Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai skatītu 1. daļu

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai skatītu 3. daļu

Cistanche var uzlabot atmiņu

Ņemot vērā šos atklājumus, mēs pēc tam pārbaudījām, vai hippokampu miR-466f-3p ekspresija nav pārregulēta pelēm pēc telpiskās mācīšanās unatmiņaveidošanās ietekmēja arī neironu morfoloģiju in vivo. Zīmīgi, ka mēs atklājām, ka GLN peļu hipokampu neironu vidējais mugurkaula blīvums bija augstāks nekā PLN pelēm, kā atklājās piramīdas impregnēšana ar Golgi.

3. attēls. Hipokampu miR-466f-3p izteiksmes līmeņu izmaiņu ietekme uz peles MWM veiktspēju

(A) MWM uzdevuma eksperimentālais laika grafiks, ekspresijas analīze vai peles smadzeņu elektrofizioloģijas mērījumi pēc lentivīrusa injekcijas.

(B) Kreisie paneļi: dsRed izpausme peles hipokampā. Reprezentatīvi zema un liela palielinājuma IF attēli no pelēm, kas inficētas ar rekombinantiem lentivīrusiem, kas izsaka dsRed-only kā kontroli (attēlu kreisā kolonna) vai miR-466f-3p plus dsRed (pa labi) attēlu kolonna). Divu augšējo attēlu rūtiņu apgabali ir palielināti un parādīti zemāk. Mēroga stieņi, 100 mm. Punktētās līnijas norāda ģenerāldirektorāta robežas. Kodoli tika iekrāsoti ar DAPI. GCL, granulu šūnu slānis; ML, molekulārais slānis. Labā histogramma, miR-466f-3p relatīvie ekspresijas līmeņi peles hipokampā, kas inficēts ar lentivīrusu ekspresējošu kontroli vai miR-466f-3p, kā noteikts ar RT-qPCR ( n=16 vienai grupai).

(C) MWM veiktspēja pelēm, kas inficētas ar dažādiem rekombinantiem lentivīrusiem, izmantojot piecas dažādas plazmīdas, kas ekspresē dsRed-only, miR-466f-3p, mut-miR-466f{ {5}}p un miR/SCR sūkļi, attiecīgi, savā hipokampā (n=13, attiecīgi 26, 16, 19 un 11 katrā grupā). Kreisais panelis: aizbēgt no latentuma apmācības laikā. Labais panelis: individuāls aizbēgšanas latentums 6. sesijā.

Dati, kas parādīti (B), ir parādīti kā vidējais ± SD, un dati, kas parādīti (C), ir parādīti kā vidējais ± SEM. Statistiskā nozīme tika novērtēta ar nesapāroto t testu (B), divvirzienu ANOVA ar Bonferroni post hoc salīdzinājumu (C, kreisais panelis) vai vienu ANOVA ar Tukey post hoc testu (C, labais panelis). Statistiskās atšķirības: #p < 0.05,="" **/##p="">< 0.01="" un="" ****p="">< 0,0001;="" *mir-466f-3p="" salīdzinājumā="" ar="" citiem;="" #mir-sūklis="" pret="" vadības="">

neironi GLN un PLN peles hipokampā (S3 attēls). Šie atklājumi parāda, ka hipokampu miR-466f-3p regulēšana veicina neirīta izaugšanu un dendrīta mugurkaula veidošanos, kas ir līdzīga mugurkaula blīvuma indukcijai, kas novērota GLN peļu hipokampā salīdzinājumā ar PLN pelēm.

miR-466f-3p pozitīvi modulē peles telpisko mācīšanos unatmiņaveiktspēju, kā arī sinaptisko plastiskumu

Lai izpētītu, vai miR{0}}f-3p pozitīvi regulē peles telpisko mācīšanos unatmiņaveidojot, mēs izmantojām rekombinanto lentivīrusu infekcijas pieeju, lai pārmērīgi ekspresētu miRNS peles hipokampā. Peles tika analizētas 7 dienas pēc lentivīrusa injekcijas DG (3.A attēls). MiR-466f-3p gūžas ekspresijas līmeņu reprezentatīvie attēli patiešām bija paaugstināti miR-466f-3p pārmērīgas ekspresijas grupā, salīdzinot ar kontroles grupu (labā histogramma 3.B attēlā). Mēs atklājām, ka pelēm ar pārmērīgu miR-466f- 3p hipokampu ekspresiju un kurām tika veikts MWM uzdevums, aizbēgšanas latentums bija 88 ± 5 s 1. sesijā un 19 ± 1 s 6. sesijā (sarkans punktu līnija, 3.C attēls), kas bija labāki nekā vektora kontroles pelēm (melnā līnija) vai mutantu kontroles pelēm (sarkanā apļa līnija) un līdzīgas GLN peļu evakuācijas latentumiem, kas aprakstīti 1.A attēlā. Paralēli mēs pētījām miR-466f-3p funkciju zaudēšanas ietekmi uz telpisko mācīšanos unatmiņainhibējot miR-466f-3p, izmantojot miR-sūkli. Proti, MWM veiktspēja pelēm, kurās hipokampu miR-466f-3p bija iesprostots ar miR-sūkli, bija līdzīga PLN pelēm, ti, tās neiemācījās atrast platformu pat tad, pēdējā sesija (nepārtraukta zaļa kvadrātveida līnija,

