Kontaktpersonu:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls noklikšķiniet šeit uz 2. daļu

Cistanche ir ļoti labs neiroprotektīvs efekts

Gabriels Gonsaless 1,2 , Jiˇrí Grz 1, Cosimo Walter D'Acunto 1, Petr Ka ˇnovsk2 un Miroslav Strnad1,2,*

1. Augšanas regulatoru laboratorija, Čehijas Zinātņu akadēmijas Eksperimentālās botānikas institūts,

un Palacký Universitātes Zinātņu fakultāte, Šlechtitel °u 27, CZ-78371 Olomouc, Čehija;

Gonzalez.gabriel@seznam.cz (G.G.); jiri.gruz@upol.cz (J.G.); waldacun@gmail.com (C.W.D.)

2. Neiroloģijas katedra, Olomoucas Universitātes slimnīca un Medicīnas un zobārstniecības fakultāte,

Palacký University Olomouc, CZ-775 20 Olomouc, Čehija; Petr.Kanovsky@fnol.cz

* Sarakste: miroslav.strnad@upol.cz; Tālr.: +420-585-634-850

Abstrakts:Citokinīniir fitohormoni uz adenīna bāzes, kas regulē galvenos procesus augos, piemēram, šūnu dalīšanos un diferenciāciju, sakņu un dzinumu augšanu, apikālo dominējošo stāvokli, sazarošanu un sēklu dīgšanu. Sākotnējos pētījumos tie ir parādījuši arī aizsardzības pasākumus pret cilvēka neirodeģeneratīvām slimībām. Lai paplašinātu zināšanas par aizsardzību (aizsardzības darbību), ko tie piedāvā, mēs pētījām dabiskās dabas aktivitātescitokinīnipret salsolīna (SAL) izraisītu toksicitāti (aParkinsona slimībamodelis) un glutamāta (Glu) izraisīta nāveNeironu-piemēram, dopamīnerģiskās SH-SY5Y šūnas. Mēs atklājām, ka kinetīna-3-glikozīds, cis-zeatīna ribozīds un N6-izopentenila adenozīns bija aktīvi SAL izraisītajā PD modelī. Turklāt trans-, cis-zeatīns un kinetīns kopā ar dzelzs helatora deferoksamīnu (DFO) un nekroptozes inhibitoru nekrostatīnu 1 (NEC-1) ievērojami samazināja šūnu mirstības rādītājus Glu izraisītajā modelī. Laktāta dehidrogenāzes testi atklāja, kacitokinīniar nosacījumu, ka zemāksneiroprotektīvsaktivitāte nekā DFO un NEC-1. Turklāt tie samazināja apoptotisko kaspāzes-3/7 aktivitātes mazāk spēcīgi nekā DFO. Tomērcitokinīnibija ļoti līdzīga ietekme kā DFO un NEC-1 uz superoksīda radikālu ražošanu. Kopumā tie parādīja aizsardzības aktivitāti SAL izraisītajā modelīparkinsona slimībaNeironušūnu nāve un Glu izraisīts oksidatīvo bojājumu modelis, galvenokārt samazinot oksidatīvo stresu.

Atslēgvārdi: citokinīns; fitohormons; neiroaizsardzība; neironam līdzīgas SH-SY5Y šūnas; citotoksicitāte; salsolinols; glutamāts; oksidatīvais spriegums; Parkinsona slimība

