1. daļa: Verbascoside aizsargā aizkuņģa dziedzera šūnas pret ER-stresu

Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com

Alesandra Galli 1, plus , Paola Marciani 1, plus , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3, Michela Castagna 1 and Carla Perego 1,*

Abstract:

Būtiski epidemioloģiski pierādījumi liecina, ka ar polifenoliem bagāts uzturs pasargā no 2. tipa diabēta attīstības. Feniletanoīda glikozīdsverbaskozīds/akteozīds, plaši izplatītam polifenolu augu savienojumam, ir vairākas bioloģiskas īpašības, tostarp spēcīgas antioksidanta, pretiekaisuma un neiroprotektīvas aktivitātes. Šī pētījuma mērķis bija pārbaudīt iespējamo ietekmi uzverbascosideuz aizkuņģa dziedzera šūnām, mērķis nekad nav pārbaudīts. Peles un cilvēka šūnas tika inkubētas arverbascoside(0,8–16 uM) līdz piecām dienām, un tika izmantota bioķīmisko un attēlveidošanas metožu kombinācija, lai novērtētu šūnu izdzīvošanu un darbību normālos vai endoplazmatiskā tīkla (ER) stresu izraisošos apstākļos. Mēs atklājām no devas atkarīgu aizsargājošu efektuverbascosidepret oksidatīvo stresu klonālajās un cilvēka šūnās. Mehāniskie pētījumi atklāja, ka polifenols aizsargā šūnas pret ER stresa izraisītām disfunkcijām, modulējot proteīna kināzes RNS līdzīgās endoplazmatiskās retikuluma kināzes (PERK) filiāles aktivāciju nesalocītā proteīna atbildē un veicinot mitohondriju dinamiku. Rezultātā šajās šūnās tika konstatēta palielināta dzīvotspēja, mitohondriju funkcija un insulīna saturs. Šie pētījumi sniedz pierādījumus, kaverbascosideuzlabo -šūnu spēju tikt galā ar ER stresu, kas ir svarīgs šūnu disfunkcijas un neveiksmes veicinātājs diabēta apstākļos un atbalsta verbaskozīda terapeitisko potenciālu diabēta gadījumā.

Atslēgvārdi:

verbaskosīds; polifenoli; insulīnu ražojošās šūnas; cukura diabēts; UPR; oksidatīvais stress; ER-stress; PERK; Pretiekaisuma līdzeklis; mitohondriji

1. Ievads

Diabēts ir hroniska slimība, kas skar simtiem miljonu cilvēku [1]. Atšķirīga etioloģija raksturo 1. tipa (T1D) un 2. tipa cukura diabētu (T2D) un abus raksturo insulīna trūkums [2]. Insulīns regulē glikozes koncentrāciju plazmā, stimulējot glikozes uzņemšanu muskuļu un tauku šūnās un modulējot glikozes metabolismu aknās. Uzturvielu pieejamība, hormoni un nervu ievade regulē aizkuņģa dziedzera insulīna sekrēciju un uztur glikozes koncentrāciju asinīs fizioloģiskā diapazonā [3–5]. Tāpēc -šūnu disfunkcija izraisa diabētu, kam raksturīga hiperglikēmija tukšā dūšā.

T2D ir progresējošs stāvoklis, kurā insulīna rezistence un -šūnu darbības traucējumi ir savstarpēji saistīti, un jaunākie pierādījumi ir palielinājuši interesi par -šūnu kritisko primāro lomu hiperglikēmiskajā stāvoklī [6,7]. Cilvēkiem, kuriem nav cukura diabēta, aptaukošanās - šūnas kompensē insulīna rezistenci ar palielinātu hormona sekrēciju. Tomēr dažiem subjektiem, viņu stāvoklim pasliktinoties, insulīnēmija samazinās un glikozes līmenis paaugstinās līdz hiperglikēmijai [8,9].