3C attēls). Turklāt pelēm, kurām tika injicēts lentivīruss, nebija izjauktas homeostatiskā plastiskums, jo dažas peles katrā grupā bija mācījušās vai vismaz mācījās pēdējās sesijas laikā (3.C attēls, labā histogramma).

Ņemot vērā, ka miR{0}}f-3p pārmērīga ekspresija peles hipokampā uzlaboja viņu mācīšanos unatmiņaspēju, mēs analizējām kultivēto hipokampu neironu salīdzinošo elektrofizioloģiju, kas izsaka dažādus miR-466f-3p līmeņus. Miniatūra ierosinošā postsinaptiskā strāva (mEPSC) no DIV14 hipokampu neironiem, kas pārmērīgi ekspresē miR-466f-3p vai mut-miR-466f-3p, miR-sūkli vai kontroli bija ierakstīts, izmantojot visas šūnas plākstera skavas. Lai gan starp četrām paraugu kopām nebija būtisku atšķirību starp mEPSC amplitūdu, Tau pieaugumu vai samazināšanos Tau, to neironu mEPSC frekvence, kas pārmērīgi ekspresē miR-466f-3p, bija ievērojami augstāka nekā citas grupas (4.A attēls), norādot, ka pēc miR-466f- 3p pārmērīgas ekspresijas postsinaptiskie glutaminergiskie receptori tika aktivizēti spēcīgāk.

Pēc tam mēs izmērījām ilgtermiņa potenciāciju (LTP), lai tieši noteiktu miR-466f-3p lomu sinaptiskajā plastiskumā in vivo. Mēs injicējām peļu hipokampu ar rekombinanto lentivīrusu, kā aprakstīts 3. attēlā, un pēc tam inducēja LTPinhipokampu šķēles ar stingu stimulāciju (trīs augstfrekvences stimulācijas vilcieni [3xHFS]) Schaffer nodrošinājuma ceļā. Mēs noskaidrojām, ka mūsu protokols izraisīja LTP visās grupās, par ko liecina pastāvīgais lauka ierosinošā postsinaptiskā potenciāla (fEPSP) pieaugums cornu ammonis 1 (CA1) reģionā (4.B attēls, kreisais panelis). LTP bija spēcīgāka miR-466f-3p pārmērīgi ekspresējošās šķēlēs (188 procenti ± 2 procenti no sākotnējā līmeņa 40–50 minūtes pēc stimulācijas, vidējais ± SEM), salīdzinot ar mutantu (169 procenti ± 1 procents). no sākotnējā līmeņa), SCR-sūklis (173 procenti ± 3 procenti no sākotnējā līmeņa) un kontroles vīrusa inficētas šķēles (159 procenti ± 2 procenti no sākotnējā līmeņa), kā miR-466f-3p inhibīcija ar miR-sponge samazināja LTP (128 procenti ± 1 procenti no sākotnējā līmeņa) salīdzinājumā ar kontrolēm (4.B attēls, labais panelis). Mēs arī mērījām GLN un PLN grupu LTP pēc apmācības. Attiecīgie dati atklāja arī būtiskas fEPSP slīpuma atšķirības CA1 reģionā starp GLN un PLN grupām (4.C attēls). Tādējādi paaugstināts miR-466f-3p līmenis uzlabo LTP un sinaptisko plastiskumu, kas savukārt var veicināt mācīšanos unatmiņapeļu spējas. Kopā 2., 3. un 4. attēlā parādītie dati parāda, ka miR-466f-3p ir izšķiroša pozitīva loma telpiskajā izglītībā unatmiņaveidošanās, iespējams, uzlabojot mugurkaula veidošanos, LTP un sinaptiskās plastiskuma spēku.