cistanche rūpnīcapar ietekmi uzNeiroaizsardzība

1. Ievads

Parkinsona slimība(PD) ir otra izplatītākā ar motoru saistītā neirodeģeneratīvā slimība, un paredzams, ka pasaulē diagnosticēto gadījumu skaits palielināsies no 6 miljoniem 2015. gadā līdz vairāk nekā 12 miljoniem 2040. gadā [1]. To raksturo motora simptomi, kas saistīti ar specifisku deģenerāciju un aptuveni 30–70% dopamīnerģiskā (DA) zudumu.Neironiemsubstantia nigra pars compacta un to projekcijas uz striatum [2,3]. Dažas, no daudzām zināmām PD molekulārajām pazīmēm, ietver pastiprinātu oksidatīvo un nitrozatīvo stresu, mitohondriju disfunkciju [4–7], ekscitotoksicitāti [8], ubiquitīna/proteasomālās sistēmas disfunkciju [9] un neiroinflammāciju [10]. Pašreizējām ārstēšanas metodēm ir dažādas nelabvēlīgas blakusparādības, un tās piedāvā tikai simptomātisku atvieglojumu [11], tāpēc tiek intensīvi centieni izstrādāt zāles ar efektīvu ārstniecisku iedarbību uz DA deģenerēšanuNeironiem. Resursi, kas var palīdzēt šādiem centieniem, ietver dabiskus savienojumus, kuriem parasti ir mazāk blakusparādību. Inter alia, Ginkgo biloba (ginkgetin, ginkgolide, bilobalide), žeņšeņa (ginsenozīdi) un flavonoīdu (baicalein, kaempferol, rutin un luteolin) vielām ir bijusi plaša aizsargājoša aktivitāte vairākos in vitro modeļos (ieskaitot cilvēka neiroblastomas šūnu līniju SH-SY5Y) un 1,1-dimetil-4,4'-bipiridīnija dihlorīda (parakvāta), 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridīna (MPTP), 1-metil-4-fenilpiridīna (MPP+) in vivo modeļos, un 6-hidroksidopamīnu (6-OHDA) [12].

Šeit izklāstītais pētījums koncentrējās uz dabisko fitohormonu klases, ko sauc parcitokinīni(HN) un to metabolīti, kas ir labi zināmi šūnu dalīšanās, augšanas, diferenciācijas un lapu senescences regulatori augos [13]. Strukturāli CK ir adenīna atvasinājumi, kas N6 stāvoklī tiek aizstāti ar prenilu (izopentenilu) vai aromātisko sānu ķēdi. Dabiskās formas ir 6-(E)-4-hidroksi-3-metil-, bet-2-enilaminopurīns (trans- zeatīns, tZ), tā 6-(Z)-izomērs (cis-zeatīns, cZ), N6-izopentenil-adenīns (iP), 6-benzilmamīna purīns (BAP), 6-furfurilaminopurīns (kinetīns, K) un BAP orto-, meta-un para-hidroksilētie vai metoksilētie atvasinājumi, ko sauc par topolīniem (oT, mT, pT, MeoT, MemT, MemT, MepT). Parasti sastopami arī dažādi šo formu 9-ribosīdi, 9-nukleotīdi, kā arī 7-, 9 un O-glikozīdi, kā parādīts 1. tabulā. Papildus to vietējām lomām augos, DEK ir parādījuši spēcīgu skudru oksidantu aktivitāti pret reaktīvām skābekļa sugām (ROS), kas nodrošina aizsardzību vairākos ar novecošanu saistītu traucējumu in vitro stresa modeļos [14].

Tabula Nr.1. Struktūrascitokinīniun pozitīvās kontroles aģentiem.

