1. daļa: Integrēta tīkla farmakoloģija un Zebrafish modelis, lai izpētītu Cistanche Tubulosa divējādas iedarbības komponentus gan osteoporozes, gan Alcheimera slimības ārstēšanai
Mar 30, 2022
Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Ying-Qi Li 1, Yi Chen 1, Jia-Yi Fang 1, Si-Qi Jiang 1, Ping Li 1, * un Fei Li 1, 2, *
KOPSAVILKUMS
Etnofarmakoloģiskā nozīme:Osteoporoze (OP) un Alcheimera slimība (AD) ir bieži sastopamas vienlaicīgas geriatriskās slimības, un daudzi pētījumi liecina par to patoģenēzes saistību. Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) ir plaši izmantota tradicionālā ķīniešu medicīna, un to plaši izmanto attiecīgi OP un AD ārstēšanai. Tomēr gan vienlaicīgu slimību aktīvās sastāvdaļas, gan pamatā esošie mehānismi ir ierobežoti.
Pētījuma mērķis:Šī darba mērķis bija izveidot efektīvu un uzticamu tīkla skrīninga metodi, lai atrastu divējāda iedarbības savienojumus CT, kas var vienlaikus aizsargāt AD un OP. Un tas sniegs jaunas perspektīvas saiknei starp OP un AD uz molekulārajiem mehānismiem.
Materiāls un metodes:CT divējāda ietekme tika sistemātiski analizēta, integrējot vairākas datu bāzes un plašu analīzi tīkla farmakoloģijas līmenī. Tika izveidots klasificēts zāļu un mērķa mijiedarbības tīkls, lai atklātu dažādu veidu savienojumu iedarbības atšķirības. Lai pierādītu šī tīkla efektivitāti, tika atlasīti daži savienojumi, lai pārbaudītu zebrafish Pre-induced OP modeli un AlCl 3- AD modeli atbilstoši topoloģiskajiem parametriem.
Atslēgvārdi:Tīkla farmakoloģija; Osteoporoze;Alcheimera slimība; Cistanche tubulosa; Zebrafish.
Cistanche ir anti-Alcheimera funkcija.
1. Ievads
Iedzīvotāju novecošanās tendence gadu gaitā palielina osteoporozes (OP) un Alcheimera slimības (AD) izplatību (Parnetti et al., 2019; Rizzoli, 2018). Mūsdienās gan OP, gan AD ir atzīti par galvenajiem draudiem sabiedrības veselībai, jo tie var progresēt bez simptomiem un radīt milzīgu sociālo slogu (Erkkinen et al., 2018; Jonsson et al., 2018). Kā ar vecumu saistītas slimības, tās klīniskajā praksē bieži tiek novērotas vienlaikus ar augstu invaliditātes un mirstības līmeni (Dengler-Crish un Elefteriou, 2019). OP ir sistēmiska skeleta slimība, kam raksturīga zema kaulu masa un traucēta kaulu audu mikroarhitektūra, ar pastiprinātu kaulu trauslumu un paaugstinātu lūzumu risku (Rizzoli, 2018). AD ir visizplatītākā smadzeņu deģenerācija, ko raksturo pakāpenisks atmiņas un citu kognitīvo funkciju zudums (Bondi et al., 2017). Līdz šim joprojām nav pietiekami spēcīgu iespēju, lai novērstu vai izārstētu divas to sarežģītās etioloģijas un patoģenēzes slimības. Un vēl ļaunāk ir tas, ka pacientam biežāk rodas blakusparādības (Brown, 2017; Huang and Mucke, 2012).