Mef2a mRNS ir miR-466f-3p regulējošais mērķis

Mēs veicām bioinformātikas analīzi, lai identificētu potenciālās mērķa mRNS, ko regulē miR-466f-3p saistīšanās ar to 30 UTR. Starp kandidātiem, kurus mēs identificējām, bija Mef2a mRNS, kas kodē MEF2A. Interesanti, ka iepriekš tika konstatēts, ka MEF2A ekspresija pēc MWM apmācības ir pazemināta, un šī faktora pārmērīga ekspresija negatīvi ietekmēja peļu veiktspēju (Cole et al., 2012). Tāpēc mēs izmantojām luciferāzes reportiera testu, lai pārbaudītu, vai miR-466f-3p regulē Mef2a mRNS translāciju, saistoties ar tās 30 UTR. Mēs ievietojām savvaļas tipa vai mutantu Mef2a 30 UTR sekvences lejpus SV40-promotora vadītas luciferāzes cDNS (Luc), kā rezultātā tika iegūta reportiera plazmīda psiCHECK2-MEF2A 30 UTR vai psiCHECK{19}} mut-MEF2A 30 UTR (5.A attēls). Kā parādīts 5.B attēla kreisajā histogrammā, miR-466f-3p koekspresija mazināja Mef2a 30 UTR vadītās luciferāzes ekspresiju. Šķiet, ka šis efekts ir atkarīgs no mijiedarbības starp miR-466f-3p un Mef2a 30 UTR, jo tiek veikta vai nu paredzētās miR-466f-3p saistīšanās vietas mutācija. Mef2a 30 UTR (50-UGU-GUAU-30) vai miR-466f-3p (50-AUACACA-30) sākuma apgabals Mef2a 30 UTR atpazīšana atcēla miR-466f-3p inhibējošo ietekmi uz luciferāzes aktivitāti (5.B attēls, vidējā histogramma). Turklāt miR-sūkļa, bet ne CR sūkļa līdzekspresija arī likvidēja miR-466f-3p represīvo ietekmi uz luciferāzes aktivitāti (5.B attēls, labā histogramma). Proti, ne miR-466f-3p pārmērīga ekspresija, ne miR-sūklis nekādi neietekmēja Mef2a mRNS līmeni primārajos hipokampu neironos (5.C attēls), taču tie attiecīgi samazināja vai palielināja MEF2A proteīna līmenis (5.D attēls). Mēs arī atklājām, ka miR-466f-3p vai miR-sūkļa pārmērīga ekspresija attiecīgi pazemināja vai paaugstināja ar aktivitāti regulētā citoskeleta saistītā proteīna (Arc) mRNS līmeni primārajos hipokampu neironos (5.C attēls). , kas bija zināms pakārtotais mērķis, ko pozitīvi regulēja MEF2A (Flavell et al., 2006)

Mēs arī veicām fluorescences in situ hibridizāciju (FISH), lai noteiktu miR-466f-3p, un apvienojām to ar MEF2A IF marķējumu DIV14 primārajos hipokampu neironos bez ārstēšanas ar forskolīnu vai ar to. Ir zināms, ka forskolīns inducē ķīmisko LTP un aktivizē adenililciklāzi, tādējādi paaugstinot intracelulāro cAMP līmeni. Mēs novērojām MEF2A kodolkolokalizāciju ar miR-466f- 3p, kā parādīts reprezentatīvajos attēlos 5.E attēlā. Tomēr pēc forskolīna stimulācijas miR-466f-3p signāls palielinājās gan somā, gan dendritos, savukārt MEF2A signāls

kodols samazinājās, par ko liecina attiecīgi MEF2A un Fast Red signālu intensitātes izmaiņas atsevišķās neironu šūnās (attēls 5E). Rezumējot, dati 5A–5E attēlā norāda, ka miR-466f-3p negatīvi regulē MEF2A proteīna ekspresiju, saistoties ar Mef2a mRNS 30 UTR un attiecīgi nomācot tā translāciju.

Saskaņā ar iepriekš aprakstītajiem rezultātiem mēs atklājām, ka MEF2A proteīna hipokampu līmenis tika pazemināts GLN pelēm pēc MWM apmācības, bet ne PLN pelēm (attēls 5F). Turklāt MEF2A relatīvais līmenis atsevišķās GLN pelēs (punktos) un PLN pelēs (kvadrātiņās) bija apgriezti korelēts ar miR-466f-3p (R=0.60, 5G attēls). Tādējādi neviendabīgi telpiskās mācīšanās modeļi unatmiņaspējas modulē stohastisks hipokampu miR- 466f-3p pieaugums atsevišķām pelēm un sekojošais MEF2A samazinājums, stimulējot neironu aktivitāti.