Jo īpaši tiek ziņots, ka NK ir citoprotektīva aktivitāte tādos modeļos kā H2O2 izraisīta cilvēka fibroblastu šūnu nāve [15] un D-galaktozes izraisīts glikoksidatīvs stress žurku astrocytes [16]. Vēl svarīgāk ir tas, ka šajā kontekstā viņi ir parādījuši, kaneiroprotektīvsietekme modeļos, kas saistīti ar neirodeģeneratīvām slimībām, piemēram, ģimenes PD, proteasomu inhibitoru MG 132 izraisītu vai H2O2 izraisītu toksicitāti SH-SY5Y šūnās [17], Glu izraisīti HT22 peles hipokampa oksidatīvie bojājumiNeironušūnas [18] un Hantingtona slimības PC12 šūnu modelis [19]. Citi pētījumi liecina, ka CK aizsardzības darbības ietver gan tiešu [20,21], gan netiešu [15,16,22] šūnu redoksu sistēmu modulāciju. Tiek ziņots, ka papildus CK raksturīgajai antioksidantu aktivitātei tiem ir regulējoša ietekme uz mitohondrijiem, kas uzlaboNeironudzīvotspēja [17]. Turklāt K var stabilizēt mitohondriju membrānas potenciālu un palielināt ATP ražošanu, tādējādi mazinot Glu izraisītu HT22 šūnu nāvi [18]. Tomēr, neskatoties uz konstatējumiem par to ietekmi vairākos modeļos, ir ierobežotas zināšanas par CK aizsargājošo aktivitāti visbiežāk sastopamajā (sporādiskajā) PD formā.

Lai novērstu iepriekš aprakstīto zināšanu trūkumu, mēs sistemātiski novērtējām dabisko KK un to metabolītu ietekmi divos in vitro modeļos: salsolinola (SAL) inducēts PD modelis un glutamāta (Glu) izraisīts oksidatīvo bojājumu modelisNeironu-piemēram, SH-SY5Y šūnas. Šī līnija tika izmantota tās dopamīnerģiskā fenotipa, jutīguma pret dopamīnerģiskajiem toksīniem, piemēram, SAL, un ērtas diferencētu populāciju veidošanās dēļ.Neironušūnas ar samazinātu proliferācijas ātrumu pēc 48 h iedarbības uz 10 uM all-trans-retinoic acid (ATRA) [23–25].

Neironu-līdzīgas šūnas tika pakļautas endo/eksotoksīna SAL iedarbībai, lai imitētu PD patoloģiju šūnu redoksu sistēmas disfunkcijas dēļ: glutationa (GSH) noārdīšanās un gan antioksidanta enzīma (Cu/Zn superoksīda dismutāzes un katalāzes) aktivitātes, gan mitohondriju kompleksu (I un II) inhibīcijas rezultātā, izraisot apoptozi un nekrozi [26]. Otrā modelī Glu izraisa potenciāli letālus oksidatīvos bojājumus, pārtraucot redoksu sys- tem. Abi SH-SY5Y šūnu līnijas modeļi iepriekš ir izmantoti neiroaizsardzības pētījumos [26,27].

Ir pārbaudītas citoprotektīvas un/vai antioksidantu aktivitātes, kas saistītas ar K, iP, BAP, iPR, tZR un to brīvo bāzu deģeneratīviem traucējumiem, un (kā izklāstīts iepriekš) ir konstatēts, ka dažiem CK ir aizsargājošas darbībasNeironuŠūnas. Tomēr neviens iepriekš publicēts pētījums nav pārbaudījis struktūru-neiroprotektīvsdabisko CB darbības attiecības (SAR) (1. tabula). Tāpēc šis pētījums tika veikts, lai pārbaudītuneiroprotektīvs(anti-parkinsona slimība) gandrīz visu zināmo dabiski sastopamo KP darbības izvēlētajos SAL un Glu inducētajos neirodeģenerācijas modeļos. Pirmkārt, mēs novērtējām katra KK skābekļa radikālās absorbcijas spēju (ORAC) un (drošības testos) citotoksicitāti pretNeironu-piemēram, SH-SY5Y šūnas. Pēc tam mēs novērtējām savienojumu neiroprotektīvo iedarbību un ietekmi uz oksidatīva stresa līmeni, mērot superoksīda (O2 .) ražošanu (dihy- droethidium, DHE tests) un apoptotisko kaspāzes-3,7 aktivitātes. Rezultāti sniedz pirmās ziņotās sistemātiskās norādes par attiecībām starp dabisko CK struktūrām unneiroprotektīvsDarbības.