Glikoze ir vissvarīgākais šūnu funkciju modulators. Glikozes stimulācija ietekmē gēnu regulēšanu un proteīnu ekspresiju, kas iesaistīti daudzās šūnu funkcijās, piemēram, glikolīzē, insulīna sintēzē un sekrēcijā [10]. Glikozes izraisītā insulīna sekrēcija ir atkarīga no oksidatīvā metabolisma, lai iegūtu adenozīna trifosfātu (ATP), un fizioloģiski tiek ražots zems reaktīvo skābekļa sugu (ROS) līmenis. Tomēr -šūnas nav īpaši labi aprīkotas ar attīrīšanas enzīmiem, un šis vājums padara tās ļoti jutīgas pret oksidatīvo stresu [11,12]. Palielinoties oksidatīvajam stresam, šūnās samazinās insulīna ražošana, un šūnas ražo citokīnus, kas aizdedzina šūnu bojājumus ar iekaisumu un apoptozi [13]. Interesanti, ka, lai gan samazinātā šūnu masa iepriekš tika attiecināta uz šūnu nāvi, jaunākie pētījumi liecina par lielu šūnu dediferenciācijas lomu [14, 15]. Kļuvis skaidrs, ka uz T2D brauc vairāki posmi. Metaboliskie un oksidatīvie apvainojumi izraisa endoplazmatiskā tīkla (ER) stresu, kas izraisa insulīna sintēzes un sekrēcijas samazināšanos, citokīnu atbrīvošanai seko iekaisuma procesi, un var rasties šūnu zudums apoptozes un dediferenciācijas rezultātā. Šīs zināšanas ir būtiskas, lai izstrādātu atbilstošas ​​ārstēšanas stratēģijas, jo oksidatīvo stresu un iekaisumu var novērst, un aizkuņģa dziedzera šūnu plastiskums ļauj pārveidot cilmes šūnas par šūnām, kā tas ir pierādīts pelēm [16].

Nesen šūnu neaizsargātība pret oksidatīvo stresu ir veiksmīgi mudinājusi lietot uztura antioksidantus, lai novērstu diabētu [17]. Viens no interesantākajiem antioksidantiem, olīveļļa ir pazīstama ar savām labvēlīgajām īpašībām kopš senajiem grieķiem. Olīveļļa satur lielu daudzumu mononepiesātināto taukskābju (MUFA) un vairākus polifenolus, piemēram, tirozolu, hidroksitirozolu, oleuropeīnu un verbaskozīdu.

Verbascoside, pazīstams arī kā akteozīds, ir feniletanoīda glikozīds, kas iegūts no Olea europea, Verbascum sugas augiem un 23 citām augu ģimenēm [18–20]. To var iegūt arī no olīveļļas blakusproduktiem (tas ir bagātināts ar olīvu dzirnavu notekūdeņiem, kas iegūti olīvu augļu pārstrādē) vai iegūt, izmantojot vielmaiņas inženierijas un sintētiskās bioloģijas metodes [21].

Pagaidām nav ziņots par verbaskozīda biopieejamību cilvēkiem. Pētījumi, kas veikti ar pelēm, SKBR3 un Caco{1}} šūnām, liecina, ka nemetabolizētam verbaskozīdam var būt iespējams šķērsot zarnu barjeru, cirkulēt asins plazmā un radīt antioksidantu iedarbību [20, 22, 23]. Atšķirībā no vairuma augu polifenolu, verbaskozīds galvenokārt iedarbojas uz šūnām, modulējot dažādu enzīmu un regulējošo faktoru gēnu transkripciju, ar antioksidantu un pretiekaisuma iedarbību [24–30].

Lai gan ir zināmas daudzas verbaskozīda labvēlīgās ietekmes uz cilvēku veselību, nav datu par tā ietekmi uz aizkuņģa dziedzera šūnām. Tā kā oksidatīvais stress un iekaisums ir T2D patoģenēzes pamatā, mēs pētījām, vai ārstēšana ar verbaskozīdu varētu uzlabot šūnu dzīvotspēju un

funkcija ER stresu izraisošos apstākļos, un mēs raksturojām tās darbības molekulāros mehānismus. Mūsu dati atklāj, ka verbaskozīds novērš šūnu oksidatīvo stresu un iekaisumu, modulējot nesalocītā proteīna reakcijas aktivāciju un veicinot mitohondriju dinamiku, tādējādi palielinot šūnu dzīvotspēju un insulīna saturu.

