dihlordihidrofluoresceīna diacetāta (karboksi-H2DCFDA) darba šķīdumā 37 grādu temperatūrā 30 minūtes tumsā. . Oksidējot, karboksi-H2DCFDA izstaro zaļu fluorescenci, atvieglojot ROS novērtēšanu ar plūsmas citometriju. Kā pozitīvā kontrole tika izmantota TBHP, kas ir ROS ražošanas induktors. Šūnu kodoli tika iekrāsoti ar Hoechst 33342. Pēc 3 reizes mazgāšanas ar PBS, šūnas tika novāktas ar tripsinizāciju, suspendētas PBS un izmantotas ROS noteikšanai, izmantojot FACS Calibur plūsmas citometru (Becton Dickinson, Sanhosē, CA, ASV). ). ROS veidošanās ātrums tika aprēķināts, dalot ROS pozitīvo šūnu skaitu ar kopējo šūnu skaitu un pārvēršot vērtības procentos.

Apoptozes analīze ar plūsmas citometriju

Apoptozes analīze tika veikta, izmantojot Vybran1 Apoptosis Assay Kit #2 (Molecular Probes, Eugene, OR, ASV). Īsumā, šūnas tika novāktas ar tripsinizāciju un 2 reizes mazgātas ar aukstu PBS. Pēc tam šūnām pievienoja 100 μL 1 × aneksīnu saistoša buferšķīduma, 5 μL Alexa Fluor 488 aneksīna V un 1 μL PI. Pēc 15 minūšu inkubācijas istabas temperatūrā pievienoja 400 μL 1 × aneksīnu saistoša buferšķīduma un šūnu suspensiju viegli samaisa. Anneksīnam V, kas ir no Ca2 plus atkarīgs fosfolipīdus saistošs proteīns, ir augsta afinitāte pret fosfatidilserīnu (PS). Dzīvās šūnās PS atrodas uz iekšējās citoplazmatiskās membrānas un tiek pārvietots uz ārējo citoplazmas membrānu apoptotiskajās šūnās. Apoptotiskās šūnas atšķiras ar aneksīnu V, kas marķēts ar Alexa Fluor 488, kas saistās ar PS uz ārējās membrānas. Turklāt PI, kas ir nukleīnskābi saistoša krāsviela, krāso nekrotiskās šūnas ar sarkanu fluorescenci. Tāpēc, izmantojot FACS Calibur plūsmas citometru (Becton Dickinson, Sanhosē, CA, ASV), tika analizētas apoptotiskās šūnas ar zaļu fluorescenci, nekrotiskās šūnas ar sarkanu fluorescenci un dzīvas šūnas ar nelielu fluorescenci vai bez tās. Likmes tika aprēķinātas, dalot dzīvu, nekrotisku vai apoptotisko šūnu skaitu ar kopējo šūnu skaitu un pārvēršot aprēķinātās vērtības procentos.

In vivo nobriedušu oocītu savākšana

Lai noteiktu ovulāciju katram sunim, progesterona (P4) koncentrācija serumā tika mērīta, izmantojot DSL-3900ACTIVE progesteron Coated-Tube Radioimmunoassay Kit (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX, ASV). Kā aprakstīts iepriekš [39, 40], diena, kad P4 koncentrācija pārsniedza 4 ng/ml, tika uzskatīta par ovulācijas dienu. 72 stundas pēc ovulācijas oocīti tika iegūti ar laparotomiju, izmantojot aseptiskas ķirurģiskas procedūras. Olšūna fimbrija tika pietuvināta caur bursa spraugu un kanulēta, izmantojot apgrieztu atloku spuldzes tērauda adatu (18 gabarīts, 7,5 cm). 24 gabarīta intravenozais (IV) katetrs (Angiocath™ Plus, Becton Dickison Korea Inc., Seula, Korea) tika ievietots olšūnas kanālā netālu no dzemdes olvadu savienojuma, un barotne 199 (Gibco), kas papildināta ar 1 procentu penicilīna-streptomicīna un 5 procenti FBS tika ievadīti olšūnā caur IV katetru. Oocīti nekavējoties tika nogādāti laboratorijā. Kopumā no 31 suņa tika savākti 316 oocīti.