Pamatojoties uz sindromu diferenciācijas teorētisko pamatojumu (Sucher, 2013), tradicionālajām ķīniešu zālēm (TCM) ar vairākiem komponentiem, kuru mērķis ir vairāk nekā viens patofizioloģiskais mehānisms, ir unikāls pārākums dažu pazīstamu sarežģītu slimību ārstēšanā. Kā nieres tonizējošu augu Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) tradicionālie ķīniešu ārsti plaši izmanto pret atmiņas zudumu un kaulu atrofisku vājumu (Fu et al., 2018). Papildus tradicionālajai efektivitātei, ievērojami pētījumi parādīja, ka tai ir dažādas farmakoloģiskas aktivitātes, piemēram, kognitīvo un uzvedības deficītu mazināšana (Wu et al., 2014), pretiekaisuma iedarbība (Fu et al., 2018), kaulu veidošanās veicināšana un kaulu nomākšana. rezorbciju (Li et al., 2013; Li et al., 2012), kā arī antioksidantu aktivitāti (Zhang et al., 2016). Taču tā aktīvo sastāvdaļu un vielmaiņas procesa sarežģītība radīja grūtības gan pētot mērķus cilvēka audos, gan izskaidrojot darbības mehānismu.
Pirmkārt, ir nepieciešama uzticama diskusija par OP/AD terapeitiskajiem mērķiem. Īpaši pamatojoties uz domu par "vienādu ārstēšanu dažādām slimībām" TCM un "daudzkomponentu terapijas, bioloģiskā tīkla" tīkla farmakoloģijas metodoloģijām, mēģinājumi meklēt nozīmīgus kopīgos mērķus starp abām slimībām var būt īpaši praktisks. nozīme, sniedzot norādījumus OP un AD profilaksei un kontrolei. Zebrafish skeleta fizioloģijā ir liela līdzība ar zīdītājiem un ļoti homologiem gēniem cilvēkiem. Tas ir pieejams un pievilcīgs dzīvnieku modelis in vivo OP un AD pētījumiem (Bergen et al., 2019; Newman et al., 2014). Tādējādi šī tīkla farmakoloģijas pētījuma mērķis bija pārbaudīt CT divējādas iedarbības aktīvās sastāvdaļas, izpētīt kopējos iespējamos OP un AD mērķus, kā arī atklāt iespēju izmantot CT divu slimību ārstēšanai vienlaikus. Šajā pētījumā mērķa informācija par CT aktīvajām sastāvdaļām, genomiem un OP un AD proteomikas informācija tika attiecīgi savākta no dažādām datu bāzēm, lai izveidotu interaktīvu tīklu, un tika izveidota bagātināšanas analīze, lai atklātu CT sinerģiskus mehānismus OP un AD ārstēšanai. . Turklāt mēs attiecīgi ierosinājām OP un AD zebrafish modeļus un uztvērām galvenos savienojumus tīklā, lai pārbaudītu to efektivitāti un mērķus divām slimībām.
Cistanche veicina sklerotīna augšanu.
2. Materiāli un metodes
2.1. Reaģenti
Genisteīna (GE), kvercetīna (QU), abiētīnskābes (AA), -sitosterīna (BSS) ķīmiskie standarti (tīrība ir lielāka vai vienāda ar 98 procentiem) tika iegādāti no Chroma Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Ķīna). Kultūras plāksnes tika iegūtas no Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. (Wuxi, Ķīna). Prednizolons (Pre), Etidronāta dinātrija sāls (Ed), Donepezil HCL (DPZ), AlCl3·6H2O tika iegādāts no Aladdin Reagent Inc. Zebrafish sārmainās fosfatāzes (ALP), tartrāta rezistences skābās fosfatāzes (TRAP), acetilholīnesterāzes (AChE) un holīna acetiltransferāzes (ChAT) ar enzīmu saistītā imūnsorbcijas testa (ELISA) komplektu piegādāja Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Šanhaja, Ķīna). Trizol tika iegūts no Nanjing KeyGen Biotech. Co., Ltd. (Nanjing, Ķīna). Transtar Top Green qPCR SuperMix tika iegādāts no TransGen Biotech. Co., Ltd. (Pekina, Ķīna).
cistanche ekstrakts
2.2 Dzīvnieki
Pieaugušas zebrazivis (AB celms, 4 mēnešus vecs) tika uzturētas 28 grādos 14/10 h gaismas/tumsas ciklā akvārijā, kas tika nodrošināts ar saldūdens apmaiņu. Tās tika turētas divas reizes dienā ar tikko izšķīlušu sālījumu garneļu diētu (Chen et al., 2018). Parasti apaugļoti embriji tika atlasīti un kultivēti 3 dienas pēc apaugļošanas (dpf) vieglā augšanas inkubatorā. Visi eksperimenti ar dzīvniekiem bija saskaņā ar iestādes un valdības vadlīnijām par eksperimentiem ar dzīvniekiem.