Hipokampu CREB stohastiskā aktivizēšana un no tā izrietošā miR- 466-669 klastera transkripcijas regulēšana MWM apmācības laikā

Mēs pētījām mehānismus, ar kuriem R{0}}f-3p peles hipokampā var tikt stohastiski pārregulēts ar MWM uzdevumu. Ir trīs miRNS prekursori, kas kodē miR-466f-3p, un tie visi pieder pie grauzējiem specifiskā miR-466-669 klastera, kas atrodas tā saimniekgēna mSfmbt2 10. intronā (Inoue et al. ., 2017) (6.A attēls). Interesanti, ka atšķirībā no miR-466f-3p mSfmbt2 izteiksmes līmeņos starp GLN un PLN grupām nebija būtisku atšķirību (6.B attēls), kas liecina, ka miR-466-669 klasteris varētu kodēt atsevišķu transkriptu. tā vietā, lai būtu daļa no mSfmbt2 primārā atšifrējuma. Attiecīgi mēs izstrādājām vairākas primeru kopas, lai ar RT-qPCR identificētu iespējamo miR-466-669 klastera primāro transkriptu. Kā parādīts 6.A attēlā, garš PCR fragments (plus 282 līdz 2381) kopā ar virkni pārklājošu qPCR joslu, proti, A (plus 282 līdz 115), B (131 līdz 406), C (388 līdz 686), D ( 662 līdz 1 028), E ( 1 004 līdz 1 299), F ( 1 242 līdz 1 629), G ( 1 605 līdz 2 029) un H ( 2 005 līdz 2 381) varēja noteikt peles hipokampā, bet ne no 0 6 līdz 2, 3 daļa no 6 līdz 2 ) (dati nav parādīti). Šie dati apstiprina, ka klasteris miR{51}} kodēja garu transkriptu aptuveni 2388 bp augšpus pirmā miRNS prekursora (ti, pre-mir-466m, 6. attēlā apzīmēts ar plus 1). Jāatzīmē, ka līdzīgi kā mēs atradām miR-466f-3p, šī transkripta vidējais līmenis GLN peļu hipokampā bija augstāks nekā PLN pelēm (6. attēls). Tādējādi uzlabota mācīšanās unatmiņaGLN peļu iespējas ir saistītas ar miR-466-669 klastera transkripcijas aktivizēšanu.

Kodola CREB aktivizēšana ar fosforilēšanu MWM uzdevumu laikā vai citos mācību veidos ir būtisks solis, lai īstermiņa laiku pārvērstu par ilgtermiņa.atmiņa(Lisman et al., 2018; Rogerson et al., 2014). Tāpēc mēs pētījām, vai dažādie miR-466f-3p līmeņi atsevišķām pelēm, kurām tika veikts MWM uzdevums, varētu būt saistīti ar CREB aktivizācijas statusu. Lai izpētītu šo ideju, vispirms mēs pārbaudījām hipokampu CREB fosforilācijas līmeni atsevišķās pelēs. Kā parādīts 6.D attēlā, CREB aktivācija (fosforilējot pie atlikuma S-133) tika uzlabota GLN pelēm, salīdzinot ar PLN un HC pelēm. Mēs arī apstiprinājām, ka miR-466f-3p patiešām tika ekspresēts kopā ar pCREB neironos, veicot miRNS ISH kombinācijā ar pCREB un MAP2 IF krāsošanu primārajos hipokampu neironos (S2A attēls). Turklāt miR- 466-669 klastera primārie transkripta līmeņi bija pozitīvi korelēti ar pCREB GLN pelēm (R=0.52), savukārt PLN pelēm tas bija negatīvi korelēts ar pCREB (R=0). .71) (6.E attēls). Mēs pārbaudījām korelāciju starp cita aktīvā faktora, fosfo-ekstracelulārās signālu regulētās kināzes (pERK) līmeņiem un miR-466-669 klastera primārajiem transkripta līmeņiem. Mēs atklājām, ka abiem MWM apmācīto peļu veidiem bija pozitīva korelācija starp miR-466-669 klastera signālu un pERK (attiecīgi R=0.59 un 0.48; S4A attēls), un pERK/ nebija atšķirības. tERK izteiksme starp šīm divām grupām (S4B attēls). Lai vēl vairāk noskaidrotu CREB aktivizācijas ietekmi uz miR-466-669klastera transkripcijas regulēšanu,