2. Materiāli un metodes

2.1. Šūnu kultūra un materiāli

Peles tc3 šūnas (laipni nodrošināja prof. Hanahans — Kalifornijas Universitātes Bioķīmijas un biofizikas katedra, Sanfrancisko, CA [31]) tika kultivētas RPMI 1640 barotnē (Euroclone SpA, ECB90 0, Pero MI, Itālija), kas papildināts ar 10% (v/v) termiski inaktivētu teļa augļa serumu (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Itālija), 1% (v/v) penicilīna-streptomicīnu (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, Itālija) un 1 procentu (v/v) L-glutamīnu (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Itālija). Cilvēku Langerhans saliņas tika izolētas Milānā (Niguarda Ca' Granda) no līķu daudzu orgānu donoriem saskaņā ar procedūru, ko aprakstīja Ricordi et al. [32]; tie tika kultivēti RPMI barotnē, kas satur 5,5 mmol/l glikozes, 10 procentus termiski inaktivēta liellopu augļa seruma, 0,7 mM glutamīna, 50 vienības/ml penicilīna un 50 ug/ml streptomicīna (EuroClone, SpA, Pero MI, Itālija). Tika izmantots četru dažādu saliņu preparāts, saliņu tīrība bija 80 ± 10 procenti. Saliņu izolāciju un salu pētījumus apstiprināja Milānas Niguarda Ca' Granda slimnīcas ētikas komiteja (11.12.2009.). tc3 šūnas tika apstrādātas ar 0,8, 1,6 un 16 µM verbaskozīdu (Carbosynth, OV08034, Compton, UK), kafeīnskābi un hidroksitirozolu (prof. Dell'Agli, Farmakoloģisko un biomolekulāro zinātņu katedra, Universita degli Studi di Milan Milāna, Itālija) pilnā RPMI barotnē 5 dienas, savukārt cilvēka saliņas ar 16 uM verbaskozīdu. Kā kontroles tika izmantotas ar metanolu / etanolu apstrādātas šūnas. Lai izraisītu oksidatīvo stresu, šūnas pirms analīzes 20 minūtes apstrādāja ar H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, ASV) 500 uM pilnā RPMI barotnē, bet apstrādāja ar tunikamicīnu 2 ug/ml (T7765, Sigma Aldrich). ) 7 stundas tika veikta, lai izraisītu ER stresu.

2.2. Šūnu dzīvotspējas noteikšana ar MTT testu

Šūnas tika izklātas 96 vairāku iedobju plāksnēs un piecas dienas pēc verbaskozīda apstrādes tās inkubēja ar 0,5 mg/mL MTT (3-(4,5-dimetiltiazols{{7}). }il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds) (Sigma-Aldrich, M5655, Sentluisa, MO, ASV) 4 stundas mitrinātā atmosfērā, kas satur 5 procentus CO2 37 oC temperatūrā. Pēc inkubācijas šūnas viegli atkārtoti suspendēja 100 ul DMSO (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Itālija), un absorbcija pie 540 nm tika noteikta ar mikroplašu lasītāju (Benchmark, mikroplašu lasītājs, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, ASV) [33]. Eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros, un dati tika izteikti kā palielinājums, salīdzinot ar kontroles paraugiem.

2.3. Šūnu nāves noteikšana ar plūsmas citometriju

Piecas dienas pēc inkubācijas ar 16 µM verbaskozīdu - šūnas tika atdalītas, inkubējot 7 minūtes ar tripsīnu/EDTA, savāca un centrifugēja; granula tika viegli atkārtoti suspendēta fosfāta buferšķīdumā ar zemu sāļu daudzumu. Šūnas tika iekrāsotas ar MuseTM skaita un dzīvotspējas reaģentu (Millipore, MCH100102, Burlington MA, ASV) saskaņā ar ražotāja protokolu un analizētas, izmantojot plūsmas citometriju. Eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros, un dati tika izteikti kā mirušo šūnu procentuālā daļa no kopējā.