2.3. Tīkla farmakoloģiskais process
2.3.1. Ķīmiskās telpas aprēķins un savienojumu kandidātu pārbaude
Visi dati par CT ķīmiskajām sastāvdaļām tika savākti no tradicionālās ķīniešu medicīnas sistēmu farmakoloģijas datu bāzes un analīzes platformas. TCMSP ir ķīniešu augu izcelsmes zāļu sistēmfarmakoloģijas platforma, kas atspoguļo attiecības starp zālēm, mērķiem un slimībām (Ru et al., 2014). Tikmēr galveno komponentu analīzei (PCA) tika iegūti četri būtiski ar farmakoloģiju saistīti parametri TCMSP, tostarp molekulmasa (MW), sadalījuma koeficients starp oktanolu un ūdeni (AlogP), ūdeņraža donoru skaits (Hdon) un ūdeņraža akceptoru skaits ( Hacc). CT ķīmiskais sadalījums tika izveidots ar iepriekšminētajiem parametriem, izmantojot SIMCA programmatūru (versija 14.1, Umetrics). Un tajā pašā kursā tika apstrādātas mazu molekulu zāles, kas apstiprinātas AD/OP no DrugBank. CT sastāvdaļas tika filtrētas pēc zāļu līdzības (DL). DL ir kvalitatīvs jēdziens, ko izmanto zāļu izstrādē, lai novērtētu, cik "zālēm līdzīgs" ir potenciālais savienojums. Šī svarīgā īpašība tiek izmantota kā atlases kritērijs "zālēm līdzīgiem" savienojumiem tradicionālajos ķīniešu augos, un tas palīdz optimizēt farmakokinētiku un farmaceitiskās īpašības (Tao et al., 2013). Pamatojoties uz ieteikumiem literatūrā un TCMSP, kā filtra nosacījumus mēs atlasījām DL lielāks par vai vienāds ar 0.18. Nosacījumam atbilstošās sastāvdaļas tika eksportētas turpmākai analīzei. Viņu 2-dimensiju (2D) un 3D struktūras krāsoja ar programmatūru ChemDraw Professional 16.0. Un 3D struktūras tika optimizētas, izmantojot Chem3D 16.0 enerģijas samazināšanas funkciju.
2.3.2. OP un AD saistīto mērķu kolekcija
Visas OP un AD gēnu asociācijas tika neatkarīgi savāktas no DisGeNET un GeneCards. DisGeNET datubāze ir viena no lielākajām publiski pieejamajām ar cilvēku slimībām saistīto gēnu un variantu atklāšanas platformām (Pinero et al., 2017). GeneCards ir integrēta cilvēka gēnu datu bāze, kas ietver genomu, transkriptomisko, proteomisko, ģenētisko, klīnisko un funkcionālo informāciju (Safran et al., 2010).
2.3.3. Salikto mērķu savākšana un apgrieztās dokstacijas prognozēšana
GeneCards datu bāze un Šveices TargetPrediction datubāze tika apvienotas, lai prognozētu attiecīgos aktīvo sastāvdaļu mērķus CT. GeneCards norāda zināmos savienojumu aktīvos mērķus, savukārt Swiss TargetPrediction datu bāze var novērtēt visticamākos mazo molekulu makromolekulāros mērķus (Daina et al., 2019). Pirms prognozēšanas kandidātmolekulu struktūras tika pārveidotas no mol2 formāta uz SMILES formātu, izmantojot Open Babel (versija 2.4.1).