Cistanche herbair ļoti labsneiroprotektīvsefekts

2. Rezultāti un diskusijas

2.1. Citokinīnu skābekļa radikāļu absorbcijas spēja (ORAC)

Tā kā neirodeģeneratīvās slimības ir saistītas ar paaugstinātu oksidatīvo stresu, antioksidantu aktivitātei ir galvenā loma aizsardzībā pretNeironuŠūnas. Lai novērtētu KP bioloģisko potenciālu šajā ziņā, antioksidantu spēju noteica ORAC, ko parasti izmanto, lai noteiktu vielu antioksidantu spēju [28]. Antioksidanta spēja tika izteikta kā Trolox ekvivalenti (TE), kas nosaka savienojumu efektivitāti (no zemākas līdz augstākai) nekā Trolox vienādos apstākļos. Rezultāti, kas parādīti 1. tabulā, liecina, ka topolīniem (oT, mT un pT) un to ribozīdiem (oTR, mTR, pTR) ir augsta antioksidantu aktivitāte, kas, iespējams, ir cieši saistīta ar to C6-hidroksi benzilmīna aizvietotāja elektronu bagāto sistēmu. Neskatoties uz augstajām ORAC vērtībām, topolins nebija augstsneiroprotektīvsaktivitāte. Tomēr vairāki heteroaromātiskie HN, tostarp K (N6-furfurilaminopurīns) un nearomātiskie cis-zeatīna-O-glikozīds (cZOG), kam ir 4-hidroksi-3-metilbut-2-en-1-il)amino substituents, arī uzrādīja augstu antioksidanta spēju (2. tabula). Citi CK metabolīti, tostarp kinetīna-3-glikozīds (K3G), kinetīna ribozīds 5<-monophosphate (kmp),="" kinetin-9-glucoside="" (k9g),="" and="" trans-zeatin=""><- monophosphate="" (tzmp)—had="" moderate="" antioxidant="" activity.="" all="" the="" others="" had="" detectable="" capacity="" except="" bap.="" these="" results="" confirm="" previous="" findings="" that="" ip,="" pt,="" k="" can="" act="" as="" direct="" radical="" scavengers,="" but="" conflict="" with="" the="" previously="" reported="" activity="" of="" bap="" in="" the="" orac="" test="" [20,21].="" to="" conclude,="" these="" compounds="" have="" potential="" in="" the="" treatment="" of="" neurodegenerative="" diseases="" associated="" with="" increased="" oxidative="" stress="">

cistanche stumbra priekšrocībaspar tematuanti-Alcheimera slimība

2.2. SH-SY5Y šūnu diferenciācija

Lai izpētītu CK"neiroprotektīvsietekme, SH-SY5Y neiroblastomas šūnas (izvēlētas jau aprakstītu iemeslu dēļ [23]) tika diferencētas pēc 10 uM ATRA iedarbības 48 stundas, kā aprakstīts iepriekš [23,24]. Pēc tam tie tika iekrāsoti, izmantojot membrānas krāsošanas komplektu, lai pārbaudītu morfoloģiskās atšķirības starp nediferencētām un diferencētām šūnām. Kā parādīts 1.A attēlā,Neironu-līdzīgas diferencētas šūnas auga mazāk blīvi, bija ilgstošākas un radīja vairāk neirītu (attēlā norādīts ar dzeltenām bultiņām) nekā nediferencētās šūnas. Šīs morfoloģiskās izmaiņas, kas saistītas ar diferenciāciju, iepriekš novērotas pat pēc īsākas iedarbības (24 h) ar ATRA [24,30]. Vēl svarīgāk ir tas, ka neirītu skaits dramatiski palielinās līdz līmenim, kad viņi var izveidot neirītu tīklu. Šī iemesla dēļ šūnu dzīvotspēja tika mērīta, lai salīdzinātu nediferencētu un diferencētu SH-SY5Y šūnu proliferācijas ātrumu. Nediferencētu SH-SY5Y dzīvotspēja tika uzskatīta par maksimālo izplatīšanās ātrumu. Rezultāti, kas ir

1.B attēlā redzams, ka SH-SY5Y proliferācijas ātrums (novērtēts ar Calcein AM dzīvotspējas testu) pēc 48 h ATRA terapijas samazinājās par 23%.