2.4. ROS paaudze

Intracelulārie ROS tika novērtēti ar DCFDA (2/,7/-dihlorofluoresceīna diacetāts) (Sigma Aldrich, D6883, Sentluisa, MO, ASV), membrānas caurlaidīgu zondi, kas kļūst fluorescējoša, kad ir piesaistīta ROS [34]. tc3 šūnas tika iepriekš ielādētas ar 15 uM DCFDA Krebs-Ringer buferī (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES-NaOH pH 7,4 un 2 mM CaCl2).

papildināta ar 11 mM glikozi 1 stundu 37 oC temperatūrā. ROS saturs tika noteikts 30 minūtes gan pamata, gan stresa apstākļos ar mikroplašu lasītāju (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Šveice). Vidējās vērtības un standarta novirzes tika balstītas uz trim neatkarīgiem eksperimentiem.

2.5. Western blotēšana

tc3 šūnas tika savāktas un izšķīdinātas RIPA buferī (150 mM NaCl, 50 mM Tris HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 1% TERGITOLw NP40, 0,5% deoksiholāta), kam pievienots aprotinīns (Sigma Aldrich, St. A452). Louis, MO, ASV), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, Sentluisa, MO, ASV) un Roche inhibitori (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, ASV) 40 minūtes 4 oC temperatūrā. Olbaltumvielu koncentrācija tika noteikta ar Bredforda testu [35], izmantojot Bredforda reaģentu (Sigma Aldrich, B6916, Sentluisa, MO, ASV), 30 ug proteīnu tika izšķīdināti ar 10% SDS-PAGE un pārnesti uz nitrocelulozes membrānām (Millipore, Burlington). MA, ASV). Primārās antivielas tika uzklātas 2 stundas bloķējošā buferī ar 5% beztauku piena vai 5% BSA šķīdumiem; tika izmantotas šādas primārās antivielas: peles anti- -aktīns (Novus International Inc., NB600501, Sentluisa, MO, ASV), peles anti-akroleīns (Abcam, ab48501, Kembridža, Apvienotā Karaliste), peles anti-BIP. (prof. Borgese Nica, Neiroloģijas institūta, CNR, Milāna, Itālija) dāvana, trušu anti-HNE (-diagnostic International Inc., HNE11S, Sanantonio, TX, ASV), peles anti-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc. ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, ASV), trušu anti-fosfo-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, ASV), peles anti-IKB (Cell Signaling Technology Inc. ., 4814, Danvers, MA, ASV), truša anti-fosfo-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, ASV), trušu anti-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, ASV), aitu anti-SOD1 (Merck, KGaA, Darmstadt, Germania), trušu anti-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, ASV), trušu anti-eIF2 (Cell Signaling Technology) Inc., 5324, Danvers, MA, ASV) un trušu anti-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, ASV). Sekundārās antivielas, kas konjugētas ar HRP (Dako Agilent, Santa Clara, CA, ASV) tika izmantotas atšķaidījumā 1:5000. Olbaltumvielas tika noteiktas, izmantojot ECL noteikšanas sistēmu (Euro-Clone SpA, Pero MI, Itālija), izmantojot Odyssey Fc Image sistēmu (LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg, Vācija), un joslu blīvums tika noteikts ar Image Studiow Lite programmatūru (LI). -COR Biosciences, Linkolna, NE, ASV) [36]. Eksperimenti tika veikti trīs eksemplāros, un dati tika izteikti kā palielinājums, salīdzinot ar kontroles paraugiem.

2.6. Mitohondriju membrānas potenciāls

tc3 šūnas un cilvēka Langerhans saliņas tika inkubētas ar 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milāna, Itālija) vai 100 uM MitoSpyw Green FM (BioLegend, 424805 Itālijā) 3 min Camp 3, 0 Camp. oC; Fluorescences intensitātes tika noteiktas ar mikroplašu lasītāju TECAN Infinite⑧ F500 (551/576 nm Ex/Em MitoSpyw Orange CMTMRos; 490/516 nm Ex/Em priekš MitoSpyw Green) (TECAN Infinite⑧, Tecannite⑧nnedorf Group). Šūnas tika inkubētas ar 500 uM H2O2 20 minūtes, un fluorescences intensitāte tika noteikta, kā aprakstīts iepriekš. Vidējās vērtības un standarta novirzes tika balstītas uz trim dažādiem eksperimentiem.