miR-466f-3p, mēs izmantojām kāspecifisku CREBinhibitoru,666- 15 (Xie et al., 2015) indukcija kombinācijā ar DIV14 primāro hipokampu neironu ārstēšanu ar forskolīnu. Ir zināms, ka forskolīns aktivizē CREB fosforilāciju (Malhotra et al., 2015). Mēs atklājām, ka primāro hipokampu neironu pirmapstrāde ar 666-15 bloķēja forskolīna izraisītu CREB aktivāciju (6.F attēls) un samazināja miR-466f-3p un miR-466-669 klastera līmeni. atšifrējums (6G un 6H attēls). Vienlaikus, apstrādājot ar 666-15, tika samazināts arī zināmo pCREB mērķa gēnu nurr1 un homer1a mRNS līmenis (Bridi et al., 2017; Jensen et al., 2017) (6.H attēls). Kopumā 6. attēlā parādīts, ka CREB stohastiskā aktivizēšana inbredu peļu apakšpopulācijas hipokampā, kam tiek veikts MWM uzdevums, izraisa miR-466-669 klastera transkripciju un attiecīgi miR-466f{{{23. }}p, tādējādi uzlabojot viņu telpisko mācīšanos unatmiņaspēja labāk veikt uzdevumu.

DISKUSIJA

Mēs esam izpētījuši miRNS iespējamo lomu telpiskās mācīšanās dažādo spēju modulēšanā unatmiņastarp inbred C57BL/6J pelēm. Mēs iesakām, ka stohastiskā CREB aktivizēšana un no tā izrietošā hipokampu miR-466f-3p regulēšana nodrošina lielāku telpisko mācīšanos unatmiņamūsu testa peļu apakšgrupas spējas, iespējams, pateicoties miR-466f-3p, kas mediē Mef2a mRNS translācijas inhibīciju, kas kodēatmiņanegatīvs regulators MEF2A. Mūsu atklājumi sniedz scenāriju, kas parāda konkrētas miRNS funkcionālo un evolūcijas lomu izziņas regulēšanā, izmantojot CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A ass stohastisku indukciju ar vides stimuliem.

MWM uzdevums ir plaši izmantots, lai pārbaudītu dažādas telpiskās mācīšanās iespējas unatmiņagrauzējiem. Normālos apstākļos grauzēji izmanto distālās norādes, lai orientētos, ļaujot tiem iemācīties un iegaumēt uzdevumā slēptās platformas atrašanās vietu. Lielākajai daļai mūsu testa inbred C57BL/6J peļu (62 procenti) bija normāls aizbēgšanas latentuma modelis, platforma tika atrasta 30 s laikā pēc 3.-6 sesijas (1.A attēls, GLN). Turpretim peļu grupa (38 procenti) neieguva uzdevumu pat līdz 6. sesijai (PLN). Jo īpaši mēs esam veikuši pelēm arī divus citus atpazīšanas testus. Pirmais bija jaunu objektu atpazīšanas (NOR) tests, kas ir viens izmēģinājums, kura pamatā ir iedzimta izpēte bez pastiprināšanas vai stresa, lai motivētu uzvedību (Leger et al., 2013). Korelācija starp NOR un MWM uzdevumiem peles veiktspējas izteiksmē ir vāja (R {{1{{2{22}}}}}.13), kas ir līdzīga korelācijai starp NOR veiktspēju un hipokampu izteiksmes līmeņiem. no miR-466f-3p (R=0.01; dati nav parādīti). NOR tests arī neatklāja atšķirības diskriminācijas indeksā starp MWM GLN un PLN grupām (0,36 ± 0,25 pret 0,29 ± 0,18; S1B attēls). Otra telpiskā mācīšanās unatmiņa-atkarīgs mūsu izmantotais uzdevums ir Bārnsa labirints (BM), kas ir līdzīgs MWM. Tas ir balstīts uz pieņēmumu, ka grauzējiem, kas atrodas nepatīkamā vidē, vajadzētu uzzināt un atcerēties evakuācijas kastes atrašanās vietu, kas atrodas zem platformas virsmas. Kā parādīts S1C attēlā, mēs esam noskaidrojuši, ka peles veiktspēja BM zondes pētījumos arī pozitīvi korelē ar miR-466f-3p hipokampu ekspresijas līmeņiem. Tādējādi CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A ass indukcija hipokampā mācīšanās laikā unatmiņaveidošanās ir telpiski atkarīga no konteksta.