1. attēls. (A) Fluorescējoši mikrogrāfus no SH-SY5Y šūnām ar membrānām, kas iekrāsotas, izmantojot Neurite izauguma komplektu (Invitro- gen™): kontrole, nediferencētas šūnas (pakļautas izsmēķu apstrādes šķīdumam:<0.1% dmso);="" cells="" differentiated="" by="" exposure="" to="" 10="" um="" all-trans="" retinoic="" acid="" (atra)="" for="" 48="" h.="" bars="50" um.="" (b)="" proliferation="" rates="" of="" undifferentiated="" and="" differentiated="" sh-sy5y="" cells:="" numbers="" of="" viable="" cells="" after="" 48="" h="" exposure="" to=""><0.1% dmso="" and="" 10="" um="" atra,="" respectively.="" data="" were="" obtained="" from="" five="" independent="" experiments="" with="" triplicate="" cultures:="" asterisks="" show="" the="" significance="" of="" differences="" in="" numbers="" of="" viable="" cells="" (as="" percentages="" of="" numbers="" of="" undifferentiated="" cells)="" between="" the="" cultures:="" *="" p=""><>

Tabula Nr. 2. Testētā skābekļa radikāļu absorbcijas spēja (ORAC)citokinīni(CK), kas izteikts kā trolox ekvivalenti (TE) vienādmalu vielā. CK nosaukumi, saīsinājumi un struktūras ir parādītas 1. attēlā.

2.3. Citokinīnu citotoksicitāte pret neironiem līdzīgām SH-SY5Y šūnām

CK potenciālās citotoksicitātes testos ar Calcein AM dzīvotspējas testu [31] lielākā daļa uzrādīja zemu toksicitāti pretNeironu-piemēram, SH-SY5Y šūnas. Dzīvotspējas samazināšanos zem 90% uzskatīja par neirotoksiskās iedarbības slieksni. Vienīgie divi izņēmumi bija KR (11,9%) un pTR (10,5%), saskaņā ar iepriekšējiem konstatējumiem, ka dažicitokinīnsmetabolītiem, īpaši ribozīdiem, var būt citotoksiska iedarbība [32]. Citi ribozīdi, piemēram, cZR, iPR, oTR, mTR, neizraisīja acīmredzamuNeironu-piemēram, SH-SY5Y šūnu dzīvotspēja (3. tabula). DFO [33,34] un NEC-1 [35,36], ko izmantoja kā pozitīvu kontroli mūsu in vitro modelī, tika pierādīts arī citos pētījumos par SH-SY5Y šūnām kā netoksiskām. Visbeidzot, galvenokārt atvasinājumi KR un pTR uzrādīja zemāku dzīvotspēju nekā 90%, un tāpēc tos uzskatīja par mazāk interesantiem turpmākai novērtēšanai abos neirodeģenerācijas in vitro modeļos.

Tabula Nr. 3. Šūnu dzīvotspējaNeironu-piemēram, SH-SY5Y šūnas pēc iedarbības uzcitokinīni24 h. Dzīvotspēju izsaka procentos no DMSO kontroles.