2.7. Mitohondriju morfoloģija un dinamika

tc3 šūnas tika iepriekš ielādētas ar 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milāna, Itālija) 11 mM glikozes Krebs-Ringer buferī 37 oC temperatūrā 30 minūtes. Paraugi tika novietoti attēlveidošanas kamerā, un nejauši lauki tika attēloti, izmantojot mikroskopa Axio Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen Vācija) rodana filtru. Lai novērtētu mitohondriju morfoloģiju, ar ImageJ daļiņu analizatora programmatūru tika analizēti šādi parametri: laukums (um2), cirkularitāte (4mArea2/Perimeter2) un Fereta maksimālais diametrs (um) [37].

Laika intervāla eksperimentiem vienas šūnas attēlveidošana tika veikta ar ātrumu 1 kadrs sekundē 30 sekundes kontroles vai oksidatīvā stresa apstākļos. Lai izmērītu mitohondriju kumulatīvo attālumu (um2), attēli vispirms tika koriģēti attiecībā uz fotoattēlu balināšanu, pēc tam videoklipi tika analizēti, izmantojot esošu Image-Pro Plus spraudni (objektu izsekošana) (Media Cybernetics, Rockville, MD, ASV). Līdz divpadsmit

šūnas tika attēlotas trīs neatkarīgos eksperimentos, un dati tika parādīti kā vidējās vērtības un standarta novirzes.

2.8. Insulīna sekrēcija

Cilvēka izolētās Langerhans saliņas tika iesētas 96-iedobes plāksnē ar blīvumu 20 saliņas katrā iedobē, un pēc 5 ārstēšanas dienām insulīna saturu un sekrēciju noteica bazālā (3,3 mM glikozes) un stimulēja (16,7 mM glikozes). ) apstākļos, izmantojot ELISA imūntestu (Mercodia, 10-1113-01, Upsala, Zviedrija).

2.9. Statistiskās analīzes

Visas statistiskās analīzes tika veiktas ar GraphPad Prism 8.0 neatkarīgiem bioloģiskiem atkārtojumiem. Vidēji starp divām grupām tika novērtēti, izmantojot divpusējo Stjudenta t-testu, un p-vērtība < 0,05="" tika="" uzskatīta="" par="" statistiskās="" nozīmīguma="" pierādījumu.="" trīs="" vai="" vairāk="" grupu="" vidējie="" rādītāji="" tika="" salīdzināti="" ar="" dispersijas="" analīzi="" (anova),="" kam="" sekoja="" vairākkārtējs="" post-hoc="" (tūkija)="" salīdzināšanas="" tests.="" izmantotais="" statistiskais="" tests,="" precīzās="" p="" vērtības="" un="" kopiju="" skaits="" (n)="" ir="" norādītas="" atsevišķos="" skaitļu="" apzīmējumos.="" kļūdu="" joslas="" attēlos="" parāda="" vidējo="" ±="" sd="" vai="" vidējo="" ±="" se,="" kā="">

3. Rezultāti

3.1. Verbascoside uzlabo šūnu dzīvotspēju

Tā kā nebija datu par verbaskozīda iedarbību uz šūnām, mēs veicām MTT testu, lai novērtētu šūnu dzīvotspēju, un, kā parādīts 1.A attēlā, tika novērota pozitīva no devas atkarīga tendence. Tāpēc turpmākiem pētījumiem mēs izvēlējāmies 16 uM koncentrāciju, kas statistiski izrādījās efektīva, lai uzlabotu -šūnu dzīvotspēju. Ar plūsmas citometriju mēs pētījām piecu dienu verbaskozīda inkubācijas ietekmi uz šūnu izdzīvošanu pamata apstākļos un pēc 2{21} } min priekšapstrāde ar 500 uM H2O2. Bāzes stāvoklī verbaskozīds neietekmēja šūnu izdzīvošanu, kas liecina, ka palielinātā šūnu dzīvotspēja, kas novērota MTT testā, var būt saistīta ar uzlabotu mitohondriju aktivitāti. Savukārt pēc H2O2 iedarbības 16 uM verbaskozīda pirmapstrāde ievērojami samazināja oksidatīvā stresa izraisīto šūnu nāvi (1.B,C attēls). Verbaskozīds ir sarežģīta molekula, ko var modificēt ar hidrolizējošiem enzīmiem [18]. Lai pārbaudītu, vai verbaskozīda metabolīti varētu būt atbildīgi par novēroto aizsargājošo efektu, tc3 šūnas tika apstrādātas ar hidroksitirozolu un kafeīnskābēm (0, 8 un 16 uM) 5 dienas. Abi metabolīti nepalielināja šūnu dzīvotspēju, gluži pretēji, 16 uM koncentrācijai tika konstatēts citotoksisks efekts, kas bija svarīgāks pēc H2O2 iedarbības (S1 attēls). Šis atklājums pierāda, ka verbaskozīds, nevis tā metabolīti iedarbojas uz H2O2 apstrādi.