2.3.4. Olbaltumvielu un olbaltumvielu mijiedarbības analīze
STRING datu bāze tika izmantota, lai atklātu mijiedarbību starp CT-OP-AD koplietotu mērķu grupu. Pēc meklēšanas saskaņā ar "Homo sapiens" modeli proteīna-olbaltumvielu mijiedarbības (PPI) tīkls tika vizualizēts ar programmatūru Cytoscape (versija 3.7.2). STRING ir zināmu un paredzētu PPI datubāze, kas iegūta no genoma konteksta prognozēm, augstas caurlaidības laboratorijas eksperimentiem, (konservētas) koekspresijas, automatizētas teksta ieguves un iepriekšējām zināšanām datu bāzēs (Szklarczyk et al., 2017).
Cistanche ir labs Alcheimera slimībai.
2.3.5. GO un KEGG ceļa bagātināšanas analīze
Gēnu ontoloģijas (GO) bagātināšanas analīze tika veikta, izmantojot Funrich programmatūru. FunRich (versija 3.1.3) ir funkcionāla programmatūra, ko galvenokārt izmanto gēnu un proteīnu bagātināšanas analīzei (Pathan et al., 2015). Lai veiktu ceļa bagātināšanas analīzi, tika izmantota ConsensusPathDB-cilvēku datu bāze. Iegūtais gēnu saraksts tika iesniegts datu bāzē ar iestatījumu "p-vērtības nogriešana" kā 0,01. Pēc rezultātu iegūšanas tika atlasīti tikai šie ar OP un/vai AD saistītie ceļi un sadalīti grupās atbilstoši KEGG funkciju kategorijām. CPDB ir nemanāms mijiedarbības tīkls, kas satur bināru un sarežģītu proteīnu-olbaltumvielu, ģenētisko, vielmaiņas, signalizācijas, gēnu regulēšanas un zāļu mērķa mijiedarbību, kā arī bioķīmiskos ceļus Homo sapiens (Kamburov et al., 2013).
2.4. OP Zebrafish modeļa eksperimentālās procedūras
2.4.1 Modeļu grupēšana
Zebrafish kāpuri tika sadalīti vairākās grupās: kontroles grupa, modeļa grupa, modelis plus Ed grupa, modelis plus savienojumu grupas, no kurām katrā bija 3 0 kāpuri. Kontroles grupa tika uzturēta barotnē ar 0, 2 procentiem DMSO. Modeļu grupa tika apstrādāta ar Pre (25 µM) no 3 dpf līdz 8 dpf. Modeļa plus Ed grupa tika vienlaikus apstrādāta ar Pre un Ed (30 µg/ml).
2.4.2. Krāsošana ar alizarīnsarkanu
Pēc 5 dienu kultivēšanas ar dažādiem savienojumiem kāpuri pēc kārtas tika anestēzēti, fiksēti un balināti. Alizarīna sarkanais tika izmantots, lai iekrāsotu zebrafish galvas kaulus. Lai noņemtu lieko daudzumu, tika uzklāts attiecīgi 1 procents KOH un glicerīns (attiecībās 3:1, 1:1 un 1:3). Visbeidzot, tika izmantots stereomikroskops (Olympus SZX16), lai tvertu zebrazivju krāsošanas attēlus guļus stāvoklī. Krāsošanas laukums un integrētais optiskais blīvums (IOD) tika aprēķināts, izmantojot Image-Pro Plus 6.{11}}.
2.4.3. ALP un TRAP aktivitātes noteikšana
Zebrafish kāpuri ar 3 dpf tika subkultivēti 6-iedobju plāksnēs un inkubēti ar Pre savienojumu klātbūtnē vai bez tiem 5 dienas. Pēc tam tie tika savākti ALP aktivitātes mērīšanai. ALP aktivitāte tika noteikta, izmantojot zebrafish ALP ELISA komplektu, pamatojoties uz ražotāja protokolu. TRAP aktivitātes novērtēšanas metode bija tāda pati kā ALP.