2.4. Neiroprotektīvo citokinīnu identificēšana SAL inducētajā PD modelī

Attiecībā uz šiem testiem:NeironuSH-SY5Y šūnas tika diferencētas 48 stundas, pēc tam kopīgi apstrādātas ar 500 uM SAL un katru CK trīs koncentrācijās (0,1, 1, 10 uM). Kā parādīts punktētajā līnijā 2.A attēlā, neirotoksīna SAL lietošana pie 500 uM samazināja diferencēto SH-SY5Y šūnu dzīvotspēju saskaņā ar Calcein AM testu par 30%. N-acetilcisteīns (NAC) šajos testos tika izmantots kā pozitīva kontrole, jo tajā pašā SH-SY5Y šūnu in vitro modelī tika ziņots par tā iepriekš ziņoto neiroprotektīvo iedarbību [37]. 10, 100 un 1000 uM NAC koncentrācijas tika izmantotas, lai sal modelī izraisītu daļēju vai gandrīz pilnīgu atveseļošanos. NAC spēja palielināt šūnu dzīvotspēju pie 100 uM un 1 mM koncentrācijas, kas atbilst attiecīgi 83,39 ± 1,74% un 89,21 ± 2,89%. NAC aizsardzības aktivitāte pie 100 uM (ko 2.A attēlā norāda pārtrauktā līnija) tika izmantota kā potences slieksnis, lai izvēlētos CB turpmākiem testiem. Saskaņā ar šo iestatījumu bioloģiski nozīmīgās neiroaizsardzības aktivitātes ir novērotas ar K3G pie 10 uM (81,84 ± 2,36%), cZR pie 0,1 uM (81,14 ± 2,30%) un 1 uM (81,53 ± 2,24%) un iPR pie 1 uM (82,43 ± 2,51%). Tādējādi iPR un cZR bija efektīvi neiroprotektori zemākā mikro vai sub-mikromolārā koncentrācijā nekā NAC. Gadacitokinīnsskrīnings arī atklāja, ka daudzi citi metabolīti var mēreni palielināt sal iedarbībai pakļauto diferencēto SH-SY5Y šūnu dzīvotspēju. Tomēr dažiem pārbaudītiem VAC (ieskaitot tZR, tZMP, mT, mTR, pT un pTR) bija ļoti mazs aizsargājošs efekts.

2. attēls. Ā) priekšsēdētāja kungs, dāmas un kungi!Neiroprotektīvsdarbībacitokinīniun N-acetilcisteīns (NAC) SAL inducētā PD modelī uzNeironu-piemēram, SH-SY5Y šūnas. Pārtrauktā līnija parāda NAC efekta slieksni, pie kuracitokinīnitika izvēlēti turpmākai testēšanai; pēc tam punktētā līnija saskaita dzīvo šūnu skaitu Calcein AM testā pēc šūnu apstrādes ar 500 uM SAL; veselas kontroles šūnas (CTR, DMSO< 0.1%).="" triplicates="" in="" at="" least="" three="" separated="" days.="" (b)="" normalized="" sh-sy5y="" cell="" death="" after="" propidium="" iodide="" staining.="" triplicates="" in="" at="" least="" five="" independent="" days.="" *="" p="" compared="" with="" the="" vehicle="" with="" 500="" um="" sal,="" #="" p="" compared="" with="" the="" vehicle="" without="" 500="" um="">