3.2. Verbascoside modulē redoksu homeostāzi un rada pretiekaisuma iedarbību šūnās

Vispirms mēs tc3 šūnās apstiprinājām verbaskozīda pretiekaisuma un antioksidantu iedarbību, kas novērota citos šūnu veidos [24, 29, 34]. Verbaskozīda ROS attīrīšanas aktivitāte tika novērtēta ar tc3 šūnām, kas marķētas ar ROS specifisko DCFDA (2/,7/-dihlorofluoresceīna diacetāts) šūnu caurlaidīgo zondi. Kā parādīts 2.A attēlā, pēc verbaskozīda pirmapstrādes tika konstatēts ievērojams ROS satura samazinājums gan bazālā, gan oksidatīvā stresa apstākļos.

Western blot analīzes atklāja būtisku oksidatīvā stresa marķieru akroleīna un 4-hidroksinonenāla (HNE) ekspresijas samazināšanos šūnās, kas apstrādātas ar verbaskozīdu. Turklāt mēs atklājām superoksīda dismutāzes (SOD1) ekspresijas palielināšanos, kas liecina, ka verbaskozīds savu antioksidantu aktivitāti, iespējams, ievieš ar diviem dažādiem mehānismiem, tieši kā ROS uztvērējs un netieši, izraisot antioksidantu enzīmu ekspresiju (attēls 2B, C).

Verbaskozīda pretiekaisuma iedarbība uz šūnām tika novērtēta, novērtējot NFKB ceļa aktivāciju, kas ir vissvarīgākais pro-iekaisuma ceļš šajās šūnās [38]. Izmantojot Western blot analīzi, mēs atklājām kodolfaktora kappa B (IKB ) un kodolfaktora kappa vieglās ķēdes pastiprinātāja (NFKB) inhibitora ekspresijas samazināšanos un ievērojamu NFKB fosforilācijas samazināšanos iepriekš apstrādātās šūnās, kas apstiprina hipotēzi verbaskozīda efektivitāte, lai samazinātu šūnu iekaisumu (attēls 2D, E).

3.3. Verbascoside modulē šūnu nesalocītu proteīna reakciju

Pēc tam mēs padziļināti analizējām molekulāro mehānismu, ar kuru verbaskozīdam ir antioksidanta un pretiekaisuma loma, koncentrējoties uz endoplazmas tīklu, kas parādās kā galvenais vielmaiņas un stresa signālu sensors šūnās. Stresa apstākļos organelle veido homeostatisku reakciju, kas pazīstama kā nesalocītā proteīna reakcija (UPR), kuras mērķis ir atgūt ER funkciju; tomēr šī ceļa pārmērīga aktivizēšana izraisa apoptozi [39, 40].

Paaugstināta ER stresa marķieri ir chaperonu proteīnu regulēšana un UPR reakcijas aktivizēšana. Ar verbaskozīdu apstrādāto šūnu Western blot analīze atklāja divu chaperonīnu karstuma šoka proteīna 70 (HSP70) un saistošā imūnglobulīna proteīna (BIP) līmeņa pazemināšanos (3.A, B attēls). Turklāt tika konstatēta ievērojama proteīnkināzes RNS līdzīgās ER kināzes (PERK) ekspresijas samazināšanās un samazināta tās pakārtotā efektora, eikariotu translācijas iniciācijas faktora 2 (eIF2) fosforilēšanās.

Noklikšķiniet šeit, lai skatītu 2. daļu