2.5. AD Zebrafish modeļa eksperimentālās procedūras
2.5.1 Modeļu grupēšana
Zebrafish kāpuri tika sadalīti vairākās grupās: kontroles grupa, modeļa grupa, modelis plus DPZ grupa, modelis plus savienojumu grupas, no kurām katrā bija 30 kāpuri. Kontroles grupa tika uzturēta barotnē ar 0, 2 procentiem DMSO. Modeļu grupa tika apstrādāta ar AlCl3 (150 µM, pH 5,8) no 3 dpf līdz 6 dpf. Modelis plus DPZ grupa tika apstrādāta ar AlCl3 un DPZ (8 µM).
2.5.2. Uzvedības analīze
Pēc 3 dienām pēc zāļu piegādes kāpuru kustību reģistrēja ViewPoint uzvedības analizators (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.). Visi eksperimenti tika pabeigti 60 minūtēs 28 ° C temperatūrā, kas satur 3 gaismas / tumšās fāzes ciklus (katrs 10 minūtes gaišai un tumšai). Saskaņā ar iepriekšējā ziņojumā izmantotajām metodēm kā anti-AD zāļu efektivitāte ir izvēlēts vidējais ātrums (AS), ātruma izmaiņas (∆S), diskinēzijas atveseļošanās ātrums (DRR, vienādojums a) un reakcijas efektivitāte (RE, vienādojums b). novērtējuma indekss šajā modelī (Pan et al., 2019; Wenhai et al., 2016).
AS (mm/s)=D/T, DRR (procenti)=100 × (ASDrug — ASModel) / (ASControl — ASModel), a
kur D ir zebrafish kustības attālums 60 minūšu laikā, T ir eksperimenta laiks.
RE ( procenti )=100 × (∆SDrug — ∆SModelis) / (∆Skontrole — ∆SModelis), b
kur ∆S ir zebrazivs ātruma izmaiņas gaismas/tumsas ciklos.
2.5.3. AChE un tērzēšanas aktivitātes mērīšana
Zebrafish kāpuri ar 3 dpf tika subkultivēti 6-iedobju plāksnēs un 3 dienas inkubēti ar AlCl3 savienojumu klātbūtnē vai bez tiem. Tad tie tika savākti AChE darbībai. AChE aktivitāte tika noteikta, izmantojot zebrafish AChE ELISA komplektu, pamatojoties uz ražotāja protokolu. ChAT aktivitātes novērtēšanas metode bija tāda pati kā AChE.
2.6. Kvantitatīvā reāllaika PCR analīze
Zebrafish kāpuri tika sadalīti OP un AD grupās. OP grupas sastāvēja no kontroles grupas, Pre grupas un Pre plus savienojumu grupām, kuras kultivēja no 3 dpf līdz 8 dpf. AD grupas ietvēra kontroles grupu, AlCl3 grupu un AlCl3 plus savienojumu grupas, kas kultivētas no 3 dpf līdz 5 dpf. Katrā grupā bija 30 kāpuri. Kopējo RNS no šiem zebrafish kāpuru paraugiem attiecīgi ekstrahēja Trizol. RNS paraugi tika reversi transkribēti uz cDNS saskaņā ar cDNS komplekta ražotāja norādījumiem. MRNS ekspresijas līmenis tika noteikts ar reālā laika fluorescējošu kvantitatīvo PCR (Roche LightCycler96). Rezultāti tika normalizēti līdz -aktīna ekspresijai un kvantitatīvi noteikti ar salīdzinošo (2−∆∆Ct) metodi. Izmantotos priekšējos un reversos primerus sintezēja Sangon Biotech (Šanhaja, Ķīna) un uzskaitīti S1 papildu tabulā.
cistanche un Tongkat ali pulverispalīdz uzlabot imunitāti.
Lai iegūtu plašāku informāciju, lūdzu, noklikšķiniet šeit.
2.7. Statistiskā analīze
GraphPad Prism versija 8.00 tika izmantota aprakstošai statistiskai analīzei. Dati tika izteikti kā vidējais ± SD un analizēti ar ANOVA metodi, lai pārbaudītu mainīgumu katrā izmēģinājumā, uzskatot, ka P ir mazāks vai vienāds ar 0,05 par nozīmīgu.