Lai apstiprinātu, ka visaktīvākās dabiskās KK aktivitātes pret PD, kopējos šūnu mirstības rādītājus kvantificēja propīdija jodīda (PI) iekrāsošana, kas (atšķirībā no šūnu metabolismā balstītiem dzīvotspējas testiem) marķē tikai šūnas ar membrānas integritātes traucējumiem, mirstošām šūnām un jau atmirušām šūnām [38]. Rezultāti tika normalizēti attiecībā uz šūnu mirstības rādītāju pēc ārstēšanas tikai ar SAL (noteikts kā 100%). Kā parādīts 2.B attēlā, NAC pozitīvās kontroles viela ievērojami samazināja šūnu mirstības rādītājus gan pie 100, gan 1000 uM (attiecīgi līdz 77,3 ± 2,21% un 77,5 ± 4,44%). Kopumā NAC izrādījāsneiroprotektīvsierosinātājs ar aktivitāti, kas ir salīdzināma ar citos pētījumos reģistrētajām aktivitātēm no devas atkarīgā veidā (50–500 uM diapazonā) SH-SY5Y šūnām [37]. PI tests arī parādīja, ka CKs cZR, K3G un iPR ir aizsargājošas darbības, īpaši cZR, kas samazināja šūnu mirstības līmeni līdz 71,6 ± 5,08% pie 0,1 uM. Atšķirībā no cZR, K3G bija apvērsis no devas atkarīgu iedarbību, ar maksimālo aktivitāti pie 10 uM (samazinot šūnu mirstības ātrumu līdz 75,0 ± 3,69%), un NPR aktivitāte sasniedza maksimumu 1 uM (samazinot ātrumu līdz 73,9 ± 4,99%). Kopā ņemot, kā parādīts 2. attēlā, CD sniedza salīdzināmuneiroprotektīvsaktivitāte līdz 100 uM NAC gan saskaņā ar dzīvotspējas, gan citotoksicitātes testiem. Turklāt efektīvās CB, piemēram, cZR un iPR, koncentrācija bija daudz zemāka nekā NAC koncentrācija sub-mikromolārajos un mikromolārajos diapazonos. Iepriekšējie novērojumi, kas iegūti pēc dubultās krāsošanas ar PI un pielikumu V/PI, norāda, ka K var samazināt apoptozi [39], tāpēc mēs pētījām arī KK un NAC ietekmi uz oksidatīvo stresu un kaspāzes-3,7 aktivāciju (labi zināms apoptozes marķieris).