Somatisko šūnu kodola pārnešana un embriju pārnešana SCNT tika veikta, kā aprakstīts iepriekš [39]. Īsumā, lai noņemtu gubu šūnas no in vivo nobriedušiem oocītiem, gubu-olšūnu kompleksi (COC) tika atkārtoti pipeti 0,1 procenta hialuronidāzes. Pirmā polārā ķermeņa un metafāzes II hromosomas tika noņemtas ar aspirāciju. Enukleācija tika apstiprināta, krāsojot ar Hoechst 33342 (bisbenzimīdu). Suņu augļa fibroblastus apstrādāja ar 30 μM akteozīdu 48 stundas un pēc tam novāca ar 0,25 procentiem tripsīna-EDTA. Viena šūna, kurai ir gluda šūnu membrāna, tika pārvietota katra enucleated oocīta perivitelīna telpā. Pārpalikumi bija līdzsvarota infūzijas barotne, kas ir 0,26 M mannīta barotne, kas satur 0,1 mM HEPES, 0},5 mM MgSO4 un 0,05 procentus BSA, un kas sapludināta ar diviem impulsiem līdzstrāva (69–75 V uz 15 μs) no Electro-Cell Fusion aparāta (NEPA gene Co., Chiba, Japāna). Šīs kuples inkubēja barotnē 199, kas papildināta ar 10 procentiem FBS 1 stundu 30 minūtes. Sakausētie SCNT embriji tika pārbaudīti un ķīmiskā aktivācija tika ierosināta, inkubējot tos 10 μM kalcija jonoforā (produkta Nr. C7522, Sigma) 4 minūtes. SCNT embriji tika mazgāti un pēc tam ievietoti modificētā sintētiskā olšūnu šķidruma barotnē (mSOF) [41], kas satur 1,9 mM 6-dimetilaminopurīna (6-DMAP) 3 stundas 30 minūtes. Inženierijas embriji tika ķirurģiski pārvietoti ar estrus sinhronizētu surogātu olšūnu vadiem 4 stundu laikā pēc SCNT. Grūtniecība tika apstiprināta ar ultrasonogrāfiju 26 dienas (vis agrāk) pēc embrija pārvietošanas.

Aktīvā sastāvdaļaakteozīdsiekšācistanche

Klonētu embriju kultūra in vitro

Pēc SCNT klonētie embriji tika kultivēti 40 μl mikropilienos modificētas sintētiskas olšūnu šķidruma barotnes (mSOF) (10 klonēti embriji uz mikropili), kas pārklāta ar minerāleļļu 38,5 grādu temperatūrā 5% CO2 un 95% gaisa. SCNT embrija attīstība tika novērota no 2. līdz 8. dienai.

Klonēta suņa mikrosatelītu un mitohondriju DNS analīze

Kopējā DNS tika iegūta no kodola donoru šūnām un olšūnu donoru suņu, surogātu suņu un klonēto suņu ādas, izmantojot G-spin™ genoma DNS ekstrakcijas komplektu (iNtRON BIOTECHNOLOGY, Seongnam, Korea) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. un pēc tam tika eluēts 100 μL TE buferšķīduma (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). DNS daudzums tika mērīts ar BioSpec-nano spektrofotometru (Shimadzu Corp., Japāna).

Mikrosatelītu genotipēšanai tika atlasīti šādi 7 specifiski gēni: PEZ1, PEZ3, PEZ8, PEZ12, FH2010, FH2054 un FH2079. PCR tika veikta ar sākotnējo denaturāciju 10 minūtes 95 grādos, 20 ciklus, kas sastāvēja no denaturācijas 30 s 95 grādos, 30 sek atkausēšanas 58 grādos (-0,1 grāds/cikls), 1 minūtes pagarinājumu plkst. 72 grādi un vēl 15 cikli, kas sastāv no denaturācijas 30 sekundes 95 grādos, 30 sekundes atkvēlināšanas 56 grādos, 1 minūtes pagarinājumu 72 grādos un galīgo pagarināšanu 72 grādos 10 minūtes.

Mitohondriju DNS sekvencēšanai, izmantojot pilnas suņu mtDNS nukleotīdu sekvences (GenBank reģistrācijas Nr.: U96639), tika sintezēti šādi oligonukleotīdu praimeri: Citohroma b reģions (L14,252 –L14,631) F: ACTCATTCCATTGACCTAGGCCATTAGG,GCCRTCATTAGG; Citohroma c oksidāzes II apakšvienība (L7,054—L7,465) F: ATGGCGTACCCATTTCAACT,R: GGATGGTTATTTCTATTGG; 16S rRNS (L2,033–L2,472) F: GCAAAGGTAGCATAATCAT,R: AGGACTTTAATCGTTGAAC; D cilpas reģions (L15,622 – L16,030) F: CATAGGACATATTAACTCAATC,R: AAGTCCAGCTACAAGTTATTTG [42]. Šīs analīzes PCR cikli ietvēra: 95 grādu sākotnējās denaturācijas 5 minūtes, 5 denaturēšanas ciklus 30 s 95 grādos, 40 sec. atkausēšanu 60 grādos (-1 grāds/cikls), 1 minūtes pagarināšanu plkst. 72 grādi un nākamie 30 denaturēšanas cikli 30 sekundes 95 grādos, 40 sekundes atkvēlināšanas 55 grādos, 1 minūte pagarināšana 72 grādos un galīgā pagarināšana 72 grādos 10 minūtes. PCR fragmenti no dažādiem eksperimentiem tika analizēti, izmantojot ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems Inc., ASV). Secības montāža, vairākkārtēja izlīdzināšana un izlīdzināšanas apgriešana kontroles reģioniem tika veikta ar BioEdit programmatūru (v.7.0.5.3).

akteozīdsiekšācistanchevar stiprināt imūnsistēmu