2.5. Citokinīni samazina SAL izraisītu superoksīda radikāļu veidošanos

Oksidatīvais stress (OS) ir galvenais patoloģiskais vairāku neirodeģeneratīvo slimību izraisītājs, un gan SAL (pie > 100 uM), gan tetrahidroizohinolīni ir spēcīgi OS induktori [26,40]. Tādējādi mēs arī izmērījām superoksīda (ROS un svarīga OS marķiera) veidošanos SAL klātbūtnē ar un bez izvēlētiem CK vai NAC. Lai nodrošinātu, ka SAL izraisīja pietiekamus OS bojājumus SH-SY5Y šūnās, lai noteiktu atbildes reakcijas, šūnas tika pakļautas 500 uM SAL iedarbībai 24 stundas, tāpat kā iepriekšējā darbā [37] un saskaņā ar iepriekš izklāstītajiem konstatējumiem. Pēc tam šūnas iekrāsoja ar dihidroetīdiju (DHE), lai noteiktu superoksīda radikālu veidošanos [41,42]. Kā redzams 3.A attēlā, šūnas tika vizuāli novērotas pēc marķēšanas ar DHE (kas nodrošina sarkanus fluorescences signālus pēc reakcijas ar superoksīdu). SAL izraisīja skaidru DHE fluorescences palielināšanos attiecībā pret līmeni kontroles un ar NAC apstrādātās šūnās. Turklāt trim CB (cZR, K3G un iPR) bija līdzīgi vizuālie efekti kā NAC (100 uM) uz DHE fluorescences. Turklāt spektrofotometriskā kvantificēšana attiecībā uz konstatētajiem līmeņiem šūnās, kas apstrādātas tikai ar SAL (noteikts kā 100%), atbilda mikroskopijas novērojumiem. Kā parādīts 3.B attēlā, normalizētais superoksīda līmenis veselās kontroles šūnās (CTR) bija mazāks par 39%, un pozitīvās kontroles viela NAC nodrošināja mērenu līdz pilnīgu SAL izraisītas ROS ražošanas samazinājumu pie 100 un 1000 uM (līdz 76,3 ± 4,33 un 44,3 ± 5,12%), kas liecina, ka glutationa (GSH) noārdīšanās ir galvenā loma modelī [26]. Interesanti, ka SAL izraisīja dramatisku SH-SY5Y šūnu GSH satura samazināšanos, ko pavadīja OS pacēlums, līdz līmenim, kas līdzīgs tam, kas iepriekš novērots pētījumā, kurā tika reģistrēta arī NAC mediēta ietekme uz šūnu dzīvotspēju, šūnu nāvi un glutationa saturu [43]. Šeit sniegtie rezultāti liecina, ka NAC arī samazināja superoksīdu radikāļu veidošanos līdz bazālajam līmenim (t.i., līmenim ar DMSO apstrādātās kontrolēs). CK ribosīdi tika pārbaudīti aktīvās koncentrācijās (0,1–1 uM) kopā ar K3G un ievērojami samazināja šūnu superoksīda radikālo saturu līdz šādiem līmeņiem (salīdzinot ar šūnām, kas ārstētas tikai ar SAL): cZR 80,34 ± 5,99% pie 0,1 uM; K3G 77.1 ± 4.89% pie 10 uM; iPR 79,2 ± 5,91% pie 1 uM, kas ir salīdzināms ar 100 uM NAC ietekmi. Kopumā ortogonālie demonstrējumi stingri norāda, ka spēcīgai anti-OS aktivitātei ir galvenā loma NAC un CK aizsargājošajā iedarbībā SAL izraisītajā PD modelī. Korelāciju starp OS meliorāciju un neiroaizsardzību ir atzīmējuši arī citi autori [29], un vairākos pētījumos ir konstatēts, ka K un BAP var tieši uzlabot OS aktivitātes [44], veidojot kompleksus ar Cu2+ joniem, kā rezultātā rodas superoksīda dismutāzei līdzīga aktivitāte [45,46]. Tomēr HN ir raksturoti arī kā netieši antioksidanti, kuru ietekme ir mediēta, inducējot kodolfaktoru eritroīdam 2-saistītajam faktoram (NRF2) antioksidantu atbildes reakcijas ceļu (iPR) [22] vai daļējai glutationa peroksidāzes un SOD aktivitātes atjaunošanai (K) [16]. Turklāt tiek ziņots, ka K irneiroprotektīvsdarbības pret H2O2 izraisītiem OS ievainojumiem SH-SY5Y šūnās [17]. Abu veidu ziņotā CK anti-ROS aktivitāte varētu potenciāli izskaidrot cZR, K3G un iPR ietekmi uz superoksīda radikāļu samazināšanos SAL izraisītajā SH-SY5Y šūnu PD modelī [47–50].

3. attēls. A) Mikrofotogrāfus, kas uzrāda SAL izraisītu oksidatīvo spriegumu un oksidatīvo stresu mazinošo darbībucitokinīnicilvēka diferencētajāNeironu-piemēram, SH-SY5Y šūnas, kas vizualizētas fluorescences mikroskopijā pēc dihidroetīdija (DHE) marķējuma. Stieņi = 50 um. Attēlos redzamas šūnas, kas apstrādātas ar DMSO šķīdumu (vadības ierīcēm), 500 uM salsolinolu (SAL) atsevišķi un 500 uM SAL un 1000 uM NAC (+NAC), 0,1 uM cZR (+cZR) kombinācijas; 10 uM K3G (+K3G), 1uM iPR (+iPR) 24 stundas pirms krāsošanas ar DHE. B) SAL izraisīta superoksīda radikāļu veidošanās uncitokinīnsvai N-acetilcisteīna (NAC) aizsargdarbība. Diagrammā parādīta DHE iekrāsoto šūnu kvantificēšana, izmantojot Infinite M200 Pro mikroplates lasītāju (Tecan, Austrija). Trīskāršojas vismaz piecās neatkarīgās dienās. * P, salīdzinot ar transportlīdzekli ar 500 uM SAL, # P, salīdzinot ar transportlīdzekli bez 500 uM SAL.